固相萃取-離子色譜法測(cè)定血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸

趙志東，孟 嬌，張顯強(qiáng)，王曉卉

(1．貴州警察學(xué)院 實(shí)驗(yàn)中心,貴陽(yáng)550005; 2．貴州警察學(xué)院 法律系,貴陽(yáng)550005;3．貴州警察學(xué)院 刑技系,貴陽(yáng)550005)

草甘膦是目前世界上使用量最大的除草劑之一,被廣泛應(yīng)用于控制農(nóng)田或非耕作用地中一年生或多年生雜草的生長(zhǎng)[1]。草甘膦是一種生物蛋白質(zhì)合成抑制劑,其通過(guò)抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸鹽合成酶(EPSPs)的活性,使植物體內(nèi)蛋白質(zhì)合成受阻,致使植物死亡[2]。草甘膦原藥在美國(guó)毒性分級(jí)中被評(píng)定為III,被認(rèn)為是相對(duì)較安全的農(nóng)藥,但經(jīng)商品化改造的草甘膦的毒性是前者的數(shù)倍[3],會(huì)造成人體上皮細(xì)胞膜的損傷[4]、細(xì)胞中的血漿損傷和線粒體功能受損[5],甚至有致癌的風(fēng)險(xiǎn)。

目前草甘膦的測(cè)定方法主要有分光光度法[6-7]、高效液相色譜熒光法[8-11]、離子色譜法[12-14]、氣相色譜-質(zhì)譜法[15-16]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[17-21]等。檢測(cè)對(duì)象多為水、農(nóng)產(chǎn)品、蔬菜等,對(duì)人血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的檢測(cè)鮮見(jiàn)報(bào)道[12]。本工作用乙腈沉淀蛋白后,通過(guò)3個(gè)不同的固相萃取柱對(duì)血液進(jìn)行凈化,然后用離子色譜法對(duì)其進(jìn)行了分析,以期滿足對(duì)血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的檢測(cè)需要。

1 試驗(yàn)部分

1．1 儀器與試劑

Dionex Aquion型陰陽(yáng)離子色譜儀,配Dionex AERS-300 4 mm 陰離子抑制器;MS3 basic型渦旋混合器;KQ 500DE 型數(shù)控超聲波清洗器;PUERLAB Ultra ELGA 型純水儀;TGL-16C 型離心機(jī);島津AUW 320型電子天平。

Dionex On GuardⅡ固相萃取柱,包括ionex On GuardⅡRP 柱 (RP 柱,1．0 m L)、Dionex On GuardⅡAg柱(Ag柱,1．0 m L)和Dionex On GuardⅡNa柱(Na柱,1．0 m L)。

混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:稱取草甘膦標(biāo)準(zhǔn)品102 mg和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品101 mg,用水溶解并定容至100．0 m L,得到1．0 g·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,置于4 ℃冰箱中避光保存。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列:將混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋,配制成10,20,50,100,200,500,1 000,2 000,5 000,10 000μg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列。

草甘膦和氨甲基膦酸標(biāo)準(zhǔn)品的純度分別為98%,99%。

乙腈為色譜純,試驗(yàn)用水為超純水。

1．2 儀器工作條件

采用Dionex IonPac AS-19 陰離子分析柱(250 mm×4 mm)及 IonPac AG-19 保 護(hù) 柱(50 mm×4 mm);抑制電流165 m A,流量1 m L·min－1;定量環(huán)25μL;柱箱溫度30 ℃,電導(dǎo)檢測(cè)池溫度35 ℃;采用不同濃度的氫氧化鉀溶液進(jìn)行淋洗,梯度淋洗程序:0～5 min 時(shí),氫氧化鉀濃度為10 mmol·L－1;5～13 min 時(shí),氫氧化鉀濃度為10～65 mmol·L－1;13～20 min時(shí),氫氧化鉀濃度為65 mmol·L－1;20～25min時(shí),氫氧化鉀濃度為10 mmol·L－1。

1．3 試驗(yàn)方法

用移液器移取1 m L 血液樣品,置于15 m L 塑料離心管中,分別加入5,100,1 000 mg·L－1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液100μL,再加入2 m L乙腈,用于沉淀蛋白質(zhì),最后加入水6．9 m L,振蕩5 min,以7 000 r·min－1轉(zhuǎn)速離心10 min,取上清液分別過(guò)經(jīng)活化的RP柱、Ag柱、Na柱及有機(jī)相針式濾器,去除血液中的有機(jī)相及離子,棄去前面3 m L流出液后,開(kāi)始收集濾液,在儀器工作條件下進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2．1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

固相萃取柱在使用前需要進(jìn)行活化。RP 柱用10 m L 甲 醇 和 10 m L 水 活 化,Ag 柱 和 Na 柱 用10 m L水活化,流量均為1 m L·min－1,活化時(shí)間均為30 min。

