蒼黃散外敷治療兔早期膝骨關(guān)節(jié)炎的實(shí)驗(yàn)研究

劉源 張康樂(lè) 范儀銘 郭珈宜 李峰 郭艷幸

〔摘要〕 目的 觀察平樂(lè)郭氏正骨蒼黃散外敷治療兔早期膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）滑膜組織的病理改變，以及軟骨組織中白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1 β， IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor， TNF-α）、金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase， MMP-13）的水平變化，探討經(jīng)驗(yàn)方蒼黃散治療早期KOA的作用機(jī)制。方法 將30只新西蘭大白兔隨機(jī)分為3組：平樂(lè)正骨蒼黃散組（簡(jiǎn)稱經(jīng)驗(yàn)方組）、扶他林組、模型組，采用木瓜蛋白酶和半胱氨酸混合液兔關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射完成動(dòng)物早期KOA造模，經(jīng)驗(yàn)方組和扶他林組兔分別采用對(duì)應(yīng)藥物外敷治療，治療時(shí)間為20 d。治療結(jié)束后記錄每組兔膝關(guān)節(jié)局部皮膚溫度，HE染色法觀察關(guān)節(jié)滑膜組織，用ELISA和Westernblot方法檢測(cè)軟骨組織中IL-1β、TNF-α、MMP13含量及蛋白的表達(dá)量。結(jié)果 治療結(jié)束后，經(jīng)驗(yàn)方組和扶他林組皮溫改善程度優(yōu)于模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)：模型組膝關(guān)節(jié)滑膜大量增生，并且可見(jiàn)血管增生明顯，其他兩組中膝關(guān)節(jié)滑膜組織中血管增生較少，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn);模型組滑膜組織及軟骨組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13含量及蛋白表達(dá)量明顯高于另外兩組，差異明顯（P<0.05），經(jīng)驗(yàn)方組與扶他林組之間IL-1β、TNF-α、MMP-13含量及蛋白表達(dá)量，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。結(jié)論 平樂(lè)郭氏正骨經(jīng)驗(yàn)方蒼黃散外敷能緩解兔早期膝骨關(guān)節(jié)模型皮溫高的癥狀，同時(shí)能降低軟骨組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13含量，此結(jié)果為臨床運(yùn)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

〔關(guān)鍵詞〕 膝骨關(guān)節(jié)炎;蒼黃散;平樂(lè)正骨;白細(xì)胞介素-1β;腫瘤壞死因子-α;金屬蛋白酶-13

〔中圖分類號(hào)〕R285.5 ? ? ? 〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號(hào)〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.03.008

〔Abstract〕 Objective To observe the pathological changes of synovial tissue in early knee osteoarthritis （KOA） treated with Pingle Guos Bone-setting's Canghuang Powder external application， and the changes of interleukin-1β （IL-1β）， tumor necrosis factor-α （TNF-α） and metalloproteinase-13 （MMP-13） levels in cartilage tissues， and to explore the mechanism of Canghuang Powder in treating early KOA. Methods A total of 30 New Zealand white rabbits were randomly divided into a Pingle bone-setting's Canghuang Powder group （experiential prescription group）， a Votalin group and a model control group. The rabbits were injected with papain and cysteine mixture into articular cavity to complete early KOA model. The rabbits in the experiential prescription group and the Votalin group were treated with external application of corresponding drugs for 20 days. At the end of treatment， local skin temperature of knee joint was recorded， synovial tissue was observed by HE staining， and IL-1β， TNF-α， MMP13 content and protein expression in cartilage tissues were detected by ELISA and Western blot. Results After the treatment， the improvement of skin temperature in the empirical prescription group and the Votalin group was better than that in the model group， and the difference was statistically significant （P<0.05）. Histopathological observation of synovium showed that the synovium of the knee joint in the model group had a large number of hyperplasia， and obvious vascular proliferation was seen. In the other two groups， synovial and vascular proliferation was less and inflammatory cell infiltration was small. The content and protein expression of IL-1β， TNF-α， MMP-13 in synovial tissue and cartilage tissue of the model group were significantly higher than those of other two groups （P<0.05）. There was no significant difference in the content and protein expression of IL-1β， TNF-α， MMP-13 between the experiential prescription group and the Votalin group （P>0.05）. Conclusion This study found that Pingle Guos bone-setting's empirical prescription Canghuang Powder can alleviate the symptoms of high skin temperature in early knee joint model of rabbits， and reduce the contents of IL-1β， TNF-α and MMP-13 in synovial tissue and cartilage tissue， which provides a experimental basis for clinical application.

