4-羥基他莫昔芬通過抑制DNMT1/DNMT3A表達(dá)逆轉(zhuǎn)三陰性乳腺癌細(xì)胞間質(zhì)表型

王一丁，汪 茜

乳腺癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢，隨著治療手段的不斷進(jìn)步，乳腺癌患者生存期逐漸延長。然而三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)在各組亞群中呈間質(zhì)樣表型，較激素受體(hormone receptor，HR)陽性乳腺癌具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，而侵襲轉(zhuǎn)移是影響晚期乳腺癌患者生存的主要因素[1]。因此，改變TNBC的間質(zhì)表型成為延長TNBC患者生存期的重要途徑。越來越多的學(xué)者認(rèn)為上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)在乳腺癌的發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[2-4]，而找到EMT的調(diào)控機(jī)制并且逆轉(zhuǎn)這一過程，成為近年來乳腺癌的研究熱點(diǎn)。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen receptor,ER)拮抗劑4-羥基他莫昔芬(4-Hydroxytamoxifen，4-OHT)在TNBC中具有逆轉(zhuǎn)EMT的作用，能夠提高TNBC的藥物敏感性。

隨著EMT機(jī)制的深入研究及上游調(diào)控通路的深入挖掘，微小RNA(microRNAs，miRNA)逐漸成為上游調(diào)控EMT的研究熱點(diǎn)[5-6]。早期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-200家族(miR-200s)能夠在EMT的過程中受到明顯抑制，提示miR-200s是抑制EMT的主要調(diào)節(jié)因子；miR-200c是miR-200s中的重要成員，在ER狀態(tài)不同的乳腺癌細(xì)胞表達(dá)中具有顯著差異[7]。很多研究報(bào)道恢復(fù)miR-200c的表達(dá)能夠維持細(xì)胞的上皮表型，抑制間質(zhì)表型調(diào)控EMT[8]。

MiRNA的序列是呈高度保守性的，然而表觀遺傳學(xué)的因素能夠在不改變基因序列的前提下對(duì)其進(jìn)行表觀修飾，影響miRNA靶基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)[9]。甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容，能夠調(diào)控基因的表達(dá)、對(duì)蛋白質(zhì)及核酸進(jìn)行修飾[10]。甲基化的過程需要甲基化轉(zhuǎn)移酶催化完成。一項(xiàng)在結(jié)直腸癌細(xì)胞中進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，干擾甲基化轉(zhuǎn)移酶表達(dá)，能夠使10%的miRNA表達(dá)受到影響，證實(shí)DNA甲基化是調(diào)控miRNA的重要機(jī)制之一[11]。而對(duì)于miR-200c啟動(dòng)子特異位點(diǎn)的甲基化，也逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究認(rèn)為，在誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生EMT的過程中，miR-200c啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，部分功能受到抑制，導(dǎo)致原癌基因C-myb及zeb1的表達(dá)升高[12]。本研究旨在探討4-OHT通過抑制DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)1和DNMT3A表達(dá)逆轉(zhuǎn)TNBC細(xì)胞的EMT作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑 RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；4-OHT購于美國Sigma公司；胎牛血清購于天津血液病研究所；ER-α，PR，人表皮生長因子受體-2(human epidermal growth factor receptor-2,HER-2)，Vimentin抗體購于美國Cell Signalling Technology公司；DNMT1、DNMT3A、Actin等其他抗體購于美國Santa Cruz公司；羊抗鼠和羊抗兔辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；ECL試劑盒購于PIERCE公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 選擇乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、具有上皮樣表型的HR陽性乳腺癌細(xì)胞MCF-7和經(jīng)阿霉素長期培養(yǎng)的阿霉素耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR，檢測ER、PR及HER-2表達(dá)，明確3種細(xì)胞系分型。乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231生長于含有10%滅活胎牛血清、12 U/mL慶大霉素的L15培養(yǎng)液中；MCF-7細(xì)胞生長于含有10%滅活胎牛血清、12 U/mL慶大霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中；MCF-7/ADR細(xì)胞生長于含有10%滅活胎牛血清、12 U/mL慶大霉素、1 μmol/L阿霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，維持阿霉素耐藥性，均于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.25%胰酶消化液消化傳代，2～3 d傳代1次。所有實(shí)驗(yàn)均采用對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞。

