溴麝香草酚藍法測定山豆根種子生活力的條件優(yōu)化研究

檀龍顏 吳月君 何雨

摘要? ? 以山豆根種子為研究材料，以溴麝香草酚藍（BTB）濃度、培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時間為指標(biāo)，分別通過正交試驗、單因素試驗測定山豆根種子的生活力，同時用Central Composite Design響應(yīng)面分析試驗對測定條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，正交試驗的最佳測定條件為BTB濃度0.2%、培養(yǎng)溫度40 ℃、培養(yǎng)時間4 h，各因素對種子生活力測定的影響差異不顯著;單因素試驗和Central Composite Design響應(yīng)面分析試驗的最佳測定條件與正交試驗結(jié)果一致。表明用響應(yīng)面分析對BTB法測定山豆根種子生活力的條件進行優(yōu)化是可行的。

關(guān)鍵詞? ? 山豆根;種子生活力;BTB法;響應(yīng)面分析

中圖分類號? ? Q945.34? ? ? ? 文獻標(biāo)識碼? ? A

文章編號? ?1007-5739（2020）06-0074-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）

山豆根（Sophora tonkinensis）為豆科（Leguminosae）植物，以干燥根和根莖入藥，為臨床常用藥，是多種藥品的原料藥材，本身具有清熱解毒、消腫利咽的功效[1-2]。近年來，由于市場需求量的增加，野生資源遭到破壞，人工種植成為必需手段。山豆根主要采用種子繁殖，而種子生活力檢測是判斷種子是否具有繁殖價值的首選手段。因此，本研究采用正交試驗、單因素試驗及Central Composite Design響應(yīng)面試驗對BTB法測定山豆根種子生活力的條件進行優(yōu)化，以期為后續(xù)種子研究和應(yīng)用推廣提供參考依據(jù)。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗材料

于2018年9月30日從安順市紫云縣貓營鎮(zhèn)山豆根種繁基地采集種子，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院副教授檀龍顏鑒定為豆科植物山豆根種子。室內(nèi)陰干后，于4 ℃保存?zhèn)溆谩７N子生活力測定試劑為溴麝香草酚藍（BTB）。

1.2? ? 試驗方法

1.2.1? ? 種子處理。去除種子中的雜質(zhì)，選取無破損的種子置于燒杯中浸泡24 h后，將種皮剝除。

1.2.2? ? 培養(yǎng)基制備。選取直徑12 cm的培養(yǎng)皿，每個培養(yǎng)皿中倒入20 mL含0.1%瓊脂的BTB培養(yǎng)基。

1.2.3? ? 種子生活力測定。每個培養(yǎng)皿分別擺放50粒去皮種子，避光置于不同溫度和時間條件下培養(yǎng)，相應(yīng)對照培養(yǎng)皿中的種子置于沸水浴10 min后培養(yǎng)，以種子附近黃色暈圈的有無、大小和顏色深淺確定生活力大小。

1.2.4? ? 正交試驗。選取BTB濃度（A）（0.10%、0.15%、0.20%）、培養(yǎng)溫度（B）（30、35、40 ℃）、培養(yǎng)時間（C）（2、3、4 h）為指標(biāo)，每組50粒去皮種子，設(shè)計正交試驗。

1.2.5? ? 單因素試驗。①培養(yǎng)溫度試驗：取50粒去皮種子，BTB濃度設(shè)置為0.15%，培養(yǎng)時間設(shè)置為3 h，培養(yǎng)溫度設(shè)置25、30、35、40、45 ℃等5個水平。②培養(yǎng)時間試驗：取50粒去皮種子，BTB濃度設(shè)置為0.15%，培養(yǎng)溫度設(shè)置為40 ℃，培養(yǎng)時間設(shè)置1、2、3、4、5 h等5個水平。③BTB濃度試驗：取50粒去皮種子，培養(yǎng)溫度設(shè)置為40 ℃，培養(yǎng)時間設(shè)置為4 h，BTB濃度設(shè)置為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%等5個水平。

1.2.6? ? 響應(yīng)面分析試驗。以BTB濃度（A）、培養(yǎng)溫度（B）、培養(yǎng)時間（C）為變量，根據(jù)Central Composite Design設(shè)計原理，設(shè)計3因素5水平試驗。每個處理50粒去皮種子。以種子生活力為響應(yīng)值進行響應(yīng)面分析。

1.3? ? 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0和Design Expert 8.0.6進行數(shù)據(jù)分析。

2? ? 結(jié)果與分析

2.1? ? 正交試驗結(jié)果

各條件下山豆根種子生活力如下。0.1%×30 ℃×2 h：38.00%;0.1%×35 ℃×4 h：80.67%;0.1%×40 ℃×3 h：81.67%;0.15%×35 ℃×3 h：95.33%;0.15%×30 ℃×4 h：94.67%;0.15%×40 ℃×2 h：74.67%;0.2%×40 ℃×4 h：100.00%;0.2%×30 ℃×3 h：88.00%;0.2%×35 ℃×2 h：86.00%。測定條件0.2%×40 ℃×4 h的種子生活力最高，為100.00%;0.1%×30 ℃×2 h的種子生活力最低，為38.00%（表1）。方差分析顯示各因素間差異不顯著（表2）。