〔Keywords〕 knee osteoarthritis; Canghuang Powder; Pingle Bone-setting; IL-1β; TNF-α; MMP-13

膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是臨床常見(jiàn)的骨傷科疾病，尤其多見(jiàn)于老年人，癥狀以關(guān)節(jié)疼痛，活動(dòng)障礙等為主，后期可見(jiàn)關(guān)節(jié)周圍肌肉萎縮、關(guān)節(jié)畸形功能喪失等。該病的發(fā)生發(fā)展多伴隨滑膜炎。膝關(guān)節(jié)擁有全身最大的滑膜組織，滑膜組織可分泌滲出液，滲出液中包含多種炎癥因子，是導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)疼痛的主要原因，該病的病因及發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，臨床缺乏特異性治療。中醫(yī)學(xué)將本病病因病機(jī)概括為本虛標(biāo)實(shí)，本虛為體虛或機(jī)體勞損，標(biāo)實(shí)為瘀血內(nèi)停或風(fēng)、寒、濕邪侵襲，致使經(jīng)絡(luò)不通，氣血、水液循行不暢，治療上以益氣通經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)為主。當(dāng)前中藥內(nèi)服外敷是治療該病行之有效的方法，本團(tuán)隊(duì)在前期臨床試驗(yàn)中已經(jīng)明確平樂(lè)正骨經(jīng)驗(yàn)方蒼黃散外敷治療膝骨關(guān)節(jié)的療效，但是其作用機(jī)制尚不明確，本研究采用平樂(lè)正骨經(jīng)驗(yàn)方外敷治療木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的兔早期KOA，觀察其對(duì)膝關(guān)節(jié)軟骨中白細(xì)胞介素-1β （interleukin-1 β，IL-1β）;腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）;金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase，MMP-13）的影響，探討其作用機(jī)制。

1 材料

1.1 ?實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

新西蘭大白兔30只，兔齡平均為4個(gè)月，體質(zhì)量（2.20±0.24） kg，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK（豫）2017-0001。實(shí)驗(yàn)前喂養(yǎng)兔7 d，觀察無(wú)異常后開(kāi)始造模和藥物治療。

1.2 ?主要試劑

木瓜蛋白酶（P4762-100MG）、L-半胱氨酸（YJ-B11909）試劑均由Sigma公司提供;ELISA試劑盒IL-1β（BIO-（tw）-1622）、TNF-α（BIO-（tw）-0248）、MMP-13（YE-E1012）均由R&D公司提供;Western Blot 試劑盒IL-1β（GOY-KT1608）、TNF-α（Hk6959）、MMP-13（HK3954）均由Santa公司提供;HE染液（G1120）購(gòu)自Solarbio公司。

1.3 ?主要儀器

自動(dòng)脫水機(jī)（Leica TP1020）、石蠟切片機(jī)（Leica 2235），光學(xué)顯微鏡（Leica DM1000），組織包埋中心（Tissue-Tek TEL），酶標(biāo)儀（北京普朗新技術(shù)DNM-9606），紅外測(cè)溫儀（科儀科技KY1707168）。

1.4 ?實(shí)驗(yàn)藥物

蒼黃散其主要藥物組成：蒼術(shù)30 g，黃柏20 g，當(dāng)歸15 g，土茯苓30 g，木瓜20 g等。所有藥物粉碎篩濾后用蜂蜜調(diào)和成糊狀備用（由河南省洛陽(yáng)正骨醫(yī)院中藥房提供）;雙氯芬酸二乙胺乳膏（北京諾華藥業(yè)）;造模試劑為2%的木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液。

2 方法

2.1 ?分組、造模與干預(yù)

