限域結(jié)晶法制備載β-胡蘿卜素的氧化淀粉水凝膠球

白 杰，屈殷子，王珊珊，華 姍，朱雨婷，李 媛

（中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083）

近年來(lái)，食源性生物活性物質(zhì)例如多酚、類(lèi)胡蘿卜素等，因具有抗氧化、抗癌、輔助降血糖、降血脂等功能受到越來(lái)越多的關(guān)注[1]。然而該類(lèi)分子大多在水中溶解度極低，限制其在食品中的應(yīng)用，同時(shí)在人體中的吸收率較低，影響其發(fā)揮健康功效。β-胡蘿卜素是廣泛存在于植物、藻類(lèi)與真菌中的四萜類(lèi)碳?xì)浠衔?，分子式為C40H56，是一種重要的天然食用色素，也可以用作營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑[2]。β-胡蘿卜素是VA的前體，一分子的β-胡蘿卜素可以轉(zhuǎn)化為兩分子的VA，是人體VA的主要來(lái)源[3]。β-胡蘿卜素能夠清除體內(nèi)單線(xiàn)態(tài)分子氧與過(guò)氧自由基，具有較高的抗氧化活性[4-5]，對(duì)癌癥與心腦血管等疾病具有一定預(yù)防作用[6]。然而β-胡蘿卜素對(duì)光、熱、氧極為敏感，易發(fā)生降解、氧化、異構(gòu)化、光敏化等反應(yīng)，導(dǎo)致生物活性降低。另外β-胡蘿卜素不溶于水，微溶于植物油，極大程度限制了β-胡蘿卜素在食品中的應(yīng)用[7]。為提高β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性，擴(kuò)大其應(yīng)用范圍，采用食品大分子運(yùn)載體系對(duì)其進(jìn)行增溶穩(wěn)定成為近年來(lái)食品領(lǐng)域中的一個(gè)研究熱點(diǎn)，目前用于包埋β-胡蘿卜素的運(yùn)載體系有乳液[8]、凝膠[9]、微膠囊[10]、納米顆粒[11]和分子復(fù)合物[12]等。

淀粉因其來(lái)源廣、成本低、生物相容性好等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于食品和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，運(yùn)載食品活性因子或藥物分子至靶向部位，提高食品活性因子穩(wěn)定性或藥物輸送效率[13]。天然淀粉由于缺乏可電離基團(tuán)，在水中溶解度小，吸附率較低，限制其作為優(yōu)質(zhì)載體的制備材料。通過(guò)對(duì)淀粉改性的技術(shù)手段可以改進(jìn)淀粉的理化特性，擴(kuò)展其應(yīng)用范圍。常用的淀粉改性方法有酸解、酶解、氧化、酯化和交聯(lián)等[14-15]。其中，氧化淀粉的應(yīng)用較為廣泛，通過(guò)引入羧基增強(qiáng)其電荷性和吸附性。2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基（2,2,6,6-tetramethylpiperidin yloxy，TEMPO）是一種能夠在水環(huán)境中溫和發(fā)生氧化反應(yīng)的綠色環(huán)保催化劑，TEMPO/NaClO/NaBr氧化體系可以將多糖糖單元上的C6位羥基氧化為羧基，氧化度精確可控，如圖1所示[16]。氧化淀粉可通過(guò)離子配位交聯(lián)和共價(jià)交聯(lián)等手段制得高荷載率的載體，同時(shí)具有緩控釋、高吸附等效果[17]。研究者[18-20]使用三偏磷酸鈉化學(xué)交聯(lián)TEMPO氧化淀粉，形成一種新型的生物相容性良好的微凝膠體系，已被開(kāi)發(fā)利用于花色苷和蛋白的遞送。Zhao Luhai等[21]利用交聯(lián)后的氧化淀粉制作一系列具有不同電荷密度和交聯(lián)密度的微凝膠，并利用這種可生物降解的微凝膠系統(tǒng)控制溶菌酶的攝取和釋放。Jiang Yumeng等[22]利用TEMPO氧化淀粉與靶向肽RGD結(jié)合，制備具有高度生物相容性的納米載體靶向遞送阿霉素至腫瘤組織，并在細(xì)胞和動(dòng)物水平均顯示增強(qiáng)的抗癌效果。

