RLIP76和CD44在胃癌患者血清和組織中表達及其臨床意義

萬 濤，熊偉杰，王云濤

胃癌是臨床常見惡性腫瘤，近年來隨飲食結(jié)構(gòu)的變化及生活方式的改變，胃癌發(fā)病率逐年上升[1]。目前尚未完全明確胃癌的發(fā)病機制，多認為與環(huán)境因素、基因突變、幽門螺桿菌感染等存在密切聯(lián)系，上述因子均可通過影響機體功能基因及蛋白表達導致胃癌發(fā)病[2]。RLIP76為癌基因Ras家族關鍵成員，屬Ral結(jié)合蛋白，為腺嘌呤核苷三磷酸(adenine nucleoside triphosphate,ATP)依賴非ABC轉(zhuǎn)運蛋白，可簡化細胞信號轉(zhuǎn)導及物質(zhì)轉(zhuǎn)運，參與ATP水解，早期認為RLI76擔負谷胱甘肽結(jié)合物轉(zhuǎn)運，是腫瘤細胞產(chǎn)生耐藥的關鍵機制[3]。近年來發(fā)現(xiàn)，RLIP76在腫瘤細胞生物學過程中有重要作用，可參與細胞分裂、增殖、分化及凋亡等過程，且在乳腺癌、肺癌中呈明顯高表達[4-5]。但對其在胃癌中的作用尚未見報道。CD44則為腫瘤干細胞表面標志物，屬特殊跨膜糖蛋白，參與淋巴細胞再循環(huán)過程，目前認為CD44蛋白與腫瘤細胞生物學行為存在密切聯(lián)系，一般正常條件下，胃黏膜組織無CD44蛋白表達，而一旦檢出CD44高表達則通常提示患者預后不佳[6]?；诖?，本研究回顧性分析胃癌患者臨床資料，為進一步探討RLI76與CD44在胃癌血清及病理組織中的表達及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年3月—2016年5月于成都市第五人民醫(yī)院行手術治療的82例胃癌患者的臨床資料。納入標準：病理確診為胃腺癌；術前未接受放化療、靶向治療或生物治療等抗腫瘤治療；手術嚴格遵循無瘤原則；術中均留取癌旁組織及癌組織標本；術后均完成2年隨訪調(diào)查，且病例資料完整。排除標準：術后3個月內(nèi)死亡者；存在嚴重圍術期并發(fā)癥者；其他器官惡性腫瘤轉(zhuǎn)移至胃部者。其中男52例，女30例；年齡32～76(46.5±9.7)歲；合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移46例；臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期48例，Ⅲ～Ⅳ期34例；腫瘤分化程度：低分化32例，高、中分化50例。

1.2 主要試劑及儀器 鼠抗人CD44單克隆抗體、鼠抗人RLIP76單克隆抗體(均購自美國Abcam公司)，免疫組化試劑盒及通用型二抗試劑盒(購自北京中杉金橋生物技術有限公司)，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer solution,PBS)、牛血清白蛋白(blood serum albumin,BSA)、枸緣酸、二甲苯(均購自上海信然生物科技有限公司)，生物素化山羊抗小鼠免疫球蛋白G(immunoglobulin G,IgG)(購自武漢博士德生物工程有限公司)，鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復合物(streptavidin-biotin-peroxidase complex,SABC)(購自上海源葉生物科技有限公司)，二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)(購自上海研拓生物科技有限公司)，CD44、RLIP76酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(均購自法國Diaclone公司)；37 ℃恒溫烤箱(購自上海躍進醫(yī)療器械公司)，CX31型光學顯微鏡(購自日本Olympus公司)，RM-2135型組織切片機(購自德國Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 血清RLIP76及CD44表達測定 術前3 d、術后2周均留取患者空腹外周血標本2 mL，采用ELISA法測定血清RLIP76及CD44表達，均嚴格參照試劑使用說明進行操作，酶標板每孔包被抗原，37 ℃孵育30 min，甩干液體，吸凈液體，每孔加入兔抗人RLIP76及CD44單克隆抗體100 μL，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌3次×5 min，加入酶標二抗每孔100 μL，37 ℃孵育1 h，洗板3次，加入底物，避光反應10 min，終止反應，DAB顯色劑顯色，中性樹膠封片，酶標儀測定450 nm處吸光度值，根據(jù)標準曲線計算RLIP76及CD44表達情況。