模型制備方法：備皮消毒后以兔膝關(guān)節(jié)屈曲狀態(tài)下髕骨下緣髕腱外緣為進(jìn)針點(diǎn)，注射2%木瓜蛋白酶和0.03 mol/L L-半胱氨酸混合液0.5 mL，注射時(shí)間分別為實(shí)驗(yàn)正式開(kāi)始的第1、4、7天。造模后將所有兔隨機(jī)分為3組：模型組、經(jīng)驗(yàn)方組、扶他林組。模型組不治療，經(jīng)驗(yàn)方組給予蒼黃散外敷，用藥劑量與臨床運(yùn)用劑量相同，將蜂蜜調(diào)和好的蒼黃散平鋪到大小適宜到紗布上外敷到膝關(guān)節(jié)前方，并用繃帶固定;扶他林組給與扶他林外敷患膝處，用藥劑量與臨床相同。所有到治療從造模實(shí)驗(yàn)開(kāi)始到第7天開(kāi)始，每次外敷時(shí)間為8 h，每日1次，療程為20 d。

2.2 ?膝關(guān)節(jié)局部皮溫測(cè)定

在藥物干預(yù)前后，使用紅外測(cè)溫儀對(duì)兔膝關(guān)節(jié)正前方皮膚測(cè)量溫度，將紅外測(cè)溫儀探頭中心處對(duì)準(zhǔn)髕骨下緣，高度為1 cm，重復(fù)測(cè)量3次，取平均值。

2.3 ?取材

所有實(shí)驗(yàn)兔子在實(shí)驗(yàn)治療結(jié)束后采用耳緣靜脈空氣栓塞法處死，并在無(wú)菌條件下取膝關(guān)節(jié)滑膜組織0.3 g，以及軟骨組織0.3 g，將所取滑膜組織沖洗后立即放入10%中性福爾馬林溶液中固定;所取軟骨組織液氮凍存，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱保存。

2.4 ?膝關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本病理學(xué)檢測(cè)

兔滑膜組織經(jīng)過(guò)石蠟切片脫蠟至水，依次進(jìn)行蘇木素染色、伊紅染色，最后脫水封片，然后在顯微鏡下觀察滑膜切片的組織學(xué)變化情況。

2.5 ?ELISA法檢測(cè)組織IL-1β、TNF-α、MMP-13 水平

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)IL-1β、TNF-α、MMP-13的含量，將凍存組織從冰箱取出解凍，加入適量PBS液，搗碎后放置離心機(jī)離心，3 000 r/min離心10 min后取上清液，待檢測(cè)。嚴(yán)格按照相關(guān)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)上進(jìn)行操作，在450 nm波長(zhǎng)處讀吸光度值數(shù)（OD值），并用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出濃度。

2.6 ?采用Western-blot檢測(cè)IL-1β、TNF-α、MMP-13蛋白表達(dá)水平

將家兔關(guān)節(jié)軟骨組織從液氮中取出置于研缽中，加入液氮后迅速研磨，磨碎后加入RIPA蛋白裂解液裂解。然后依次完成蛋白提取、濃度測(cè)定、樣品蛋白處理-上樣及電泳-轉(zhuǎn)膜、封閉、免疫反應(yīng)-顯影、檢測(cè)分析，以特異性條帶濃度與面積的乘積為有效值，反映蛋白表達(dá)水平。

2.7 ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件GraphPad Prism 7.00統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以“x±s”表示，對(duì)于滿足方差齊性的數(shù)據(jù)采用單因素方差（One-Way ANOVA）檢驗(yàn)，若不滿足，則用秩和檢驗(yàn)法，組間兩兩比較采用LSD-t法檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 ?各組兔滑膜組織光鏡下病理觀察

在光鏡下觀察滑膜組織HE染色顯示：模型組滑膜組織增生明顯，可達(dá)5～6層，細(xì)胞間及滑膜外層見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，間質(zhì)纖維組織增生明顯，在滑膜組織中可見(jiàn)大量血管增生（圖a、A）。經(jīng)驗(yàn)方組滑膜組織增生，可達(dá)2～3層，細(xì)胞間及滑膜外層見(jiàn)少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，間質(zhì)纖維組織增生明顯，在滑膜組織中可見(jiàn)少量血管增生（圖b、B）。扶他林組外敷組滑膜組織增生，可達(dá)2～3層，細(xì)胞間及滑膜外層見(jiàn)中量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，間質(zhì)纖維組織增生較多，在滑膜組織中可見(jiàn)中量血管增生（圖c、C）。