圖 1 TEMPO催化氧化淀粉示意圖Fig. 1 Schematic diagram of 2,2,6,6-tetramethylpiperidinyloxy catalytic oxidation of starch

本研究提出利用限域結(jié)晶法制備一種能夠運(yùn)載β-胡蘿卜素的氧化淀粉水凝膠微球。利用易揮發(fā)的有機(jī)溶劑（二氯甲烷）溶解β-胡蘿卜素后作為內(nèi)油相（O1）與氧化淀粉溶液（外水相，W）混合形成O1/W初乳，將所得初乳與FeSO4·7H2O溶液混合后滴加至外油相（O2），高速剪切后可形成O1/W/O2雙重乳液，再向體系中通入氧氣將Fe2＋氧化為Fe3＋，F(xiàn)e3＋在水溶液（W）中與氧化淀粉上羧基交聯(lián)，形成穩(wěn)定的淀粉水凝膠球。淀粉水凝膠球中的內(nèi)油相（O1）揮發(fā)后，留下β-胡蘿卜素在淀粉球內(nèi)結(jié)晶，即可實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素的高效運(yùn)載。這種氧化淀粉水凝膠球可作為一種新型食品運(yùn)載體系，具有較高的裝載率，為提高生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性與生物利用率提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

馬鈴薯淀粉（分析純） 荷蘭AVEBE公司；2,2,6,6-四甲基-1-哌啶氧基、三偏磷酸鈉（均為分析純）美國(guó)Sigma公司；β-胡蘿卜素（分析純） TCI（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；液體石蠟（化學(xué)純） 西隴化工股份有限公司；FeSO4·7H2O（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；NaBr、NaBH4、正己烷、石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯（均為分析純） 北京化工廠(chǎng)有限責(zé)任公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RTCB S25磁力攪拌器、T18 Basic高速剪切機(jī)德國(guó)IKA公司；UB100i顯微鏡 武漢奧浦信息技術(shù)有限公司；SP2共聚焦熒光顯微鏡 德國(guó)徠卡公司；JSM-6700掃描電子顯微鏡（scanning election microscope，SEM）日本電子公司；MASTERSIZER 3000激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 TEMPO氧化淀粉的制備

參照De Nooy等[23]的方法進(jìn)行。將8.1 g馬鈴薯淀粉緩慢溶解于500 mL沸水中，冰浴降溫至8～10 ℃，將提前溶解好的TEMPO（0.648 g）溶液與NaBr（3.24 g）溶液加入上述溶液中，利用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 10。淀粉氧化度由加入0.5 mol/L NaOH與pH 10 NaClO4溶液的量控制，氧化度為90%的淀粉需要NaOH溶液的量為90 mL。氧化過(guò)程中，逐滴滴加0.5 mol/L NaOH與pH 10的NaClO4溶液，維持體系pH 10，溫度為8～10 ℃。當(dāng)加入規(guī)定量的NaOH后，加入10 mL的無(wú)水乙醇終止反應(yīng)。5 min后加入NaBr，攪拌1 h。之后利用鹽酸調(diào)節(jié)pH 3，攪拌1 h以除去多余的NaBr。最后將溶液pH值調(diào)節(jié)為中性。氧化反應(yīng)結(jié)束后，在攪拌的狀態(tài)下向體系中加入1.5 倍體積的乙醇以析出氧化淀粉，靜置后抽濾得到氧化產(chǎn)物。利用無(wú)水乙醇洗滌3 次除去雜質(zhì)。最后將所得產(chǎn)物放入通風(fēng)櫥內(nèi)揮發(fā)乙醇后研磨保留。所得產(chǎn)物即為氧化度為90%的氧化淀粉（DO90）。

1.3.2 限域結(jié)晶法制備載β-胡蘿卜素的淀粉水凝膠球

將一定量的β-胡蘿卜素粉末溶于有機(jī)溶劑中作為分散相（O1）；氧化淀粉溶液作為連續(xù)相（W），加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)3%的Tween 80。分散相與連續(xù)相按體積比1∶8混合后12 000 r/min剪切10 min，獲得O/W初乳。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的交聯(lián)劑FeSO4·7H2O，溶于pH 3的鹽酸中，取50 μL FeSO4·7H2O溶液與200 μL上述O/W初乳混合后逐滴加入到溶有Span 80（0.75 g）的20 mL液體石蠟中。25 ℃條件下通入氧氣交聯(lián)10 min形成淀粉微球。10 000 r/min離心10 min獲得微球沉淀后先用正己烷清洗3 次（5 000 r/min，3 min），再用甲醇清洗3 次，接著水洗3 次，除去外油相和殘留反應(yīng)試劑。制得的微球通入氮?dú)飧稍镏辽?0 min后置于pH 3的HCl溶液中保存。

