骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其外泌體干預(yù)自發(fā)性高血壓大鼠降低腦卒中風(fēng)險(xiǎn)研究

劉珍君，王 波，肖夢(mèng)媛，曾維凱，余 麗，余麗琴，彭子健，魏文燕，陳建英

高血壓病是最常見(jiàn)的慢性病之一[1]，2016年我國(guó)約有2.7億高血壓患者，部分患者并無(wú)癥狀，但可以發(fā)生心腦腎等器官損害，導(dǎo)致腦卒中、心肌梗死事件甚至死亡，且腦卒中有高發(fā)病率、高致殘率的特點(diǎn)，約70%～80%患者因殘疾喪失獨(dú)立生活能力[2-3]。幸運(yùn)的是，高血壓是可以治療的，降低患者血壓水平，可明顯減少腦卒中及心臟病事件，顯著改善患者的生存質(zhì)量，有效減輕疾病負(fù)擔(dān)[4]。因此，針對(duì)高血壓尤其是腦卒中的防治顯得尤為重要。

自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertensive rats,SHR)是1963年日本Okamoto用Wistar京都種大鼠(WKY)通過(guò)選擇性交配而培育出的品種，是目前國(guó)際公認(rèn)的最接近于人原發(fā)性高血壓的動(dòng)物模型，是基礎(chǔ)研究及藥物篩選的首選[5-6]。前期研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)及其外泌體(MSCs-exosomes，MSCs-exo)可通過(guò)減輕肺血管重構(gòu)從而達(dá)到減低肺動(dòng)脈壓力[7]。本研究通過(guò)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)及其外泌體(BMSCs-exosomes,BMSCs-exo)干預(yù)SHR動(dòng)物模型，觀察SHR血壓、腦血流灌注量和腦卒中發(fā)生情況，探討B(tài)MSCs及BMSCs-exo是否能減低SHR血壓，降低腦卒中的發(fā)生率。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器設(shè)備 α-MEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)、胎牛血清(美國(guó)Gibco公司)、BCA蛋白定量試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)、臺(tái)式超速冷凍離心機(jī)(日本HITACHI公司)、高速臺(tái)式離心機(jī)(湖南賽特相儀離心機(jī)儀器有限公司)、FACS Calibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton-Dickinson公司)、ALC.V8型動(dòng)物呼吸機(jī)激光多普勒血流灌注成像系統(tǒng)壓力換能器(YP900型)(北京新航興業(yè)科貿(mào)有限公司)、WinMDl2.9流式數(shù)據(jù)分析軟件(美國(guó)WinRAR公司)、Medlab生理記錄儀(南京美易)、透射電鏡(型號(hào)JEM-1400,日本Olympus公司)、紋式血管鉗、持針器、眼科剪、手術(shù)鑷、眼科鑷、組織剪、線剪、小型動(dòng)物開(kāi)胸器、小型拉鉤。

1.2 BMSCs及BMSCs-exo提取、培養(yǎng)與鑒定 取4～5周齡SPF級(jí)SD大鼠，取出雙側(cè)股骨、脛骨及肱骨，采用胰酶消化法進(jìn)行傳代及全骨髓直接貼壁分離法進(jìn)行BMSCs鑒定；取常規(guī)培養(yǎng)、生長(zhǎng)良好的第3代大鼠BMSCs，收集BMSCs-exo，BCA法蛋白定量，電鏡下形態(tài)鑒定，流式細(xì)胞術(shù)表型鑒定，技術(shù)方法詳見(jiàn)參考文獻(xiàn)[7]。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選取及分組 選用雄性12周齡的SHR 36只，按照隨機(jī)原則分為3組：BMSCs-exo組、BMSCs組和NaCl組，每組各SHR 12只，進(jìn)行不同的干預(yù)。BMSCs-exo組大鼠通過(guò)尾靜脈注射30 μg/μL的BMSCs-exo進(jìn)行干預(yù)處理(BCA蛋白定量方法測(cè)定其濃度)，隔日1次，共注射7次；BMSCs組通過(guò)尾靜脈注射BMSCs(1×106)干預(yù)處理，共1次；NaCl組(陽(yáng)性對(duì)照組)大鼠尾靜脈注射生理鹽水20 μL/kg進(jìn)行干預(yù)，共1次。選用雄性12周齡的SD大鼠12只，為Nor組(陰性對(duì)照組)，尾靜脈注射生理鹽水20 μL/kg進(jìn)行干預(yù)，共1次。

