基于紅細(xì)胞磁化技術(shù)鹽水介質(zhì)交叉配血方法的建立及應(yīng)用研究 ??

劉建峰 黃丹 秦超 陳鈺溪 王書(shū)華 張立川

【摘要】 目的：利用紅細(xì)胞磁化技術(shù)（erythrocyte-magnetized technology，EMT）建立一種鹽水介質(zhì)交叉配血方法，實(shí)現(xiàn)鹽水介質(zhì)交叉配血的自動(dòng)化檢測(cè)。方法：通過(guò)柯利斯全自動(dòng)血型分析儀（QWALYS 3）平臺(tái)，建立基于紅細(xì)胞磁化技術(shù)鹽水介質(zhì)交叉配血方法，并對(duì)500例臨床患者樣本，采用EMT鹽水介質(zhì)法與傳統(tǒng)手工鹽水介質(zhì)法進(jìn)行交叉配血平行檢測(cè)，分析兩種方法的檢測(cè)結(jié)果是否存在差異。結(jié)果：EMT鹽水介質(zhì)法和傳統(tǒng)手工鹽水介質(zhì)法，分別檢測(cè)出11例（2.2%）和10例（2.0%）交叉配血不相合結(jié)果，一致性檢驗(yàn)Kappa=0.951，可以認(rèn)為兩種方法的檢測(cè)結(jié)果高度一致。結(jié)論：在交叉配血試驗(yàn)中，基于EMT鹽水介質(zhì)法可以替代手工鹽水介質(zhì)法，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確和可追溯等優(yōu)點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 紅細(xì)胞磁化技術(shù) 鹽水介質(zhì) 交叉配血試驗(yàn) 全自動(dòng)血型分析儀 輸血安全

[Abstract] Objective： To use erythrocyte-magnetized technology （EMT） established a method of saline medium cross match blood to realize automatic detection of saline medium cross match blood. Method： Through the QWALYS automatic blood type analyzer platform （QWALYS 3）， a method of saline medium cross match blood based on erythrocyte-magnetized technology was established. In addition， the EMT saline medium method and traditional manual saline medium method were used to conduct parallel blood matching for 500 clinical patients， and analyze whether there were differences in detection results of the two methods. Result： The results of 11 cases （2.2%） and 10 cases （2.0%） of cross matching were detected through the EMT saline medium and traditional manual saline medium method， consistency check Kappa=0.951. It can be considered that the detection results of the two methods were highly consistent. Conclusion： In the cross-matching test， EMT-based saline medium method can replace manual saline medium method， which has the advantages of simple operation， accurate results and traceability.

Landsteiner于1900年發(fā)現(xiàn)了人類(lèi)的ABO血型，Ottenberg在1908年報(bào)道了輸血前血型鑒定和交叉配血的重要性，這是人類(lèi)現(xiàn)代輸血醫(yī)學(xué)發(fā)展史上的里程碑，也是人類(lèi)安全輸血的開(kāi)始。作為輸血治療前的必檢項(xiàng)目，準(zhǔn)確的交叉配血試驗(yàn)（cross matching test，CMT）是確保臨床輸血安全的重要手段[1]。目前，國(guó)內(nèi)外常用的交叉配血試驗(yàn)包括鹽水介質(zhì)法、凝聚胺法、微柱凝集法、固相捕獲法及抗人球蛋白法。本研究通過(guò)柯利斯全自動(dòng)血型分析儀（QWALYS 3）平臺(tái)，利用紅細(xì)胞磁化技術(shù)（erythrocyte-magnetized technology，EMT），建立一種基于EMT的鹽水介質(zhì)交叉配血方法，具有自動(dòng)化檢測(cè)、結(jié)果準(zhǔn)確及可追溯等特點(diǎn)，代替了手工鹽水介質(zhì)法，提高了工作效率，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本組500例樣本，均為新鮮采集的EDTA抗凝靜脈血，取自2018年7月-2019年6月筆者所在醫(yī)院輸血科接收申請(qǐng)輸血的患者，其中男201例，女299例，年齡6～85歲，平均（56.3±4.6）歲;有輸血史和/或妊娠史的患者496例，無(wú)輸血史、妊娠史4例。

