新型吸附劑-固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定魚塘水中21種常見農(nóng)藥

劉 民，徐樞雅

(揚(yáng)州市公安局刑警察支隊(duì),揚(yáng)州225009)

魚塘投毒造成大量魚蝦死亡的案例每年都有發(fā)生,由于魚塘水體積較大,水中毒藥含量極低,要想取得較可靠的結(jié)果,必須對(duì)大量魚塘水進(jìn)行前處理。傳統(tǒng)液液提取法或固相萃取小柱法不僅操作煩瑣、耗時(shí),還得不到滿意結(jié)果,在此類案件中常束手無策。

本工作以辛烷基硅烷鍵合硅膠(C8)、十八烷基硅烷鍵合硅膠(C18)、聚二乙烯苯多孔小球GDX403[1]、大孔吸附樹脂 X-5 等4 種填料混合而成的固相萃取吸附劑對(duì)常見的21 種農(nóng)藥進(jìn)行富集[2-4],然后采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)進(jìn)行測(cè)定。本工作采用的前處理方法(新型吸附劑-固相萃取)簡潔、方便,具有一定創(chuàng)新性,可為實(shí)驗(yàn)室對(duì)大體積水樣的前處理提供技術(shù)指南。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

AB Qtrap 4000型質(zhì)譜儀、島津LC-30AD 型超高效液相色譜儀;Turbo VapⅡ型自動(dòng)氮吹濃縮儀;HY-2 型振蕩器;Vortex-Genie 2 型漩渦混合器;MILLIPAK 型 純 水 儀 ;Maximum Vacuum 型 真空泵。

21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別吸取21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各適量,或用甲醇稀釋,配制成1．0 g·L－121種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。

21種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:取上述21種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液各100μL 至10 m L 容量瓶中,用甲醇定容,配制成10 mg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)中所用其余質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液均從上述混合標(biāo)準(zhǔn)溶液用甲醇稀釋而得。

內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取普羅迪芬鹽酸鹽(SKF525A)和苯巴比妥適量,用甲醇配制成兩種質(zhì)量濃度均為1．0 g·L－1的內(nèi)標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液待用。

內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液:分別取50μL SKF525A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液和200μL 苯巴比妥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液至100 m L容量瓶中,用甲醇定溶,配制成含SKF525A 0．5 mg·L－1和苯巴比妥2 mg·L－1的內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

硫丹Ⅱ、氯硝柳胺、硫丹硫酸酯、魚藤酮、甲氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯、氯氰菊酯等21種標(biāo)準(zhǔn)品均為1．0 g·L－1或2．0 g·L－1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液;內(nèi)標(biāo)物SKF525A 的純度為95%,內(nèi)標(biāo)物苯巴比妥的純度為98%。

乙腈、甲醇、甲酸均為色譜純;乙酸銨為分析純;C8(58～75μm)、C18(58～75μm)、聚二乙烯苯多孔小球GDX-403(150～180μm)、大孔吸附樹脂X-5(1．08～2．00 mm,含水量65%～75%);試驗(yàn)用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

1．2．1 色譜條件

InertSustain C18色譜柱(2．1 mm×50 mm,2μm);柱溫35℃;流量400μL·min－1;進(jìn)樣量5μL。

1)洗脫條件1 流動(dòng)相:A 為含0．1%(體積分?jǐn)?shù),下同)甲酸的20 mmol·L－1乙酸銨溶液,B為乙腈。梯度洗脫程序:初始流動(dòng)相B 為10%,保持1 min;2～10 min 時(shí),B 由10%升至70%;10～11 min時(shí),B 由70%升至90%,保持2 min;13～14 min時(shí),B由90%降至10%,保持2 min。

2)洗脫條件2 流動(dòng)相:A 為含0．1%甲酸的20 mmol·L－1乙酸銨溶液,B為甲醇。梯度洗脫程序:初始流動(dòng)相B 為90%,保持1 min;1～2 min時(shí),B由90%升至96%,保持2 min;4～5 min時(shí),B由96%降至90%,保持2 min。

3)洗脫條件3 流動(dòng)相:A 為20 mmol·L－1乙酸銨溶液,B為甲醇。梯度洗脫程序:初始流動(dòng)相B為50%,保持2 min;2～3 min時(shí),B由50%升至95%,保持2 min;5～6 min 時(shí),B 由 95%降至50%,保持1 min。

1．2．2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI),正離子和負(fù)離子模式,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式,霧化氣和脫溶劑氣為氮?dú)?碰撞氣為氮?dú)?氣簾氣壓力172．5 k Pa;離子噴射電壓5 500 V(－4 500 V);霧化氣溫度500℃;霧化氣壓力345．0 k Pa,輔助加熱氣壓力345．0 k Pa;入口電壓10 V(－10 V),碰撞氣出口電壓15 V(－15 V)。對(duì)其余質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化[5],見表1。

表1 21種常見農(nóng)藥及2種內(nèi)標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)Tab．1 MS parameters of the 21 common pesticides and the 2 internal standards

表1(續(xù))