2.2? ? 單因素試驗結(jié)果

從表3可以看出，山豆根種子在培養(yǎng)溫度25～40 ℃之間，生活力逐漸增大，40 ℃以后平穩(wěn)，但45 ℃時暈圈顏色過度，不易觀察，因而確定40 ℃為山豆根種子生活力BTB測定法的最佳培養(yǎng)溫度。從表4可以看出，山豆根種子在培養(yǎng)時間1～4 h之間，生活力逐漸增大，5 h以后平穩(wěn)，但培養(yǎng)5 h的種子培養(yǎng)基暈圈顏色過度，不易觀察，因而確定4 h為山豆根種子生活力BTB測定法的最佳培養(yǎng)時間。從表5可以看出，山豆根種子在BTB濃度0.05%～0.20%之間，生活力逐漸增大，但BTB濃度為0.25%的種子培養(yǎng)基暈圈顏色過度，不易觀察，因而確定0.20%為山豆根種子生活力BTB測定法的最佳BTB濃度。因此，單因素試驗下山豆根種子生活力BTB測定法的最佳條件為0.20%×40 ℃×4 h，該結(jié)果與正交試驗結(jié)果一致。

2.3? ? 響應(yīng)面試驗

2.3.1? ? 模型的建立與分析。表6為基于Central Composite Design試驗設(shè)計及結(jié)果，將表6結(jié)果數(shù)據(jù)進行多元回歸分析，結(jié)果見表7。經(jīng)回歸分析得回歸方程：Y=94.88+24.42A+20.42B+18.91C-13.67AB-1.67AC-28.33BC-20.24A2-16.24B2-17.90C2。從表7可知，模型F值=133.46，且P<0.000 1，表明模型差異極顯著。校正決定系數(shù)R2adj=0.984 3，相關(guān)系數(shù)R2=0.991 7，表明該模型的擬合度較好，可用于種子生活力的理論預(yù)測。模型的變異系數(shù)為2.89%（<10%），表明模型穩(wěn)定性良好，試驗操作可靠。模型的信噪比為37.474（>4），表明該模型能真實地反映試驗結(jié)果。模型系數(shù)的顯著性檢驗表明，A、B、C各因素對山豆根種子生活力測定影響差異極顯著，且各因素的影響順序為BTB濃度>培養(yǎng)溫度>培養(yǎng)時間。

2.3.2? ? 響應(yīng)面分析。由圖1可以看出，培養(yǎng)溫度與培養(yǎng)時間的交互作用對響應(yīng)值影響最大，響應(yīng)面的傾斜度最高，其次是BTB濃度與培養(yǎng)溫度（圖2），最后是BTB濃度與培養(yǎng)時間（圖3）。通過響應(yīng)面分析優(yōu)化，山豆根種子生活力BTB法測定的最佳條件為0.2%×40 ℃×4 h，此條件下，理論預(yù)測種子生活力為102.24%。在此條件下，進行驗證，重復(fù)3次，實測種子生活力為100%。實測值與理論預(yù)測值的誤差為2.24%（<5%）。因此，應(yīng)用Central Composite Design響應(yīng)面分析優(yōu)化山豆根種子生活力BTB法測定條件是可行的。

3? ? 結(jié)論與討論

王? 進等[3]以0.1% BTB、培養(yǎng)溫度35 ℃和培養(yǎng)時間5 h為條件測定了鎖陽（Cynomorium songaria）種子的生活力。本文對山豆根種子生活力測定發(fā)現(xiàn)，與鎖陽種子生活力差異較大，因而對不同藥用植物種子而言，3種因素對種子生活力測定的影響是不同的。響應(yīng)面分析優(yōu)化試驗設(shè)計可補充正交試驗設(shè)計和單因素試驗設(shè)計的不足，使試驗簡便、精確、省力。

本文中響應(yīng)面分析優(yōu)化山豆根種子生活力測定的最佳條件為0.2%（BTB濃度）×40 ℃（培養(yǎng)溫度）×4 h（培養(yǎng)時間），與正交試驗和單因素試驗的結(jié)果一致。在羊耳菊（Inula cappa）種子[4]和頭花蓼（Polygonum capitatum）種子[5]生活力測定中，利用響應(yīng)面分析優(yōu)化相應(yīng)測定條件也得到相似的結(jié)論，表明利用響應(yīng)面分析優(yōu)化山豆根種子生活力測定條件是可行的[6-7]。

4? ? 參考文獻

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：第一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 檀龍顏，馬洪娜.山豆根繁殖與栽培技術(shù)的研究進展[J].種子，2017，36（8）：52-56.

[3] 王進，羅光宏，張勇，等.鎖陽種子生活力測定及前處理的方法[J].植物生理學(xué)報，2014，50（1）：83-87.

[4] 成小璐，魏怡冰，魏升華，等.羊耳菊種子生活力的最佳測定條件[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2016，44（8）：100-104.

[5] 王志威，魏升華，李俊，等.頭花蓼種子生活力TTC法最優(yōu)測定條件研究[J].南方農(nóng)業(yè)，2018，12（25）：1-6.

[6] 陳澤賢，袁輝.種子活力測定方法研究進展[J].種子科技，2019，37（16）：25-27.

[7] 李月明，郝楠，孫麗惠，等.種子活力測定方法研究進展[J].遼寧農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（1）：38-40.