1.3.3 內(nèi)油相（O1）有機(jī)溶劑的確定

β-胡蘿卜素因其弱極性分子結(jié)構(gòu)而不溶于水，能夠溶于四氫呋喃、甲苯等有機(jī)溶劑，但這些溶劑因具有一定的毒性而不能應(yīng)用于食品與藥品中[24]。根據(jù)β-胡蘿卜素的溶解度以及有機(jī)溶劑的揮發(fā)性挑選出石油醚、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯4 種試劑作為內(nèi)油相（O1）制備淀粉球水凝膠球。利用顯微鏡觀(guān)察制得的淀粉微球形態(tài)確定合適的內(nèi)油相。

1.3.4 水相（W）氧化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定

為探究淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)于形成載β-胡蘿卜素氧化淀粉微球的影響，設(shè)置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、3%、5%和10%氧化淀粉溶液作為水相制備O1/W初乳，利用顯微鏡與SEM觀(guān)察其淀粉球形態(tài)及微觀(guān)結(jié)構(gòu)，通過(guò)不同氧化淀粉制備水凝膠球的穩(wěn)定性確定氧化淀粉溶液的最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.5 交聯(lián)劑FeSO4·7H2O用量的確定

交聯(lián)劑FeSO4·7H2O溶于pH 3鹽酸溶液中與O/W初乳混合后逐滴加入到液體石蠟中。體系中通入氧氣將Fe2＋氧化為Fe3＋，25 ℃條件下Fe3＋與氧化淀粉上羧基交聯(lián)10 min形成淀粉球。分別設(shè)置羧基與鐵離子的物質(zhì)的量比為9.17∶1、6.61∶1、4.58∶1、3.00∶1與2.29∶1，在相同質(zhì)量分?jǐn)?shù)氧化淀粉溶液的條件下比較不同交聯(lián)劑用量對(duì)氧化淀粉水凝膠球的影響，并利用顯微鏡觀(guān)察其形態(tài)。

1.3.6 氧化淀粉水凝膠微球的粒徑分布

使用激光粒度儀進(jìn)行測(cè)量。稱(chēng)取一定量氧化淀粉水凝膠微球分散于水中，質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL，測(cè)量前水浴超聲2 min分散。測(cè)量溫度為25 ℃，激光遮光度在2%～3%之間。

1.3.7 氧化淀粉水凝膠球的微觀(guān)結(jié)構(gòu)

利用SEM觀(guān)察氧化淀粉球吸水膨脹后表面形態(tài)，用滴管吸取少量溶解于pH 3鹽酸溶液中的微球，滴于云母片上，在空氣中自然風(fēng)干后噴金處理進(jìn)行觀(guān)察，加速電壓為20 kV。

利用共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察裝載β-胡蘿卜素的微球，由于β-胡蘿卜素是天然熒光染料，可直接觀(guān)察其熒光，樣品置于共聚焦顯微鏡載玻片上，采用100 倍鏡和具有488 nm激發(fā)的氬/氪激光進(jìn)行觀(guān)察。

1.3.8β-胡蘿卜素裝載率的測(cè)定

易揮發(fā)的有機(jī)溶劑（二氯甲烷）溶解定量β-胡蘿卜素后作為內(nèi)油相（O1）與氧化淀粉溶液（W）混合制成初乳，將初乳滴加到外油相（O2）制成O1/W/O2雙重乳液，水相中Fe3＋與氧化淀粉中羧基交聯(lián)后形成穩(wěn)定的淀粉水凝膠球，離心獲得微球。烘干后內(nèi)油相（O1）揮發(fā)，留下β-胡蘿卜素在淀粉球內(nèi)結(jié)晶，稱(chēng)取裝載β-胡蘿卜素淀粉球的質(zhì)量計(jì)算β-胡蘿卜素的裝載率。計(jì)算公式如下：