3.2 ?各組兔膝關(guān)節(jié)局部皮溫比較

3組治療前分別比較局部皮溫，結(jié)果顯示皮溫?zé)o差異（P>0.05）。3組治療前后皮溫差比較，經(jīng)驗(yàn)方組、扶他林組比較模型組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），經(jīng)驗(yàn)方組與扶他林組比較皮溫差，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

3.3 ?IL-1β、TNF-α、MMP-13含量比較

治療結(jié)束后分別比較3組中IL-1β、TNF-α、MMP-13的含量，結(jié)果顯示經(jīng)驗(yàn)方組和扶他林組軟骨組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13的含量均低于模型組（P<0.05），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;扶他林組與經(jīng)驗(yàn)方組比較軟骨組織中三者含量，發(fā)現(xiàn)并無(wú)明顯差異。（P>0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)圖2。

3.4 ?IL-1β、TNF-α、MMP-13蛋白量表達(dá)水平比較 ? 治療結(jié)束后分別比較3組中IL-1β、TNF-α、MMP-13的蛋白表達(dá)水平，結(jié)果顯示經(jīng)驗(yàn)方組和扶他林組軟骨組織中三者的蛋白表達(dá)水平均低于模型組（P<0.01），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;扶他林組與經(jīng)驗(yàn)方組比較軟骨組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13的蛋白表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)并無(wú)明顯差異（P>0.05）。具體結(jié)果見(jiàn)圖3。

4 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎多發(fā)中老年人，是一種與年齡、性別、肥胖、遺傳等因素相關(guān)的退行性疾病，該病的發(fā)生涉及關(guān)節(jié)軟骨，軟骨下骨，關(guān)節(jié)周圍滑膜以及韌帶組織，其中軟骨組織是是受累主要組織[1]。蒼黃散外敷治療KOA較好的臨床療效，故本研究設(shè)計(jì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討其作用機(jī)制，KOA造模方式是采用木瓜蛋白酶和半胱氨酸混合液關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射完成，參照韓冠英等運(yùn)用不同濃度木瓜蛋白酶建立兔KOA模型的方法[2]，木瓜蛋白酶可分解軟骨基質(zhì)中的蛋白多糖，促使其從軟骨中丟失，木瓜蛋白酶誘發(fā)的模型與人體骨性關(guān)節(jié)炎類似[3]。對(duì)照組藥物選用扶他林，扶他林可用于骨關(guān)節(jié)炎的對(duì)癥治療，其適應(yīng)癥為用于緩解肌肉、軟組織和關(guān)節(jié)的輕至中度疼痛，且其用法為外用，能與經(jīng)驗(yàn)方外敷組形成很好對(duì)照。

軟骨組織中包括軟骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞外基質(zhì)，膝骨關(guān)節(jié)炎病變變?cè)缙谝攒浌羌?xì)胞外基質(zhì)的降解為主，細(xì)胞外基質(zhì)的降解以及其軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)誘發(fā)的凋亡是該病發(fā)生的主要方面[4]。合成代謝與分解代謝是維持軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的關(guān)鍵因素，正常情況下二者維持平衡關(guān)系，但當(dāng)平衡被打破，分解代謝超過(guò)合成代謝時(shí)，軟骨基質(zhì)的丟失會(huì)加速軟骨細(xì)胞的凋亡，加速疾病的發(fā)展[5]。1L-1β發(fā)揮著對(duì)軟骨基質(zhì)的分解代謝與抗分解代謝作用，1L-1β與1L-1的受體1L-1RⅡ存在某種平衡，骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生會(huì)打破這種平衡，導(dǎo)致軟骨退變，有研究表明，IL-1β蛋白表達(dá)數(shù)量與軟骨破壞程度呈正相關(guān)[6]。本研究結(jié)果證明了這現(xiàn)象，模型組兔滑膜組織HE染色切片可見(jiàn)滑膜組織增生明顯，細(xì)胞間及滑膜外層見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，并可見(jiàn)大量血管增生，模型組中IL-1β的蛋白表達(dá)含量最高。TNF-α是由激活的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，研究表明TNF-α能通過(guò)抑制成骨和刺激破骨細(xì)胞的作用來(lái)抑制軟骨組織生成，并且能抑制蛋白聚糖產(chǎn)生，是體現(xiàn)骨關(guān)節(jié)炎和滑膜炎的敏感指標(biāo)[7-8]。研究顯示TNF-α與OA的軟骨破壞及滑膜炎有一定關(guān)系，并與OA和滑膜炎的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[9-10]。TNF-α和IL-1β均可激活多型核細(xì)胞，刺激滑膜細(xì)胞的PGE2產(chǎn)生，加快骨與軟骨的破壞[6]。本研究結(jié)果顯示模型組軟骨組織中TNF-α明顯高于另外兩組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而扶他林和蒼黃散干預(yù)后，組織中TNF-α的含量明顯降低。MMP-13又稱膠原酶3，是金屬蛋白酶類的主要成員，是家族中最有效的Ⅱ型膠原降解酶，含有降解蛋白多糖基底膜成分，能有效的促進(jìn)基質(zhì)降解[11]，其作用機(jī)制大概與MMPs/TIMP比例失衡，關(guān)節(jié)軟骨及其周圍組織MMPs表達(dá)含量增高，關(guān)節(jié)軟骨的分解代謝大于合成代謝，從而致使軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解，最終導(dǎo)致軟骨損傷。研究結(jié)果表明軟骨細(xì)胞內(nèi)IL-1β和TNF-α產(chǎn)生NF-κB，NF-κB激活誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、凋亡反應(yīng)和MMPs的產(chǎn)生，三者之間與膝骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系[12-13]。