1.2.2 Western Blot 檢測蛋白水平 分別收集3種細(xì)胞系細(xì)胞1×107個(gè)，將其裂解于200 μL含有蛋白酶抑制劑(100 μg/mL PMSF，2 μg/mL Aprotitin)的RIPA裂解液中[0.1%SDS，1% Trito-100，150 mmol/L NaCl，1 mmol/L EDTA(pH=8.0)，10 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)]，4 ℃裂解40 min，13 000 r/min離心取上清，蛋白定量。與3×樣品緩沖液混合后，煮沸5 min。將樣品(30 μg/道)在10%的SDS-聚丙烯凝膠中進(jìn)行電泳3 h，然后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上(電壓：2 mV/cm2；時(shí)間：120 min)。用5%脫脂牛奶封閉1 h后，按預(yù)染Marker標(biāo)記的分子量剪裁轉(zhuǎn)印膜，分別加入兔抗人ER-α抗體(1∶1 000)、PR抗體(1∶1 000)、HER-2抗體(1∶1 000)、Vimentin抗體(1∶1 000)、DNMT1抗體(1∶1 000)、DNMT3A抗體(1∶1 000)和β-actin抗體(1∶1 000) 4 ℃過夜。TTBS洗4次后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠(1∶800)或羊抗兔二抗(1∶800)室溫作用30 min，ECL法顯色，GIS凝膠圖像分析系統(tǒng)照相并分析處理。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測miR-200c相對(duì)表達(dá)量 細(xì)胞總RNA的提取:收集各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，按TRIzol試劑盒說明提取RNA,Nanodrop鑒定RNA質(zhì)量并在260/280 nm測其濃度。RNA逆轉(zhuǎn)錄過程采用One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit(Takara,Japan)法；miRNA的相對(duì)表達(dá)量采用comparative cycle threshold(Ct)法；U6 small nuclear RNA為內(nèi)參；miR-200c特異性引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTAATACTGCCGGGTAA-3′；U6引物序列：正向5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′；反向5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；試劑盒中包含Uni-miR qPCR引物；采用SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ (Perfect Real Time) (Takara,Japan)檢測miRNA相對(duì)表達(dá)量；PCR條件為：95 ℃，25 s，95 ℃，5 s，58 ℃，34 s，共45個(gè)循環(huán)；采用threshold cycle和2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 4-OHT作用于乳腺癌細(xì)胞 前期研究及大量文獻(xiàn)證實(shí)miR-200c在EMT中的重要調(diào)控作用。將3種乳腺癌細(xì)胞MCF-7、MCF-7/ADR和MDA-MB-231鋪板過夜，應(yīng)用5 μmol/L的4-OHT作用(實(shí)驗(yàn)組)MDA-MB-231、MCF-7/ADR和MCF-7細(xì)胞2 d后，應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測miR-200c的表達(dá)，將未應(yīng)用4-OHT作用(對(duì)照組)MDA-MB-231、MCF-7/ADR和MCF-7細(xì)胞的miR-200c表達(dá)量作為100%，分析實(shí)驗(yàn)組在藥物作用后miR-200c表達(dá)的相對(duì)變化。

1.2.5 CpG島預(yù)測 通過MethPrimer在線引物設(shè)計(jì)工具頁面:http://www.urogene.org/methprimer[13]，輸入miRNA啟動(dòng)子的序列，得到CpG島預(yù)測結(jié)果。

1.2.6 4-OHT作用于MCF-7/ADR細(xì)胞影響DNMTs表達(dá) 4-OHT作用于MCF-7/ADR細(xì)胞3 d，檢測DNMT1和DNMT3A蛋白表達(dá)情況；應(yīng)用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染干擾RNA表達(dá)，單獨(dú)及聯(lián)合敲除DNMT1、DNMT3A后應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測miR-200c表達(dá)變化；應(yīng)用4-OHT作用于聯(lián)合敲除DNMT1、DNMT3A的MCF-7/ADR細(xì)胞后，Western Blot方法檢測EMT相關(guān)間質(zhì)表型標(biāo)記物Vimentin的變化。

2 結(jié)果

2.1 3種乳腺癌細(xì)胞中激素狀態(tài)/HER-2表型及miR-200c表達(dá)情況 如圖1A所示，MCF-7為HR受體陽性，HER-2陰性乳腺癌細(xì)胞；而經(jīng)過阿霉素長期培養(yǎng)的MCF-7/ADR細(xì)胞株的HR受體轉(zhuǎn)為陰性，ER-α、PR及HER-2表達(dá)呈三陰性；MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞激素受體狀態(tài)同MCF-7/ADR。應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測3種細(xì)胞中miR-200c的表達(dá)，具有間質(zhì)樣表型的TNBC細(xì)胞MCF-7/ADR、MDA-MB-231細(xì)胞中miR-200c表達(dá)顯著低于HR受體陽性的MCF-7細(xì)胞(圖1B)。

2.2 4-OHT作用于乳腺癌細(xì)胞其miR-200c相對(duì)表達(dá)變化 MDA-MB-231和MCF-7/ADR細(xì)胞在4-OHT作用后miR-200c表達(dá)分別升高(21.6±8.56)倍和(6.98±2.15)倍，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MCF-7細(xì)胞在4-OHT作用前后miR-200c表達(dá)差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。圖2。

圖1 3種乳腺癌細(xì)胞中激素狀態(tài)/HER-2表型及miR-200c表達(dá)情況

圖2 4-OHT作用于乳腺癌細(xì)胞其miR-200c相對(duì)表達(dá)變化

2.3 CpG島預(yù)測軟件分析miR-200c基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài) 利用CpG Island預(yù)測軟件分析miR-200c基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，藍(lán)色區(qū)域表示CpG島富集區(qū)。經(jīng)軟件預(yù)測在miR-200c基因序列之前富含有CpG島。圖3。