式中：A1為體系內(nèi)β-胡蘿卜素質(zhì)量；A2為裝載β-胡蘿卜素淀粉微球質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3 次平行測(cè)定，數(shù)據(jù)分析采用Excel軟件，結(jié)果表示為 ±s。圖表分析采用Image J處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 裝載β-胡蘿卜素的淀粉水凝膠球的制備

圖 2 限域結(jié)晶法制備裝載β-胡蘿卜素的氧化淀粉水凝膠球示意圖Fig. 2 Preparation of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene by confined crystallization

β-胡蘿卜素在水溶液中溶解性極差，但易溶于氯仿、氯化烴等有機(jī)溶劑中。如圖2所示，利用易揮發(fā)的有機(jī)溶劑如二氯甲烷等溶解β-胡蘿卜素作為內(nèi)油相（O1），與氧化淀粉溶液（W）混合后通過(guò)高速剪切制得O1/W初乳。在pH 3的鹽酸溶液中，交聯(lián)劑FeSO4·7H2O與O1/W初乳混合后逐滴加入到液體石蠟中制備成O1/W/O2乳液。體系中通入氧氣，將Fe2＋氧化為Fe3＋進(jìn)行交聯(lián)，在水相中與氧化淀粉葡萄糖單元上的羧基配位交聯(lián)，形成粒徑為（15.2±2.1）μm的氧化淀粉水凝膠球，利用純氧吹干水凝膠球使得二氯甲烷揮發(fā)，制得的微球置于pH 3的鹽酸溶液中保存。淀粉水凝膠球中的內(nèi)油相（O1）揮發(fā)后β-胡蘿卜素留在淀粉球內(nèi)結(jié)晶，即可實(shí)現(xiàn)β-胡蘿卜素的裝載。本研究利用FeSO4·7H2O作為氧化淀粉交聯(lián)劑，體系中通入氧氣將Fe2＋氧化為

Fe3＋與氧化淀粉上的羧基鰲合。根據(jù)Chen Xiaodong等[25]的研究，F(xiàn)e3＋與羧基的配位模式主要有兩種，單齒與雙向橋接，雙向橋接的比例更大，這兩種交聯(lián)方式使得氧化后的淀粉鏈形成致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，獲得更為穩(wěn)定的水凝膠微粒運(yùn)載體系。Wang Shanshan等[26]采用三偏磷酸鈉交聯(lián)TEMPO氧化淀粉形成凝膠用于吸附包含β-胡蘿卜素的納米乳液，結(jié)果表明可以有效提高β-胡蘿卜素的生物活性，且可以在腸環(huán)境中特異性釋放。相較于淀粉水凝膠球吸附乳液，直接利用限域的方式將β-胡蘿卜素裝載在氧化淀粉水凝膠球內(nèi)使得裝載率更高，可達(dá)到（29±3.2）%。利用氧化淀粉水凝膠微球在溶液中易于溶解，可有效提高β-胡蘿卜素在溶液中的生物利用率和穩(wěn)定性，并達(dá)到緩釋目的。

2.2 有機(jī)溶劑的選擇

圖 3 包埋β-胡蘿卜素的氧化淀粉微凝膠光學(xué)圖像Fig. 3 Optical images of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene dissolved in petroleum ether, methylene chloride, hexaneor ethyl acetate

選取石油醚、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯4 種有機(jī)溶劑作為內(nèi)油相（O1）制備水凝膠氧化淀粉球，并將淀粉球溶解在pH 3的鹽酸溶液中置于顯微鏡中觀(guān)察，結(jié)果如圖3所示。使用乙酸乙酯、正己烷溶解β-胡蘿卜素作為內(nèi)油相（O1），得到的氧化淀粉水凝膠微球的內(nèi)部乳液融合為整個(gè)乳滴，沒(méi)有均勻粒徑較小的乳滴存在，穩(wěn)定性較差，導(dǎo)致裝載率很低，所以不適合作為內(nèi)油相。相比較而言，二氯甲烷和石油醚兩種有機(jī)溶劑作內(nèi)油相時(shí)，氧化淀粉水凝膠內(nèi)部包埋β-胡蘿卜素乳液滴分布均勻，較為穩(wěn)定。因此二氯甲烷和石油醚是比較適合的內(nèi)油相。此外，β-胡蘿卜素在石油醚、二氯甲烷比在正己烷、乙酸乙酯中溶解度高，內(nèi)油相中溶解度越高會(huì)使β-胡蘿卜素的裝載率越高。選取的4 種易揮發(fā)有機(jī)試劑，其中二氯甲烷的沸點(diǎn)是39.5 ℃，石油醚的沸程在40～80 ℃之間，相比之下二氯甲烷比石油醚更易揮發(fā)，易揮發(fā)的有機(jī)溶劑殘留在氧化淀粉水凝膠微球中的可能