1.4 各組大鼠生活習(xí)性觀察及腦血流灌注量檢測(cè) ①體重測(cè)量：各組大鼠每隔1周1次用天平進(jìn)行稱量并記錄。②外周血壓測(cè)量：各組大鼠每周測(cè)量2次外周尾動(dòng)脈血壓，將大鼠固定于血壓測(cè)量固定裝置中，尾部外露，測(cè)定大鼠尾部動(dòng)脈收縮壓5次，以每次血壓相差不超過(guò)5 mmHg為準(zhǔn)，血壓取3次測(cè)定平均值，記錄各組大鼠的外周動(dòng)脈壓力曲線。③生活習(xí)性和腦卒中臨床評(píng)分：每天喂食水時(shí)觀察各組大鼠的生活習(xí)性有無(wú)改變，采用腦卒中臨床表現(xiàn)評(píng)分：1分為活動(dòng)少，運(yùn)動(dòng)量輕度減少或輕度興奮；2分為活動(dòng)很少，運(yùn)動(dòng)量明顯減少或激惹亢奮；3分為俯臥不動(dòng)，不能行走，憂郁性癥狀；4分為癱瘓，不能站立，任何1側(cè)或雙側(cè)肢體麻痹。④腦血流灌注量指標(biāo)檢測(cè)：在各組大鼠干預(yù)的第4～6周，采用多普勒血流測(cè)量?jī)x對(duì)各組大鼠急性腦血流灌注量進(jìn)行檢測(cè)，記錄圖像及數(shù)值。并通過(guò)左心室穿刺法，由Medlab生理測(cè)量?jī)x測(cè)定各組大鼠左心室壓力，收集圖像并記錄數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs的形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的BMSCs第3天形態(tài)不均一，呈類圓形或橢圓形(圖1A)；細(xì)胞培養(yǎng)至第3代時(shí)，為均一的紡錘形成纖維細(xì)胞樣，排列稍緊密，呈輻輳樣、漩渦狀集落排列生長(zhǎng)(圖1B)。對(duì)第3代BMSCs進(jìn)行成骨、成脂誘導(dǎo)分化鑒定，BMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)及茜素紅染色后，在細(xì)胞外基質(zhì)可見(jiàn)橘紅色鈣結(jié)節(jié)沉積形成(圖1C)，BMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)及油紅O染色后，在細(xì)胞胞漿內(nèi)可見(jiàn)有紅色脂肪液滴形成(圖1D)。

2.2 BMSCs-exo的鑒定 透射電鏡觀察：隨機(jī)視野下看到提取物直徑分布范圍集中在30～150 nm，呈囊體結(jié)構(gòu)，形態(tài)近似球形或橢球形，大小均一(圖2)。納米示蹤分析：取適量提取物稀釋至1mL加入樣品池，在顯示器上觀察，樣品池內(nèi)粒子成布朗運(yùn)動(dòng)，波峰分布在150 nm左右(圖3)。

圖3 納米示蹤分析下BMSCs-exo直徑波峰圖

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs-exo的表面抗原 經(jīng)WinMDI 2.9軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，外泌體BMSCs-exo特異性分子CD63、CD81均為陽(yáng)性表達(dá)(圖4)。

