金柑多酚提取與抗氧化活性分析

史文景，游雙紅， 胡佳羽， 江 銘， 王 昱， 繆伊雯，鄧 鑫， 羅 明， 陳 宇

（1.重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹研究所，重慶 401329；2.長江師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，重慶 408100）

金柑 （Fortunella japonica（Thunb） Swingle） 又稱金橘、金棗，屬蕓香科金柑屬植物，原產(chǎn)于我國華南地區(qū)。金柑果實(shí)體積小，形狀呈橢圓形，果肉和果皮能夠同時(shí)食用，味道酸甜，富含維C、芳香油、類胡蘿卜素、類黃酮、檸檬苦素等多種活性物質(zhì)[1]，以及鐵、鈣、鉀、鈉、鋅、銅、硒等礦質(zhì)物元素[2]，營養(yǎng)價(jià)值極高。多酚是一類酚羥基類及其衍生物的總稱，存在于多種水果中，是源于丙氨酸代謝途徑和莽草酸代謝途徑的重要次生代謝產(chǎn)物，對(duì)于植株攝取營養(yǎng)、合成蛋白質(zhì)、進(jìn)行光合作用等多種生理活動(dòng)有著重要意義，因其具有很強(qiáng)的抗氧化作用而被稱為“第七大營養(yǎng)素”[3]。豐富的多酚類物質(zhì)使金柑有很高的藥理價(jià)值，如抗氧化、抑菌、抗癌、調(diào)節(jié)免疫、降血脂和防治心腦血管疾病等功效[4]。植物多酚具有廣闊的應(yīng)用前景，已成為食品和藥品開發(fā)領(lǐng)域的熱點(diǎn)，其提取方法有溶劑萃取法[5]、超聲波提取法[6]、酶法輔助提取[7]、微波提取法[8]和超臨界流體提取法[9]等，抗氧化活性分析方法主要有DPPH自由基清除法[10]、ABTS自由基清除法[11]、鐵離子抗氧化能力法[12]等。當(dāng)前，對(duì)于金柑多酚的提取研究多集中于一種萃取溶劑，沒有對(duì)不同萃取溶劑的提取效果進(jìn)行對(duì)比分析，試驗(yàn)通過分析不同萃取溶劑對(duì)金柑多酚的提取效果及抗氧化活性影響，為金柑多酚提取方法優(yōu)化及合理利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：金柑。

試劑：抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)品（色譜純）、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 （色譜純）、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品 （色譜純）、DPPH（2,2-diphenyl-1-pricrylhydrazyl radical） ， 2,2'-azinobis（ 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） （ ABTS）和 TPTZ[2,4,6-tris（ 2-pyridyl）-s-triazine]， 上海源葉生物科技有限公司提供；其他試劑，均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市榮華儀器制造有限公司產(chǎn)品；PT-3502C型全波長酶標(biāo)分析儀，北京普天新橋技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；SB-5200BD7D型超聲波清洗儀，寧波新芒生物科技有限公司產(chǎn)品；FW-100型高速萬能粉碎機(jī)、FW-100型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海浦東榮豐科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；JA50型電子分析天平，常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司產(chǎn)品；TGC-16B型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金柑的預(yù)處理

將金柑切薄片，于70℃烘箱中烘干至恒質(zhì)量，粉碎，過80目篩，粉末收集于自封袋中，存儲(chǔ)于干燥器中備用。

1.3.2 金柑多酚提取工藝流程

準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理后的金柑粉100 g（準(zhǔn)確至0.1 g），與提取劑混合（料液比1∶15），超聲提?。?0 ℃，40 min） ， 離心 （10 000 r/min，15 min） ， 取上清液，減壓濃縮得到甲醇提取物浸膏。將浸膏溶解于200 mL蒸餾水，分別采用200 mL萃取劑（正丁醇、石油醚、乙酸乙酯、異戊醇） 進(jìn)行萃取，重復(fù)萃取3次，減壓濃縮得到提取物浸膏，然后用甲醇溶解、離心后取上清液，分別測定多酚、類黃酮含量和抗氧化活性[13]。