性更小。因而選擇二氯甲烷作為溶解β-胡蘿卜素的有機(jī)溶劑。為避免有機(jī)試劑殘留影響載體的食品安全性，利用體系中通入純氧干燥水凝膠淀粉球，既可以保證Fe3＋的穩(wěn)定性，也可以充分揮發(fā)有機(jī)試劑，避免其殘留。水凝膠球中內(nèi)部包埋的有機(jī)試劑揮發(fā)使得β-胡蘿卜素結(jié)晶在氧化淀粉球網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中，達(dá)到裝載的目的。

2.3 氧化淀粉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)的選擇

圖 4 不同氧化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)包埋β-胡蘿卜素的氧化淀粉微凝膠光學(xué)圖像Fig. 4 Optical images of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene with different concentrations of oxidized starch

如圖4所示，當(dāng)氧化淀粉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、2%時(shí)，聚合物松散無(wú)形，不能形成球形完整的氧化淀粉微球。這種現(xiàn)象表明氧化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)低時(shí)，雙重乳液不穩(wěn)定，無(wú)法形成完整球形，內(nèi)部初乳容易逃逸到外油相石蠟中，使得β-胡蘿卜素的裝載率降低。當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于3%時(shí)，即可形成球形完好的氧化淀粉水凝膠微球，且隨著氧化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加，雙重乳液相較穩(wěn)定，鐵交聯(lián)氧化淀粉形成的微球球形完整。另外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，氧化淀粉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，形成微球時(shí)間越短，交聯(lián)反應(yīng)越容易，形成的微球結(jié)構(gòu)也越致密緊實(shí)?？梢?jiàn)，氧化淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)是形成穩(wěn)定的氧化淀粉微球的重要因素。因此，10%作為最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)制備淀粉凝膠球。

2.4 交聯(lián)劑使用量的選擇

氧化淀粉水凝膠微球形成依賴(lài)于Fe3＋與氧化淀粉上羧基的配位交聯(lián)，金屬離子與糖之間的相互作用已經(jīng)被廣泛研究。例如，利用Fe3＋與蔗糖、葡聚糖或淀粉等相互作用研發(fā)新的補(bǔ)鐵劑，研究表明糖類(lèi)能夠穩(wěn)定三價(jià)鐵氧化物，提高鐵的利用率[27]。這種相互作用也廣泛應(yīng)用于藻酸鹽水凝膠的形成，海藻酸是β-D-甘露糖醛酸（M）與α-L-古洛糖醛酸（G）通過(guò)1,4-糖苷鍵共價(jià)結(jié)合形成的，金屬陽(yáng)離子如Ca2＋、Sr2＋、Ba2＋等鰲合藻酸鹽的β-羧酸鹽基團(tuán)形成離子型水凝膠[28]。其中在海藻酸鹽分子鏈中的古洛糖醛酸區(qū)（G）更容易與Ca2＋相互作用，兩條海藻酸鹽分子鏈中的古洛糖醛酸塊間結(jié)合Ca2＋后形成一個(gè)洞狀親水區(qū)域，還會(huì)與α-L-古洛糖醛酸區(qū)（G）片段上的O原子發(fā)生螯合作用形成“蛋盒”形穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[29]。但是Ca2＋與氧化淀粉中羧基間的作用與鈣與海藻酸鹽的作用不同，Ca2＋不能與氧化淀粉中的羧基形成“蛋盒”模型，導(dǎo)致Ca2＋交聯(lián)的氧化淀粉微球并不穩(wěn)定[30]。

圖 5 不同羧基與鐵物質(zhì)的量比的氧化淀粉微膠囊包覆β-胡蘿卜素光學(xué)圖像Fig. 5 Optical images of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene with different molar ratios of carboxyl group to Fe3+