1.2 儀器與試劑

（1）柯利斯全自動(dòng)血型分析儀（QWALYS 3）、磁化液（MagneLys）、深孔稀釋板、空白微孔板，北京萬(wàn)泰生物藥業(yè)股份有限公司提供;（2）血庫(kù)專(zhuān)用離心機(jī)（Baso 2005-2）、顯微鏡（OLYMPUS）、潔凈小試管（10 mm×75 mm）、生理鹽水。

1.3 方法

對(duì)所收集的500例樣本，采用EMT鹽水介質(zhì)法和手工鹽水介質(zhì)法同時(shí)進(jìn)行交叉配血試驗(yàn)。

1.3.1 EMT鹽水介質(zhì)法 （1）儀器XM項(xiàng)目編程，預(yù)稀釋?zhuān)?50 μl生理鹽水+6 μl壓積紅細(xì)胞+144 μl磁化液）→加樣（主側(cè)25 μl受血者血漿+25 μl獻(xiàn)血者1%的紅細(xì)胞懸液，次側(cè)25 μl獻(xiàn)血者血漿+25 μl受血者1%的紅細(xì)胞懸液）→混勻→磁化（5 min）→震蕩→讀數(shù);（2）檢測(cè)步驟，采集患者樣本儲(chǔ)存于2 ℃～8 ℃保存，應(yīng)于72 h內(nèi)完成檢測(cè)，EDTA抗凝樣本以2 500 g離心5 min，去管蓋后裝載到樣本架，直接放置于柯利斯全自動(dòng)血型分析儀（QWALYS 3），選擇XM（鹽水介質(zhì)交叉配血試驗(yàn)）應(yīng)用程序，儀器自動(dòng)完成后續(xù)檢測(cè)。

1.3.2 手工鹽水介質(zhì)法 （1）取供、受血者的紅細(xì)胞，用生理鹽水（必要時(shí)，生理鹽水洗滌1～3次）配制成2%～5%紅細(xì)胞懸液;（2）取潔凈試管2支，標(biāo)記主側(cè)和次側(cè);（3）主側(cè)加入2滴受血者血清（或血漿）和1滴獻(xiàn)血者2%～5%的紅細(xì)胞懸液;（4）次側(cè)加入2滴獻(xiàn)血者血漿和1滴受血者2%～5%的紅細(xì)胞懸液;（5）混勻，以1 000 g離心15 s;（6）輕輕搖動(dòng)試管，觀察結(jié)果;（7）疑為弱凝集反應(yīng)時(shí)，取潔凈玻片1張，用一次性塑料滴管從疑似弱凝集反應(yīng)管內(nèi)吸取1滴紅細(xì)胞混懸液，滴放在玻片上并涂成薄片，在顯微鏡下觀察，記錄結(jié)果[2]。

1.4 圖像評(píng)分

儀器通過(guò)自動(dòng)化計(jì)算，結(jié)合算法分析微孔板每個(gè)孔的圖片，并發(fā)送回一個(gè)0～99的整數(shù)得分，稱(chēng)之為圖像評(píng)分。該評(píng)分綜合反映了圖像的對(duì)比度、顆粒的形狀及大小等因素，并根據(jù)閾值按反應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)級(jí)分類(lèi)。EMT鹽水介質(zhì)法檢驗(yàn)結(jié)果解釋?zhuān)绻闯霈F(xiàn)凝集，紅細(xì)胞呈均一懸液，則判定結(jié)果為陰性;如果出現(xiàn)凝集，可見(jiàn)紅細(xì)胞形成1個(gè)或多個(gè)凝塊，則判定結(jié)果為陽(yáng)性。凝集強(qiáng)度判讀標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)圖1。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包，對(duì)兩種方法檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行一致性檢驗(yàn)（Kappa檢驗(yàn)），評(píng)價(jià)其一致性，取得相當(dāng)滿意一致程度的判斷標(biāo)準(zhǔn)為Kappa≥0.75。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法檢測(cè)結(jié)果

EMT鹽水介質(zhì)法和傳統(tǒng)手工鹽水介質(zhì)法，分別檢測(cè)出11例（2.2%）和10例（2.0%）交叉配血不相合結(jié)果，一致性檢驗(yàn)Kappa=0.951，可以認(rèn)為兩種方法的檢測(cè)結(jié)果高度一致，見(jiàn)表1。