1.3.3 多酚含量測定

參照譚飔等人[14]方法，選取不同濃度沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品50 μL于96孔板中，然后分別加入福林酚試劑10 μL，充分混合并避光反應(yīng)6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)7%Na2CO3溶液100 μL和去離子水80 μL，充分混合后避光90 min，于波長760 nm處測定其吸光度，重復(fù)3次。以沒食子酸濃度作為橫坐標(biāo)，吸光度作為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，多酚含量以沒食子酸含量表示。

1.3.4 總黃酮的測定

參照譚飔等人[14]方法，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測定總黃酮含量。取不同濃度梯度的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品10 μL加入96孔板中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%NaNO2溶液10 μL，混合后在室溫下靜置6 min，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%NaOH溶液100 μL和體積分?jǐn)?shù)60%乙醇溶液120 μL，混勻后室溫反應(yīng)15 min，于波長510 nm處測定其吸光度，3次重復(fù)。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，黃酮含量以蘆丁當(dāng)量來表示。

1.3.5 抗氧化活性測定

（1） DPPH法。取樣品溶液和一定濃度梯度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL于96孔板中，加入0.5 mmol/L的DPPH溶液100 μL，混勻后放置30 min，于波長517 nm處測定吸光度，3次重復(fù)。以自由基清除率作為縱坐標(biāo)，抗壞血酸濃度作為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用每克樣品中抗壞血酸含量（mg/g）來表示樣品結(jié)果。

式中：A0——空白的吸光度；

A1——100 μL抗壞血酸溶液+100 μL DPPH溶液的吸光度。

（2） ABTS法。 將7 mmol/L ABTS+溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液（體積比1∶1） 混合均勻，于室溫下過夜靜置得ABTS+溶液，利用無水乙醇進(jìn)行稀釋，使其吸光度穩(wěn)定在0.7±0.02。取樣品溶液和不同濃度梯度的抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)溶液100 μL于96孔板中，加入ABTS+溶液100 μL，混勻后反應(yīng)10 min，于波長734 nm處測定吸光度，重復(fù)3次。以自由基清除率作為縱坐標(biāo)，抗壞血酸濃度作為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每克樣品干樣中抗壞血酸含量（mg/g）來表示樣品結(jié)果。

式中：A0——空白的吸光度；

A1——100 μL抗壞血酸溶液+100 μL ABTS+溶液的吸光度。

（3） 鐵離子抗氧化能力（FRAP） 法。取樣品溶液和不同濃度梯度的抗壞血酸溶液20 μL于96孔板中，加入FRAP溶液 100 μL混合，加入蒸餾水100 μL，充分混合后于37℃下水浴10 min，于波長593 nm處測定吸光度，3次重復(fù)。以吸光度作為縱坐標(biāo)，抗壞血酸濃度為作為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每克樣品干樣中抗壞血酸含量（mg/g） 來表示樣品結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

總酚、總黃酮及3種抗氧化活性檢測方法的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)（R2） 見表1。

表1 總酚、總黃酮及3種抗氧化活性檢測方法的線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù) （R2）

各標(biāo)準(zhǔn)曲線分別在 0～120 μg/mL， 0～1 500 μg/mL，0～60 μg/mL， 0～120 μg/mL， 0～120 μg/mL 線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)（R2）均不小于0.980 8，線性關(guān)系良好。

2.2 不同提取劑對(duì)金柑多酚提取效果的影響

萃取物中總酚含量比較見圖1。

如圖1所示，不同極性溶劑對(duì)金柑多酚提取效果影響較大，各萃取物總酚的含量順序?yàn)檎〈枷啵疽宜嵋阴ハ啵井愇齑枷啵臼兔严唷Ｆ渲?，正丁醇相金柑多酚的含量最高，?.128 mg/g，而石油醚相多酚含量最低，僅有0.421 mg/g。根據(jù)趙謀明等人[15]研究發(fā)現(xiàn)，梨全果中的酚類物質(zhì)含量為0.272～0.407 mg/g，柑橘總酚含量為0.406～1.694 mg/g，可以看出金柑多酚含量高于梨和柑橘的多酚含量。