Fe3＋也可以交聯(lián)形成穩(wěn)定的藻酸鹽水凝膠可應(yīng)用于細(xì)胞培養(yǎng)，比Ca2＋交聯(lián)的凝膠細(xì)胞黏附力更強(qiáng)。雖然Fe2＋也有能力交聯(lián)海藻酸鹽，但它是一種“軟”金屬陽(yáng)離子，傾向于結(jié)合含有氮和硫的中性配體原子。相反，F(xiàn)e3＋是“硬”金屬陽(yáng)離子的典型代表，優(yōu)先結(jié)合氧原子以及帶負(fù)電荷的配體如羧酸鹽、酚鹽或異羥肟酸酯組分[31]。本研究在體系中通入氧氣將Fe2＋氧化為Fe3＋，利用Fe3＋與氧化淀粉上的羧基進(jìn)行交聯(lián)形成氧化淀粉水凝膠球。參考Chen Xiaodong等[25]對(duì)鐵交聯(lián)的魔芋多糖微球的研究中羧基與鐵最佳物質(zhì)的量比為8.61∶1。如圖5所示，不同交聯(lián)劑用量均可以形成一定量的微球。但是在羧基和FeSO4·7H2O物質(zhì)的量比為9.17∶1與6.61∶1時(shí)制備的微球經(jīng)冷凍干燥處理后微球發(fā)生破碎，說(shuō)明交聯(lián)度越小微球越脆弱。如圖5E所示，當(dāng)交聯(lián)劑的量過(guò)高時(shí)，形成結(jié)構(gòu)過(guò)于穩(wěn)定的微球，在弱堿溶液中不易破損，無(wú)法釋放裝載的β-胡蘿卜素。羧基與鐵的物質(zhì)的量比為4.58∶1時(shí)制得的氧化淀粉水凝膠球最為合適。

2.5 裝載β-胡蘿卜素的氧化淀粉水凝膠微球的表征

圖 6 裝載β-胡蘿卜素的氧化淀粉微球SEM圖Fig. 6 SEM photographs of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene

如圖6所示，3%氧化淀粉形成的微球表面十分疏松，貌似“爆米花”狀，具有較大的比表面積。而10%的氧化淀粉微球的表面有較多孔隙，這是微球在干燥時(shí)二氯甲烷揮發(fā)所導(dǎo)致的。另外，3%氧化淀粉制得的微球?qū)Ζ?胡蘿卜素裝載率為（14±2.4）%，而10%的氧化淀粉微球的裝載率為（29±3.2）%，這是由于3%氧化淀粉制得的微球不如10%氧化淀粉制得的微球穩(wěn)定，有機(jī)試劑揮發(fā)時(shí)對(duì)微球表面影響很大。同時(shí)，低質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氧化淀粉交聯(lián)速度較慢，需要更長(zhǎng)的交聯(lián)時(shí)間，內(nèi)油相逃逸到外油相的可能性更大，降低了β-胡蘿卜素的裝載率?？紤]到3%氧化淀粉制得的微球比表面積較大，結(jié)構(gòu)疏松多孔，在吸附方面具有一定前景，可以吸附蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物活性物質(zhì)等，繼續(xù)發(fā)揮氧化淀粉水凝膠載體的優(yōu)越性[32]。圖6B顯示，10%氧化淀粉制得的微球的粒徑主要分布在5～10 μm之間，而馬爾文粒徑儀測(cè)得的粒徑為（15.2±2.1）μm，這是因?yàn)榈矸塾H水能力強(qiáng)，氧化淀粉水凝膠微球具有一定的吸水膨脹率，在水溶液中吸水膨脹，表現(xiàn)為更大的粒徑。