圖4 BMSCs-exo流式細(xì)胞儀鑒定結(jié)果圖

2.4 各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定結(jié)果 干預(yù)的第6周對(duì)各組大鼠進(jìn)行尾動(dòng)脈收縮壓測(cè)定，可通過(guò)Medlab生理記錄儀器獲得大鼠尾動(dòng)脈收縮壓值(圖5)。大鼠尾動(dòng)脈收縮壓較正常組(Nor組)顯著升高(P<0.001)，BMSCS組和BMSCs-exo組尾動(dòng)脈收縮壓較NaCl組降低，仍高于Nor組，差異比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但BMSCs-exo組與BMSCs組之間尾動(dòng)脈收縮壓差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖6)。

圖5 各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓圖像

注：與NaCl組比較，*P<0.05；與Nor組比較，#P<0.001，△P<0.05，▲P<0.01圖6 各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓比較

2.5 各組SHR生存率及腦卒中臨床評(píng)分 各組大鼠生存率結(jié)果：在SHR進(jìn)行不同組別的干預(yù)后第6周，NaCl組大鼠死亡3只，生存率75%(9/12)，BMSCs-exo組死亡3只，生存率75%(9/12)， BMSCs組死亡2只，生存率83.3%(10/12)，SD大鼠沒(méi)有死亡，生存率為100%(12/12)。

生活習(xí)性及卒中評(píng)分結(jié)果：1分比率：NaCl組25.0%，BMSCs組50.0%，BMSCs-exo組33.3%；2分比率：NaCl組25.0%，BMSCs組16.7%，BMSCs-exo組25.0%；3分比率：NaCl組33.3%，BMSCs組25.0%，BMSCs-exo組25%；4分比率：NaCl組16.7%，BMSCs組8.3%，BMSCs-exo組16.7%。與NaCl組大鼠比較，BMSCs和BMSCs-exo組大鼠1分占比較高，尤其是BMSCs組；4分的占比BMSCs組較低。

2.6 各組大鼠腦血流灌注量測(cè)定結(jié)果 對(duì)各組大鼠進(jìn)行腹腔麻醉并去除大鼠頭顱皮膚以及脂肪組織后，采用激光多普勒血流測(cè)定儀器對(duì)大鼠腦血流灌注量進(jìn)行檢測(cè)(圖7)，并利用Image-Pro-Plus圖像分析軟件進(jìn)行腦血流灌注量數(shù)值統(tǒng)計(jì)分析。在對(duì)SHR模型干預(yù)的第6周，NaCl組大鼠腦血流灌注較Nor組大鼠顯著下降(P<0.001)，BMSCs組和BMSCs-exo組較NaCl組腦血流灌注量升高(P<0.05)，但2組間差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖8)。

圖7 各組大鼠腦血流灌注測(cè)量圖像

注：與NaCl組比較，*P<0.05；與Nor組比較，#P<0.001，△P<0.05圖8 各組大鼠腦血流灌注量比較

2.7 各組大鼠左心室平均壓力測(cè)定結(jié)果 通過(guò)開(kāi)胸行左心室穿刺法對(duì)各組大鼠進(jìn)行左心室壓力測(cè)定，通過(guò)Medlab生理記錄儀器以及大鼠心功能測(cè)量?jī)x獲得大鼠左心室壓力平均值(圖9)。在干預(yù)第6周，NaCl組大鼠左心室平均壓力顯著高于Nor組(P<0.001)，BMSCs組和BMSCs-exo組左心室壓力均較NaCl組左心室壓力降低(P<0.05)，仍高于Nor組(P<0.05)，但BMSCs組與BMSCs-exo組之間差異比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖10)。