2.3 不同提取劑對(duì)金柑總黃酮提取效果的影響

萃取物中總黃酮量比較見圖2。

如圖2所示，不同極性溶劑對(duì)金柑總黃酮提取效果影響較大。各萃取物總黃酮的含量順序?yàn)檎〈枷啵疽宜嵋阴ハ啵井愇齑枷啵臼兔严?。其中，正丁醇相金柑總黃酮的含量最高，為2.073 mg/g，而石油醚相的總黃酮含量最低，僅有0.206 mg/g。

2.4 不同溶劑萃取物抗氧化活性測定

2.4.1 DPPH自由基清除法

DPPH法檢測金柑不同極性萃取物的抗氧化活性見圖3。

如圖3所示，不同極性溶劑萃取金柑對(duì)DPPH自由基清除的影響較大，各萃取物的對(duì)DPPH自由基清除順序?yàn)檎〈枷啵疽宜嵋阴ハ啵井愇齑枷啵臼兔严唷Ｆ渲?，正丁醇相金柑抗氧化活性最好，每克樣品干樣中抗壞血酸含量達(dá)到3.058 mg/g，而石油醚相金柑抗氧化活性最低，每克樣品干樣中抗壞血酸含量僅有0.479 mg/g。

2.4.2 ABTS自由基清除法

ABTS法檢測金柑不同極性萃取物的抗氧化活性見圖4。

如圖4所示，不同極性溶劑萃取金柑對(duì)ABTS自由基清除的順序?yàn)檎〈枷啵疽宜嵋阴ハ啵井愇齑枷啵臼兔严?。其中，正丁醇相金柑抗氧化活性最好，? g樣品干樣中抗壞血酸含量達(dá)到3.058 mg/g，而石油醚相的金柑抗氧化活性最低，每1 g樣品干樣中抗壞血酸含量僅有0.479 mg/g。

2.4.3 FRAP法

FRAP法檢測金柑不同極性萃取物的抗氧化活性見圖5。

如圖5所示，不同極性溶劑萃取對(duì)金柑多酚還原能力影響較大，順序?yàn)橐宜嵋阴ハ啵菊〈枷啵井愇齑枷啵臼兔严唷Ｆ渲?，乙酸乙酯相金柑還原能力最好，每1 g樣品干樣中抗壞血酸含量達(dá)到5.100 mg/g，而石油醚相的還原能力最低，每1 g樣品干樣中抗壞血酸含量僅有0.231 mg/g。

綜上，金柑多酚提取物具有良好的抗氧活性，不同的抗氧化測定方法所得結(jié)果有所不同，DPPH法和ABTS法中抗氧化活性最好的是正丁醇相，而在FRAP法檢測中抗氧化活性最好的是乙酸乙酯相，造成這種差異的原因可能是不同萃取部位金柑多酚的組成成分不同。此外，多酚和黃酮含量越高其抗氧化活性也越好，表明多酚、類黃酮與抗氧化活性之間有良好的相關(guān)性。類似結(jié)果范祺等人[16]也有相關(guān)報(bào)道，表明葡萄中多酚、黃酮含量較高的品種，其抗氧化活性也較強(qiáng)。

3 結(jié)論

以金柑為原料，探究不同萃取劑種類對(duì)金柑提取物多酚提取效果的影響。結(jié)果表明，不同極性部位的總多酚和總黃酮含量差別較大，正丁醇相金柑總酚和總黃酮含量均最高，分別為4.128 mg/g和2.073 mg/g；以DPPH和ABTS自由基清除法分別測定不同金柑萃取物的自由基清除能力，結(jié)果表明正丁醇相金柑的抗氧化能力最強(qiáng)；而以FRAP法測定不同金柑萃取物的抗氧化活性，結(jié)果表明，乙酸乙酯相金柑的抗氧化能力最強(qiáng)。金柑萃取物抗氧化能力與金柑多酚含量有一定關(guān)系。