2.2 交叉配血不相合原因

（1）兩種方法檢測(cè)結(jié)果均不相合共10例，其中主側(cè)不相合5例（由IgM抗體引起，包括抗-A1 2例、抗-M 2例和抗-Lea 1例），次側(cè)不相合2例（由臨床輸注擴(kuò)容及止血藥物引起），主次側(cè)皆不相合3例（均由冷凝集素抗-I導(dǎo)致）。（2）EMT鹽水法不相合，而手工鹽水法相合1例，為主側(cè)不相合（由多發(fā)性骨髓瘤患者血漿蛋白引起的緡錢(qián)狀凝集導(dǎo)致）。

3 討論

近年來(lái)，全自動(dòng)血型儀在各大醫(yī)院輸血科和各級(jí)采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)用越來(lái)越廣泛，在血型鑒定試驗(yàn)、不規(guī)則抗體篩查試驗(yàn)及臨床交叉配血試驗(yàn)中發(fā)揮作用。紅細(xì)胞磁化技術(shù)，是一個(gè)基于血液紅細(xì)胞磁化的新技術(shù)，這種技術(shù)已成熟應(yīng)用于免疫診斷、細(xì)胞分離、核酸提取及蛋白質(zhì)純化等領(lǐng)域[3]，極大促進(jìn)了實(shí)驗(yàn)室的自動(dòng)化。本實(shí)驗(yàn)利用柯利斯全自動(dòng)血型分析儀（QWALYS 3）為平臺(tái)，該儀器以紅細(xì)胞磁化技術(shù)原理為基礎(chǔ)，EMT的核心是紅細(xì)胞膜吸附順勢(shì)磁性化合物（納米磁珠），該物質(zhì)只在外磁場(chǎng)的作用下具有磁力，納米磁珠的使用使得抗原和抗體可以在簡(jiǎn)單磁力的作用下快速移動(dòng)，從而使用磁力代替離心力，減少了離心加速和減速等過(guò)程中溶血的發(fā)生概率，有效避免離心過(guò)程對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成的影響，提高了實(shí)驗(yàn)的可靠性，也可節(jié)省離心機(jī)校準(zhǔn)維護(hù)等費(fèi)用[4]，為臨床提供了一種全新的檢測(cè)方法[5]。

本研究所建立的EMT鹽水介質(zhì)法，是在傳統(tǒng)的手工鹽水配血法的基礎(chǔ)上，引入了磁化液的使用，在QWALYS 3平臺(tái)進(jìn)行全自動(dòng)檢測(cè)。紅細(xì)胞表面為負(fù)電荷，磁化液中的納米磁珠為正電荷，可以瞬間磁化紅細(xì)胞，通過(guò)靜電引力吸附于紅細(xì)胞膜上。磁化后的紅細(xì)胞膜表面抗原不受納米磁珠的影響，當(dāng)反應(yīng)體系中存在與之特異性識(shí)別的抗體時(shí)，會(huì)形成抗原抗體的凝集。置于磁板之上，最終在外界磁場(chǎng)環(huán)境中，磁化的紅細(xì)胞會(huì)被迅速牽引到微孔板的底部。最后一步通過(guò)震蕩后，根據(jù)凝集程度判讀結(jié)果，顯示出陽(yáng)性或陰性結(jié)果。本組500例血液樣本檢測(cè)顯示，EMT鹽水介質(zhì)法和傳統(tǒng)手工鹽水介質(zhì)法，分別檢測(cè)出11例（2.2%）和10例（2.0%）交叉配血不相合結(jié)果，一致性檢驗(yàn)Kappa=0.951，兩種方法的檢測(cè)結(jié)果高度一致，可以認(rèn)為兩種方法沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，EMT鹽水介質(zhì)法可以替代傳統(tǒng)手工鹽水介質(zhì)法，在交叉配血試驗(yàn)中具備臨床應(yīng)用價(jià)值。