圖9 各組大鼠左心室壓力圖像

注：與NaCl組比較，*P<0.05；與Nor組比較，#P<0.001，△P<0.05圖10 各組大鼠左心室壓力比較

3 討論

BMSCs是一類具有多向分化潛能的成體多能干細(xì)胞，已有研究證實(shí)BMSCs移植在心肌梗死、肺動(dòng)脈高壓、腎損傷及腦缺血等發(fā)揮一定的作用，并能不同程度修復(fù)受損器官功能[8]。據(jù)報(bào)道BMSCs能分泌促進(jìn)血管神經(jīng)生成的生存因子[9]，腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ惋@示干細(xì)胞分泌可減少腦損傷和促進(jìn)神經(jīng)恢復(fù)[10]。研究發(fā)現(xiàn)miRNA的細(xì)胞間通訊通過(guò)外泌體，小的脂質(zhì)微泡，顯示可促進(jìn)腦的修復(fù)[11]。BMSCs-exo表面表達(dá)大量的生物活性物質(zhì)、膜錨定受體、粘附分子、細(xì)胞表面特異抗原等，參與調(diào)控重要的細(xì)胞生理活動(dòng)，在細(xì)胞凋亡、血管生成、炎癥反應(yīng)過(guò)程中的作用均有報(bào)道，改善腦卒中的神經(jīng)損傷和神經(jīng)保護(hù)作用，與增強(qiáng)血管神經(jīng)的生成有關(guān)[12]。BMSCs在干細(xì)胞治療應(yīng)用中存在細(xì)胞多向分化以及致瘤性等特點(diǎn)，而B(niǎo)MSCs-exo無(wú)以上風(fēng)險(xiǎn)，更具備臨床轉(zhuǎn)化優(yōu)勢(shì)。研究表明[13]，BMSCs-exo可通過(guò)功能性血管緊張素Ⅱ1型受體調(diào)節(jié)血壓[14]，也可通過(guò)自身含有并表達(dá)的miRNA調(diào)節(jié)血壓[15]。

BMSCs及BMSCs-exo可顯著改善缺血性腦卒中的神經(jīng)功能缺損、運(yùn)動(dòng)功能及日常生活能力，不良反應(yīng)少[7]，但極少用于腦卒中的預(yù)防研究。本研究通過(guò)對(duì)SHR尾靜脈注射BMSCs和BMSCs-exo進(jìn)行早期干預(yù)，得出的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為大鼠的腦卒中臨床評(píng)分為1分占比BMSCs-exo組和BMSCs組明顯高于NaCl組，4分組BMSCs較NaCl組降低，而且各組大鼠生存率比較以BMSCs組最低，提示BMSCs和BMSCs-exo進(jìn)行早期干預(yù)SHR能一定程度改善大鼠的活動(dòng)能力。進(jìn)一步觀察各組大鼠尾動(dòng)脈收縮壓發(fā)現(xiàn)，NaCl組血壓最高，BMSCs-exo組和BMSCs組干預(yù)后平均動(dòng)脈壓有一定程度的下降，尚未降低正常大鼠水平。而且NaCl組大鼠相比較，監(jiān)測(cè)BMSCs-exo組與BMSCs組2組大鼠有創(chuàng)的左心室壓力均有一定程度的下降，且腦血流灌注量升高，提示BMSCs及BMSCs-exo干預(yù)均降低SHR外周血管壓力及左心室壓力等，可改善SHR腦血流灌注量，進(jìn)一步提示大鼠的生活能力的改善可能與大鼠外周血壓的降低有關(guān)，可降低SHR腦卒中的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)和致殘率。

在本研究中證實(shí)，BMSCs及BMSCs-exo干預(yù)SHR后，不僅可明顯降低動(dòng)脈壓力，可改善腦灌注量，減低腦卒中的風(fēng)險(xiǎn)和發(fā)生機(jī)率，并且可降低左心室壓力，減輕心臟負(fù)荷，降低心功能不全的風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)高血壓所致的心腦血管損害具有顯著的預(yù)防作用。其機(jī)制可能是通過(guò)抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)，并調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子生成等，尚有待進(jìn)一步的研究去證實(shí)和完善。