1.3.2 病理組織RLIP76及CD44表達測定 術中取癌組織、癌旁組織(距原發(fā)灶邊緣5 cm以上組織)標本，10%甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)組織切片，烤箱內(nèi)固定，溫度為60 ℃，60 min取出，常規(guī)二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，去除標本內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復，PBS沖洗3次，滴加5% BSA封閉，室溫放置20 min，去除多余液體，滴入一抗，4 ℃過夜，PBS沖洗，滴入生物素化山羊抗小鼠IgG，5～10 min后PBS沖洗，滴加SABC，37 ℃反應20 min，PBS沖洗，DAB顯色，反應20 min，蘇木精復染，脫水后固定，PBS為陰性對照。RLIP76陽性表達定位于細胞漿，CD44蛋白陽性表達定位于細胞膜，呈棕褐色或棕黃色。每切片隨機取5個高倍視野進行觀察，以免疫積分半定量法[7]評定組織RLIP76、CD44表達水平。染色強度：無著色為0分；淡黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。染色比例：陽性細胞數(shù)<5%為0分；陽性細胞數(shù)5%～25%為1分；陽性細胞數(shù)26%～50%為2分；陽性細胞數(shù)51%～75%為3分；陽性細胞數(shù)≥76%為4分。最終評分=染色比例×染色強度，評分≥8分為陽性。并收集所有患者臨床病理資料及預后情況，觀察胃癌組織RLIP76、CD44表達與胃癌臨床病理特點及預后的關系。

2 結(jié)果

2.1 胃癌患者手術前后血清RLIP76、CD44表達水平變化 胃癌患者血清RLIP76表達水平術前3 d(46.51±12.25)ng/mL比術后2周(24.15±9.77)ng/mL高，差異比較有統(tǒng)計學意義(t=18.390，P<0.05)；胃癌患者血清CD44表達水平術前3 d(445.26±54.74)ng/mL比術后2周(310.25±38.26)ng/mL高，差異比較有統(tǒng)計學意義(t=26.291，P<0.05)。

2.2 胃癌患者癌組織及癌旁組織RLIP76、CD44陽性表達情況比較 胃癌患者癌組織RLIP76陽性41例，陽性率為50.00%，CD44陽性48例，陽性率為58.54%，患者癌組織RLIP76、CD44陽性率均高于癌旁組織(χ2=48.681，65.063；均P<0.05)，圖1，圖2。

圖1 胃癌組織與癌旁組織RLIP76表達(SP×200)

圖2 胃癌組織與癌旁組織CD44表達(SP×200)

2.3 胃癌患者癌組織RLIP76、CD44表達與臨床病理參數(shù)單因素分析 不同性別、年齡、腫瘤直徑胃癌患者RLIP76陽性率、CD44陽性率差異比較無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；組織分化程度為低分化、臨床分期為Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者RLIP76陽性率、CD44陽性率高于組織分化程度為高、中分化、臨床分期Ⅰ～Ⅱ期及不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者，差異比較有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表1。

表1 胃癌患者癌組織RLIP76、CD44表達與臨床病理參數(shù)單因素分析[n(%)]

2.4 胃癌預后多因素分析 82例患者均完成術后2年隨訪調(diào)查，RLIP76陽性、CD44陽性與RLIP76陰性、CD44陰性胃癌患者2年生存情況見圖3、圖4，RLIP76陽性、CD44陽性胃癌患者生存時間短于陰性者，但Log-Rank檢驗差異無統(tǒng)計學意義(χ2=2.057，P=0.151；χ2=0.452，P=0.501)；Cox分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、RLIP76陽性、CD44陽性均為影響胃癌預后的獨立危險因素(P<0.05)，表2。

圖3 RLIP76陽性、陰性患者生存分析

圖4 CD44陽性、陰性患者生存分析

表2 胃癌預后影響因素多因素分析

3 討論

胃癌是臨床高發(fā)惡性腫瘤，死亡率高[8]，目前尚未完全明確其發(fā)生、進展、浸潤及轉(zhuǎn)移等惡性生物學行為的確切機制，對發(fā)生廣泛淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的胃癌患者尚缺乏有效治療手段。近年來，隨著對腫瘤干細胞研究的不斷深入，越來越多報道指出，腫瘤干細胞標志物具備自我更新及分化功能，且具備高致瘤性，可為腫瘤細胞群提供生長及增殖的條件，同時腫瘤干細胞具備運動及遷徙功能，可促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，在腫瘤生長、浸潤及轉(zhuǎn)移過程中有重要作用[9-10]。Xu等[11]指出，正常狀態(tài)下，腫瘤干細胞維持穩(wěn)定休眠狀態(tài)，且有較強的耐藥性，對治療敏感性低，導致臨床放化療過程中無法完全殺滅腫瘤干細胞，是造成其復發(fā)、轉(zhuǎn)移的原因。