交叉配血試驗(yàn)也稱(chēng)配合性試驗(yàn)，其目的是檢測(cè)受血者、獻(xiàn)血者血液之間是否存在不配合的抗原、抗體成分，選擇的技術(shù)方法應(yīng)盡可能多地檢測(cè)出具有臨床意義的抗體，包括不配合的IgM抗體和IgG抗體，最大限度地減少抗體的漏檢，防止溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生。傳統(tǒng)的鹽水配血法簡(jiǎn)便快速，但只能檢出不相配合的IgM類(lèi)血型抗體，包括一些不具有臨床意義的抗體，如冷凝集素抗-I及抗-IH等，一般不能檢測(cè)出IgG類(lèi)血型抗體。因此，除完全排除獻(xiàn)血者、受血者血清IgG類(lèi)不規(guī)則抗體存在的情況下，不能單獨(dú)使用鹽水介質(zhì)進(jìn)行交叉配血，以防止IgG類(lèi)不規(guī)則抗體漏檢。凝聚胺法操作簡(jiǎn)單，但對(duì)Kell血型系統(tǒng)的抗體（抗K）敏感性低，容易發(fā)生漏檢。酶法會(huì)導(dǎo)致某些抗原抗體反應(yīng)性減弱或消失，如M、N、Fya、Fyb、Xga、JMH、Ch等抗原，故現(xiàn)已不常規(guī)用于交叉配血試驗(yàn)。試管抗人球蛋白法雖能檢出IgG類(lèi)抗體，但操作步驟繁瑣、耗時(shí)，易耽誤危重患者的搶救工作[6]。目前，國(guó)內(nèi)應(yīng)用較多的微柱凝集卡的方法，相對(duì)于傳統(tǒng)檢測(cè)方法在操作簡(jiǎn)便程度，以及靈敏度方面都有較大的提升。但是，應(yīng)用到交叉配血試驗(yàn)中仍存在一定的問(wèn)題，患者血清蛋白異?；蛭⒅ㄗ陨淼膯?wèn)題，會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性的結(jié)果出現(xiàn)，這種假凝集現(xiàn)象會(huì)造成臨床配血困難，延誤危急重癥患者的搶救時(shí)機(jī)[7-8]。保證輸血安全是輸血科進(jìn)行血液管理的核心職能，隨著臨床輸血相關(guān)研究的深入開(kāi)展，更多的專(zhuān)家學(xué)者認(rèn)為，為了保證輸血安全，輸血科應(yīng)該聯(lián)合應(yīng)用多種方法與技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，尤其是要保留傳統(tǒng)的鹽水介質(zhì)配血法，并針對(duì)具體情況制定多種不同方法的檢測(cè)策略[9-11]。

本項(xiàng)研究利用EMT，建立一種自動(dòng)化的鹽水介質(zhì)配血法，符合國(guó)內(nèi)臨床輸血的發(fā)展趨勢(shì)。筆者認(rèn)為鹽水介質(zhì)配血法依然具有應(yīng)用價(jià)值：（1）與其他配血技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用，在疑難配血中發(fā)揮作用。（2）2019年6月15日啟動(dòng)的北京市醫(yī)耗聯(lián)動(dòng)綜合改革，保留了生理鹽水介質(zhì)交叉配血方法（項(xiàng)目編碼：CAMW1000，收費(fèi)4元/次），對(duì)于降低醫(yī)療費(fèi)用有著積極的作用。（3）臨床血液供應(yīng)長(zhǎng)期處于“緊平衡”狀態(tài)，自體輸血是緩解血液緊張的一種重要手段，對(duì)于儲(chǔ)存式自體輸血，鹽水介質(zhì)配血試驗(yàn)可以用于自體輸血前的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。（4）電子交叉配血（electronic cross match，ECM）在香港地區(qū)和國(guó)外已經(jīng)應(yīng)用多年[12]。相關(guān)技術(shù)十分成熟，國(guó)內(nèi)也有大量研究與實(shí)踐[13-14]。鹽水介質(zhì)配血法在電子交叉配血實(shí)施過(guò)程中，將在切換的并行過(guò)渡階段發(fā)揮作用。（5）某些IgM類(lèi)抗體在室溫或更低溫度時(shí)才表現(xiàn)出活性，通常被認(rèn)為不具備臨床意義，但隨著低溫麻醉技術(shù)的開(kāi)展，此類(lèi)IgM抗體的檢出或?qū)⒕哂信R床意義。

綜上所述，EMT鹽水介質(zhì)法可以替代傳統(tǒng)手工鹽水介質(zhì)法，鹽水介質(zhì)交叉配血法在輸血相容性檢測(cè)中必不可少[15]，根據(jù)實(shí)際情況制定相關(guān)的輸血檢測(cè)策略，聯(lián)合應(yīng)用多種檢測(cè)技術(shù)和方法，可以提高抗體的檢出率，減少輸血不良反應(yīng)的發(fā)生，保證臨床患者輸血安全，對(duì)改善患者預(yù)后和生存質(zhì)量、降低治療費(fèi)用等均有重要意義。

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（收稿日期：2019-10-18） （本文編輯：何玉勤）