2.6 β-胡蘿卜素在氧化淀粉水凝膠微球的分布

通過(guò)限域結(jié)晶法成功制得氧化淀粉水凝膠微球，利用共聚焦熒光顯微鏡觀(guān)察β-胡蘿卜素在其中的分布，由于β-胡蘿卜素是天然的熒光分子，可直接進(jìn)行觀(guān)察。由圖7A所示，氧化水凝膠微球內(nèi)部含有來(lái)自β-胡蘿卜素的熒光，證明淀粉球?qū)ζ溲b載能力。選取其中單個(gè)微球利用Image J分析熒光強(qiáng)度分布，如圖7B所示，β-胡蘿卜素均勻分布于淀粉水凝膠球內(nèi)部。氧化淀粉水凝膠可以很好地分散在水中，因而可以有效提高β-胡蘿卜素在水中的分散性，Kim等[33]將含有β-胡蘿卜素的乙醇逐滴添加到淀粉糊中，依靠非特異性作用力將β-胡蘿卜素包封在分散性良好的淀粉復(fù)合物中（粒徑＜900 nm）。但是單純的混合使得淀粉對(duì)β-胡蘿卜素保護(hù)作用變?nèi)酰冶Ａ袈蔬^(guò)低。

圖 7 裝載β-胡蘿卜素的氧化淀粉微球共聚焦圖Fig. 7 CLSM image and fluorescence intensity distribution of oxidized starch hydrogels encapsulating β-carotene

Boon等[34]研究發(fā)現(xiàn)乳液的pH值對(duì)包埋活性物質(zhì)的穩(wěn)定性具有顯著影響，在pH 4及以下的乳液中快速降解。在模擬胃環(huán)境中（pH＜2），納米乳劑中的β-胡蘿卜素降解更快[35]。相比較乳液體系而言，在低pH值條件時(shí)Fe3＋更為穩(wěn)定地交聯(lián)淀粉，使得氧化淀粉水凝膠微球在很大程度上不受胃酸的影響，保護(hù)微球中β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性。當(dāng)氧化淀粉水凝膠置于腸道堿性環(huán)境中，交聯(lián)劑Fe3＋不穩(wěn)定易形成沉淀，使得淀粉水凝膠球逐漸破裂釋放出里面裝載的β-胡蘿卜素，達(dá)到活性化合物的腸道響應(yīng)性釋放的目的。Wang Shanshan等[36]研究表明氧化淀粉微球在腸環(huán)境中特異性釋放β-胡蘿卜素，且有效改善裝載活性分子的熱穩(wěn)定性與貯藏穩(wěn)定性。Shi Mengxuan等[37]同樣利用Fe3＋交聯(lián)氧化魔芋葡甘聚糖上的羧基，并利用殼聚糖作為涂層開(kāi)發(fā)了負(fù)載多種抗氧化劑的pH值響應(yīng)微球，應(yīng)用于腸道特異性遞送。綜上所述，氧化淀粉水凝膠微球具有腸特異性釋放β-胡蘿卜素的潛力。

3 結(jié) 論

本研究通過(guò)限域結(jié)晶法，即利用可揮發(fā)的有機(jī)溶劑有效提高β-胡蘿卜素的溶解度，將β-胡蘿卜素限制于交聯(lián)后的氧化淀粉球內(nèi)以提高其裝載率，制得粒徑均勻的氧化淀粉水凝膠微球，能夠提高β-胡蘿卜素的穩(wěn)定性、水溶解性與分散性，并在堿性環(huán)境中如腸環(huán)境中釋放出裝載的β-胡蘿卜素，提高其生物利用率。因使用的有機(jī)溶劑易揮發(fā)，避免有機(jī)溶劑對(duì)食品安全性的影響。另外，探究不同有機(jī)溶劑、質(zhì)量分?jǐn)?shù)氧化淀粉溶液、交聯(lián)劑使用量對(duì)形成氧化淀粉水凝膠的影響，選擇制備氧化淀粉水凝膠的最佳條件?？紤]到β-胡蘿卜素的溶解度以及有機(jī)溶劑的揮發(fā)性，選擇二氯甲烷為內(nèi)油相（O1），氧化淀粉溶液質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%時(shí)，制得的淀粉球孔徑較小，轉(zhuǎn)載率高；當(dāng)氧化淀粉上的羧基與交聯(lián)劑Fe3＋的比例為4.58∶1時(shí)，制得的淀粉球穩(wěn)定且易于在堿性環(huán)境中釋放出裝載的β-胡蘿卜素。這種氧化淀粉水凝膠球可以進(jìn)一步發(fā)揮淀粉載體價(jià)廉、無(wú)毒、水溶性好的優(yōu)勢(shì)，提高生物活性物質(zhì)的穩(wěn)定性與生物利用率，擴(kuò)大脂溶性化合物的使用范圍，可以為設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)新一代功能食品載體提供一定的理論依據(jù)。