CD44屬特殊跨膜糖蛋白，為重要的細胞粘附分子，其蛋白可介導淋巴細胞歸巢及向炎癥、黏膜淋巴組織趨化，并粘附細胞外基質(zhì)，又被稱為巢受體，可與透明質(zhì)酸、膠原蛋白結(jié)合，參與細胞與細胞外機制粘附[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在較多惡性腫瘤中均可見CD44表達[13-14]。Hirata等[15]報道，胃癌患者血清CD44水平明顯高于正常健康人。本研究對手術前后胃癌患者血清CD44水平進行測定發(fā)現(xiàn)，術前患者CD44水平處于較高水平，明顯高于Wang等[16]檢測的正常健康人血清CD44水平及患者術后2周CD44水平，提示胃癌患者血清CD44呈明顯異常上調(diào)表現(xiàn)。同時對胃癌患者癌旁組織及癌組織CD44蛋白水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，癌組織CD44蛋白陽性率明顯高于癌旁組織。行病理相關因素分析發(fā)現(xiàn)，隨腫瘤臨床分期的上升、腫瘤分化程度的降低，癌組織CD44蛋白陽性率上升，且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者癌組織CD44陽性率明顯高于未發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，與早期研究結(jié)論相符，表明癌組織CD44水平的變化在一定程度上反映了胃癌浸潤深度及侵襲、轉(zhuǎn)移能力。此外，進行Cox預后分析發(fā)現(xiàn)，CD44陽性表達為影響胃癌患者術后生存的獨立危險因素，表明腫瘤干細胞標志物CD44不僅參與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過程，同樣與患者預后存在密切關聯(lián)，而通過檢測胃癌組織CD44蛋白表達狀況，則可科學預測胃癌復發(fā)、轉(zhuǎn)移風險，指導臨床治療。

RLIP76則為ATP依賴非ABC轉(zhuǎn)運型多功能轉(zhuǎn)運蛋白，屬Ral效應蛋白，連接Ral鳥嘌呤三核苷酸磷酸(GTP)酶與Rho通路，可將Ral激活后自細胞漿內(nèi)募集至細胞膜，調(diào)節(jié)細胞生理功能[17]。RLIP76初次定位發(fā)現(xiàn)于紅細胞，近年來發(fā)現(xiàn)，人類心臟、腎臟、白細胞、卵巢、肺部、肝臟等組織均可見RLIP76表達，且在肺癌、子宮內(nèi)膜癌患者癌組織均可見RLIP76表達上調(diào)[18]。張正娥[19]研究發(fā)現(xiàn)，RLIP76物質(zhì)轉(zhuǎn)移功能是導致癌細胞化療耐藥的關鍵機制。也有動物實驗發(fā)現(xiàn)，敲除RLIP76基因可影響腫瘤細胞增殖、凋亡、遷徙及轉(zhuǎn)移過程[20]。RLIP76為Ras超家族成員，參與脂蛋白轉(zhuǎn)運體調(diào)控細胞內(nèi)過氧化脂質(zhì)水平，同時可與Ral、Hsf-1結(jié)合影響細胞信號轉(zhuǎn)導，調(diào)控細胞增殖、分化及凋亡，而下調(diào)RLIP76表達可抑制癌細胞侵襲，阻滯細胞周期。本研究檢測手術前胃癌患者血清RLIP76水平發(fā)現(xiàn)，術前胃癌患者RLIP76水平異常上調(diào)，術后有明顯降低，提示手術切除胃癌病灶可下調(diào)血清RLIP76水平。同時對癌組織及癌旁組織RLIP76蛋白表達水平進行測定發(fā)現(xiàn)，癌組織RLIP76陽性率明顯高于癌旁組織。對RLIP76蛋白表達與胃癌臨床病理特征關系進行分析發(fā)現(xiàn)，臨床分期越高、分化程度越低且伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者RLIP76蛋白陽性率較高。預后監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，RLIP76蛋白陽性為影響患者術后生存率的獨立危險因素，提示RLIP76表達與胃癌發(fā)病、侵襲及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，推測其機制可能為RLIP76在細胞形態(tài)改變及細胞遷徙過程中有重要作用，持續(xù)RLIP76高表達可能通過影響細胞生長、遷移、分化、增殖及凋亡而導致胃癌發(fā)病及侵襲、轉(zhuǎn)移。

綜上所述，胃癌患者血清及癌組織RLIP76、CD44表達水平均較高，兩者均與胃癌臨床分期、腫瘤分化程度及腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關，為影響胃癌術后生存的獨立危險因素。