1．3 試驗(yàn)方法

取魚塘水樣4 L于5 000 m L燒瓶內(nèi),添加內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL;稱取由C8、C18、GDX403和X-5按1∶2∶1∶8的質(zhì)量比混合而成的吸附劑6 g,經(jīng)10 m L 甲醇浸泡活化、過濾后,加入到上述水樣中;將燒瓶固定在振蕩器上振蕩約1 h,用布氏漏斗抽濾,將收集到的固相吸附劑連同濾紙一起放入250 m L錐形瓶中,加入5 g無水硫酸鎂和苯、乙酸乙酯各100 m L,振蕩10 min后,用1．0μm 微孔有機(jī)濾膜過濾,將濾液吹氮至近干,加入1 m L甲醇定容、0．22μm 微孔有機(jī)濾膜過濾,濾液按儀器工作條件進(jìn)行測(cè)定[6]。

2 結(jié)果與討論

2．1 色譜條件的選擇

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),流動(dòng)相梯度變化大,以乙腈作流動(dòng)相B,按洗脫條件1進(jìn)行洗脫時(shí),可分離的農(nóng)藥種類較多,適用魚藤酮等6種目標(biāo)物的測(cè)定;但按洗脫條件1進(jìn)行洗脫時(shí),甲氰菊酯等12種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥分離效果差甚至不出峰;而使用色譜條件2測(cè)定時(shí),擬除蟲菊酯類農(nóng)藥靈敏度高、峰形好,說明含0．1%甲酸的20 mmol·L－1乙酸銨溶液-甲醇的出峰效果優(yōu)于含0．1%甲酸的20 mmol·L－1乙酸銨溶液-乙腈流動(dòng)相[7],試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn),梯度洗脫時(shí),初始流動(dòng)相中甲醇含量要高[8],否則擬除蟲菊酯類農(nóng)藥不出峰。洗脫條件3的流動(dòng)相B為50%～95%,有效地避免了目標(biāo)物出峰時(shí)間過早或過遲,適用于硫丹Ⅱ等3種農(nóng)藥的測(cè)定。因此,試驗(yàn)選擇了3種洗脫條件,色譜圖見圖1。

2．2 質(zhì)譜條件的選擇

硫丹為實(shí)際魚塘投毒案件中最常見毒物之一,前期大量UPLC-MS/MS試驗(yàn)結(jié)果表明[9],硫丹Ⅰ和硫丹Ⅱ的定量離子對(duì)和定性離子對(duì)、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)和保留時(shí)間均相同,雖然同含量硫丹Ⅰ和硫丹Ⅱ的相同定量離子對(duì)或相同定性離子對(duì)的峰強(qiáng)度有差異,但硫丹Ⅰ的定性離子對(duì)/定量離子對(duì)和硫丹Ⅱ的定性離子對(duì)/定量離子對(duì)的豐度比一致,硫丹Ⅱ的定性離子對(duì)或定量離子對(duì)峰強(qiáng)度更高。綜合考慮,試驗(yàn)選擇硫丹Ⅱ作為分析對(duì)象。

21種常見農(nóng)藥中,硫丹Ⅱ等3種農(nóng)藥因在電離時(shí)更容易失去質(zhì)子,需采用負(fù)離子模式進(jìn)行測(cè)定。內(nèi)標(biāo)物苯巴比妥也選擇負(fù)離子模式。

因擬除蟲菊酯類農(nóng)藥測(cè)定難度較大,本試驗(yàn)采用針泵注射方式,對(duì)12種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行一級(jí)全掃描,發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯等7種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥在正離子模式下的分子離子峰豐度最大。因此,這7種物質(zhì)的母離子選擇了],剩下5種擬除蟲菊酯類農(nóng)藥和其他6種農(nóng)藥及內(nèi)標(biāo)物SKF525A 的母離子均選擇了[M＋H＋]。

2．3 固相萃取劑的選擇

圖1 21種常見農(nóng)藥的色譜圖Fig．1 Chromatograms of the 21 common pesticides

本工作采用由4種常見填料相混的混合物進(jìn)行試驗(yàn)[10-12],C8、C18、GDX403 和 X-5 按1∶2∶1∶8的質(zhì)量比混合。分別稱取C8、C18、GDX403各2 g,X-5、混合填料各6 g,考察了 C8、C18、GDX403、X-5和混合填料等5種填料對(duì)19種目標(biāo)物的提取效果,具體方法為:取空白水樣4 L 共10份,各添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液200μL,得到水樣中19種目標(biāo)物的質(zhì)量濃度均為0．5μg·L－1,再加入內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL;然后分別加入5種填料,每種填料有兩個(gè)平行樣,按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,19種目標(biāo)物定量離子對(duì)峰面積為A1。另取空白水樣4 L 共10份,不添加混合標(biāo)準(zhǔn)樣品,分別加5種填料,每種填料有兩個(gè)平行樣,在濾液吹氮縮至近干后,加1 m L含100μL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液及100μL 內(nèi)標(biāo)物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的甲醇溶液定容,在儀器工作條件下測(cè)定,19種目標(biāo)物定量離子對(duì)峰面積為A2。每次操作前,均取相應(yīng)固相填料加入空白水樣(4 L)進(jìn)行空白比對(duì),確保無干擾、無殘留?；厥章蕿锳1/A2,如果2個(gè)平行樣回收率的相對(duì)差值在5%之內(nèi),說明測(cè)定結(jié)果有效,取2次結(jié)果的平均值;否則,應(yīng)重新測(cè)定。結(jié)果見表2。