平樂(lè)正骨“平衡理論”學(xué)術(shù)思想認(rèn)為該病的發(fā)生以臟腑失衡為本，氣血失衡為標(biāo)。臟腑失衡重在肝腎脾三臟，其病機(jī)以濕、瘀、虛為主要特點(diǎn)，瘀血、風(fēng)、寒、濕邪為主要致病因素，病程纏綿，易復(fù)發(fā)，對(duì)于該病的治療目前中藥的應(yīng)用頗為廣泛，包括湯劑口服，中藥熏洗，中藥離子導(dǎo)入，中藥外敷等。本研究采用的外敷方是平樂(lè)正骨第六代傳承人郭維淮老先生經(jīng)驗(yàn)方，在本院臨床治療中應(yīng)用廣泛。該方由蒼術(shù)、黃柏、當(dāng)歸、土茯苓、木瓜、獨(dú)活等組成。蒼術(shù)燥濕健脾，祛風(fēng)除濕散寒;蒼術(shù)有效成分為倍半萜類化合物，具有有毛細(xì)管透過(guò)性亢進(jìn)的抑制作用很強(qiáng)的抗炎作用，其抗炎機(jī)制可能與其增強(qiáng)單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬功能、減少炎癥部位的前列腺素E2有關(guān)[14]。土茯苓利水消腫，通利關(guān)節(jié)，其有效成分具有消炎鎮(zhèn)痛、免疫抑制的作用[15]。黃柏清熱燥濕，瀉火解毒，其所含的黃柏酮可降低炎癥因子（如NO、1L-6、1L-1β和MCP-1）的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，同時(shí)具有抗菌、抗炎、解熱、抑制細(xì)胞免疫反應(yīng)的作用，還能抑制軟骨細(xì)胞的凋亡，改善軟骨病變[16-17]。當(dāng)歸活血止痛，活血又止血，為治痹癥要藥，其揮發(fā)油有明顯的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[18-19]。木瓜歸肝經(jīng)，主要功效為舒筋通絡(luò)，其有效成分木瓜葉乙醇提取物具有較高的抗炎活性，可以有效抑制白細(xì)1L-6以及TNF-α的產(chǎn)生[20-21]。獨(dú)活具有祛風(fēng)濕、止痛、解表之功效，現(xiàn)代研究表明獨(dú)活有效成分具有抗炎鎮(zhèn)痛、抗老年癡呆以及抗氧化作用[22-23]。諸藥合用共奏益氣通經(jīng)止痛、舒筋活絡(luò)之功效。

綜上所述，平樂(lè)正骨經(jīng)驗(yàn)方外敷治療兔膝關(guān)節(jié)急性滑膜炎不僅能改善局部皮溫高的癥狀，而且能有效降低組織中IL-1β、TNF-α、MMP-13的含量，為臨床運(yùn)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，后期研究將對(duì)影響IL-1β、TNF-α、MMP-13的上游因子做檢測(cè)，以便進(jìn)一步明確對(duì)中藥外敷治療KOA的深層機(jī)制。

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