用乙腈沉淀蛋白后,血液樣品中還殘留大量脂肪、碳水化合物等有機(jī)成分,會(huì)與氫氧化鉀淋洗液發(fā)生皂化反應(yīng),造成色譜圖中基線波動(dòng),影響色譜峰峰形和定性、定量分析結(jié)果,甚至?xí)?dǎo)致儀器損傷。本工作在用乙腈沉淀蛋白后,使用了RP 柱凈化血液樣品,可除去血液中的有機(jī)成分。

人血液中大量存在的Cl－和Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金屬離子會(huì)影響草甘膦的峰形及其定性、定量分析。Ag柱通過(guò)Ag＋型磺酸樹(shù)脂可以去除Cl－,Na柱通過(guò)Na＋型磺酸樹(shù)脂可以去除Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金屬離子,保護(hù)色譜柱不被傷害。

本工作考察了使用RP 柱、RP 柱＋Ag柱、RP柱＋Ag 柱＋Na柱時(shí)對(duì)血液樣品中 Cl－和 Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金屬離子的對(duì)應(yīng)色譜峰強(qiáng)度和回收率的影響,見(jiàn)表1。

表1 經(jīng)過(guò)不同萃取柱處理后血液樣品中草甘膦和氨甲基膦酸的峰面積和回收率(n＝3)Tab．1 Peak areas and recovery of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in blood samples treated with different extraction columns(n＝3)

過(guò)RP柱＋Ag柱＋Na柱后,血液中Cl－的回收率為0．211%,而草甘膦和氨甲基膦酸的回收率均高于與99%,說(shuō)明Ag柱對(duì)Cl－的去除效果很好,且對(duì)草甘膦和氨甲基膦酸的定量結(jié)果無(wú)影響。試驗(yàn)選擇 RP 柱 ＋Ag 柱 ＋Na 柱 去 除 Cl－和 Ca2＋、Mg2＋、Ag＋等金屬離子。

2．2 色譜條件的優(yōu)化

在儀器工作條件下,使用Dionex IonPac AS-19高容量陰離子分析柱及IonPac AG-19保護(hù)柱可以實(shí)現(xiàn)血樣中草甘膦、氨甲基膦酸與等干擾組分的良好分離,草甘膦和氨甲基膦酸的保留時(shí)間分別為17．25,18．38 min。草甘膦和氨甲基膦酸的色譜圖見(jiàn)圖1。

2．3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和測(cè)定下限

按儀器工作條件對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定,分別以草甘膦的質(zhì)量濃度和氨甲基膦酸的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),兩者對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,草甘膦和氨甲基膦酸的質(zhì)量濃度均在0．01～10 mg·L－1內(nèi)與其對(duì)應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性方程分別為y＝0．056 8x＋0．001 5和y＝0．052 5x－0．003 9,相關(guān)系數(shù)分別為 0．999 3,0．999 1。

圖1 草甘膦和氨甲基膦酸的色譜圖Fig．1 Chromatograms of glyphosate and aminomethylphosphonic acid

以3倍信噪比(S/N)計(jì)算檢出限(3S/N),草甘膦和氨甲基膦酸的檢出限分別為2．88,2．36μg·L－1;以10倍信噪比計(jì)算測(cè)定下限(10S/N),草甘膦和氨甲基膦酸的測(cè)定下限分別為9．52,7．87μg·L－1。

2．4 精密度和回收試驗(yàn)

分別取0．05,1,10 mg·L－1的草甘膦和氨甲基膦酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在儀器工作條件下平行測(cè)定5次,計(jì)算測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為2．3%,1．0%,0．029% 和 6．5%,6．1%,0．032% 。

以空白血液樣品為基底,分別添加0．05,1,10 mg·L－1等3個(gè)不同濃度水平的草甘膦和氨甲基膦酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按照試驗(yàn)方法進(jìn)行測(cè)定,草甘膦回收率分別為74．0%,96．7%,99．3%,氨甲基膦酸的回收率為79．6%,95．5%,97．0%。

2．5 樣品分析

2017年6月,清鎮(zhèn)市王某與其丈夫吵架服用大量草甘膦農(nóng)藥(約300 m L),被家人送往醫(yī)院就診,提取王某血液用本法進(jìn)行測(cè)定,得到其血液中草甘膦質(zhì)量濃度為1．06 mg·L－1,氨甲基磷酸質(zhì)量濃度為0．17 mg·L－1。

本工作采用固相萃取-離子色譜法測(cè)定了血液中的草甘膦及其代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸,該方法具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn),可用于公安機(jī)關(guān)對(duì)血液中草甘膦及其代謝物氨甲基膦酸的分析。