表2 使用5種不同固相填料作為吸附劑時(shí)19種常見農(nóng)藥的回收率Tab．2 Recovery of 21 common pesticides with 5 different fillers as adsorbents %

由表2 可知:當(dāng)使用單一填料進(jìn)行提取時(shí),19種常見農(nóng)藥的回收率有高有低;當(dāng)使用混合填料進(jìn)行提取時(shí),19種常見農(nóng)藥的回收率與其他4種單一填料中回收率最高的相接近。因魚塘投毒案件中毒物種類的不確定性,在檢驗(yàn)中使用單一填料進(jìn)行前處理,往往出現(xiàn)一種或多種目標(biāo)物回收率極低甚至無法檢出等情況,不能滿足實(shí)際要求。

2．4 工作曲線

取空白水樣4 L,添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成質(zhì)量濃 度 為 0．5,0．25,0．1,0．05,0．025,0．01,0．005μg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定。

21種目標(biāo)物定量離子對(duì)峰面積為A3、內(nèi)標(biāo)定量離子對(duì)峰面積為A4,每次試驗(yàn)均用混合填料對(duì)空白水樣進(jìn)行空白比對(duì),確保無干擾、無殘留。以21種常見農(nóng)藥的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),其對(duì)應(yīng)的A3/A4結(jié)果為縱坐標(biāo)繪制工作曲線,線性范圍、線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

表3 線性范圍、線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)Tab．3 Linear ranges，linear regression equations and correlation coefficients

2．5 檢出限

取6份空白水樣(4 L),其中3份分別添加不同量的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成含21種目標(biāo)物質(zhì)量濃度為0．001,0．002,0．005μg·L－1待測(cè)液,另3份空白水樣作空白比對(duì),按試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,按3倍信噪比計(jì)算檢出限(3S/N),結(jié)果見表4,同時(shí)和氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)所得的檢出限作比對(duì),結(jié)果見表4。

表4 GC-MS和UPLC-MS/MS對(duì)21種農(nóng)藥的檢出限Tab．4 Detection limits of 21 common pesticides found by GC-MS and UPLC-MS/MS

由表4 結(jié)果表明:新型吸附型-固相萃取-UPLC-MS/MS 測(cè)定水中21 種農(nóng)藥檢出限為1～5 ng·L－1,遠(yuǎn)低于GC-MS的檢出限。實(shí)際魚塘投毒案件中的毒物檢驗(yàn),因目標(biāo)物的不確定性,液相色譜-質(zhì)譜法與氣相色譜-質(zhì)譜法各具優(yōu)勢(shì)[13],建議二種方法同時(shí)使用。

2．6 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

按試驗(yàn)方法對(duì)空白水樣(4 L)進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn),分別添加低、中、高等3個(gè)濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,配制成質(zhì)量濃度分別為0．025,0．05,0．5μg·L－1的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液各6份。以測(cè)定值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)考察日內(nèi)精密度;以連續(xù)測(cè)定5 d的結(jié)果的RSD 考察日間精密度,以加標(biāo)的每種目標(biāo)物測(cè)得的質(zhì)量濃度的平均值與此目標(biāo)物的理論質(zhì)量濃度的百分比考察方法的準(zhǔn)確度[14-15],精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 21種農(nóng)藥的精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)Tab．5 Results of tests for precision and accurary of the 21 common pesticides(n＝6)

由表5 可知:21 種常見農(nóng)藥的日內(nèi)RSD 為1．3%～9．7%,日間 RSD 為2．5%～13%,準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果為92．5%～106%。

2．7 樣品分析

2018年12月,揚(yáng)州某地區(qū)發(fā)生一起魚塘內(nèi)魚大量死亡的案件,用本方法從送檢的魚塘水中檢出了農(nóng)藥氯硝柳胺成分。經(jīng)查,本案件系事主誤將主成分為氯硝柳胺清塘劑投入魚塘中所致。

2019年2月,某公安分局接到一起魚塘疑似投毒案件,用本方法從送檢的魚塘水中檢出了農(nóng)藥氯氰菊酯成分,其質(zhì)量濃度為0．44μg·L－1,經(jīng)查,本案件是由嫌疑人投放農(nóng)藥氯氰菊酯所致,檢測(cè)出魚塘水中氯氰菊酯的含量與根據(jù)嫌疑人交代的投放氯氰菊酯的量和魚塘面積估計(jì)出的基本一致。

本工作采用的前處理方法新型吸附劑-固相萃取具有一定創(chuàng)新性,但實(shí)際應(yīng)用中還有許多待改進(jìn)之處,如不借助任何儀器設(shè)備就能快速地將固相填料從大體積水中分離出來,這將是固相萃取-填料薈萃法得到廣泛應(yīng)用的關(guān)鍵。