圖3 miR-200c啟動(dòng)子區(qū)CpG島分布圖

2.4 應(yīng)用4-OHT作用于MCF-7/ADR細(xì)胞DNMT1和DNMT3A表達(dá)情況 應(yīng)用4-OHT作用于MCF-7/ADR細(xì)胞3 d，檢測DNMT1和DNMT3A蛋白表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)在4-OHT作用下DNMT1和DNMT3A表達(dá)均有下調(diào)(圖4A)；進(jìn)一步在MCF-7/ADR細(xì)胞中敲除DNMT1或DNMT3A的表達(dá)并進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-200c表達(dá)差異比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而同時(shí)敲除DNMT1和DNMT3A的表達(dá)，miR-200c表達(dá)上調(diào)(1.87±0.12)倍，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4B，4C)。敲除DNMT1和DNMT3A的表達(dá)后檢測EMT指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)同時(shí)敲除DNMT1和DNMT3A后Vimentin表達(dá)下調(diào)，類似于4-OHT的作用，而在此基礎(chǔ)上應(yīng)用4-OHT能夠更顯著的逆轉(zhuǎn)EMT(圖4D)。

圖4 4-OHT作用于MCF-7/ADR細(xì)胞影響DNMTs表達(dá)

3 討論

TNBC具有更強(qiáng)的侵襲轉(zhuǎn)移能力，很快發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥，目前的治療仍缺乏有效的靶向及內(nèi)分泌藥物，患者面臨高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)及短暫的生存期。研究顯示，部分TNBC呈現(xiàn)間質(zhì)表型。有研究證實(shí)miR-200c在乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和膀胱癌等多種實(shí)體腫瘤中與EMT存在緊密聯(lián)系[14-16]。我們前期研究經(jīng)過miRNA芯片篩查發(fā)現(xiàn)在TNBC和非TNBC 2種細(xì)胞系中miR-200c表達(dá)差異顯著[17]，說明miR-200c與三陰狀態(tài)也存在密切聯(lián)系[18]。Park等[19]研究結(jié)果表明在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中，4-OHT能夠通過miR-200c上調(diào)c-myc促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，從而導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力增強(qiáng)，這證實(shí)了4-OHT與miR-200c之間存在的聯(lián)系。本研究中miR-200c在TNBC細(xì)胞中表達(dá)顯著低于非TNBC細(xì)胞，而在TNBC細(xì)胞中應(yīng)用4-OHT后miR-200c表達(dá)升高，可能是4-OHT部分解除了miR-200c受到的抑制作用。

DNMT是DNA甲基化發(fā)生的必要催化酶，DNMT的活性及表達(dá)程度能夠影響基因的甲基化狀態(tài)[20]。近年來越來越多研究報(bào)道，在多種腫瘤中DNMTs的上調(diào)與不良預(yù)后相關(guān)[21]。降低DNMTs的活性能夠影響甲基化的狀態(tài)[22]。一項(xiàng)在結(jié)腸癌中的研究報(bào)道[23]，應(yīng)用RNAi單獨(dú)干擾任意一種DNMT都不能影響miRNA的表達(dá)，但同時(shí)敲除2種蛋白能夠調(diào)控10%miRNA的表達(dá)，深入探究發(fā)現(xiàn)這些有變化的miRNAs，其啟動(dòng)子區(qū)域均有CpG島存在。本研究對(duì)miR-200c的啟動(dòng)子進(jìn)行了CpG島的預(yù)測，證實(shí)miR-200c的啟動(dòng)子區(qū)存在甲基化的位點(diǎn)。接著，應(yīng)用4-OHT作用于間質(zhì)樣TNBC細(xì)胞，檢測DNMTs的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)DNMT1、DNMT3A表達(dá)降低。進(jìn)一步在DNMTs高表達(dá)的MCF-7/ADR細(xì)胞中敲除DNMTs，發(fā)現(xiàn)同時(shí)敲除DNMT1和DNMT3A能夠上調(diào)miR-200c的表達(dá)，且能夠降低間質(zhì)表型Vimentin的表達(dá)。

綜上所述，本研究通過深入研究4-OHT對(duì)于間質(zhì)樣TNBC細(xì)胞的作用機(jī)制，證實(shí)了4-OHT對(duì)DNMTs表達(dá)的調(diào)控，通過調(diào)控DNMTs表達(dá)發(fā)揮全面去甲基化作用調(diào)控miR-200c的表達(dá)，從而逆轉(zhuǎn)間質(zhì)樣表型的表達(dá)，為進(jìn)一步尋找4-OHT非雌激素受體依賴機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)，具有一定臨床意義。對(duì)miR-200c啟動(dòng)子上的甲基化位點(diǎn)進(jìn)行特異性檢測有待進(jìn)一步深入的研究。