左歸降糖解郁方對糖尿病并發(fā)抑郁癥胎鼠海馬神經(jīng)元NR及mEPSC的影響

向韻 吳夢瑤 趙洪慶 劉檢 雷昌 孟盼 張秀麗 凌佳 王宇紅

〔摘要〕 目的 探討左歸降糖解郁方對模擬糖尿病并發(fā)抑郁（diabetes mellitus with depression，DD）癥狀態(tài)下胎鼠海馬神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸受體（n-methyl-d-aspartic acid receptor，NR）和微小興奮性突觸后電流（miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC）頻率及幅度的干預(yù)作用。方法 取胎鼠（16～18 d）的海馬，進行分離純化和培養(yǎng)，用神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）免疫細(xì)胞化學(xué)染色法鑒定。隨機把海馬原代神經(jīng)元分6組：空白組、模型組、空白血清組、MK-801組、二甲雙胍+氟西汀組、左歸降糖解郁方組。根據(jù)分組，于空白組加10%的培養(yǎng)液;其他5組加15 mmol/L的高糖和50 ？滋mol/L的皮質(zhì)酮予以造模;造模后，空白血清組、二甲雙胍+氟西汀組、左歸降糖解郁方組中分別加10%的空白血清、二甲雙胍+氟西汀含藥血清、左歸降糖解郁方含藥血清，MK-801組中加10 ？滋mol/L的MK-801，同時干預(yù)18 h。蛋白NR2A、NR2B的表達運用高內(nèi)涵細(xì)胞成像技術(shù)（high content analysis，HCA）檢測;海馬神經(jīng)元細(xì)胞的mEPSC采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)來記錄，并對比不同組間神經(jīng)元細(xì)胞的mEPSC頻率和電流幅度。結(jié)果 經(jīng)鏡下觀察及NSE鑒定，所培養(yǎng)的細(xì)胞是海馬神經(jīng)元細(xì)胞，陽性率在95%以上。經(jīng)HCA檢測，空白組細(xì)胞的胞體明顯，形態(tài)完整，突觸之間形成豐富的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。與空白組比，模型組和空白血清組的海馬神經(jīng)元細(xì)胞出現(xiàn)萎縮、突觸斷裂或神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)消失，蛋白NR2A、NR2B的熒光值增強（P<0.01）;與空白血清組比，MK-801組、二甲雙胍+氟西汀組、左歸降糖解郁方組細(xì)胞突觸間的連接恢復(fù)，蛋白NR2A、NR2B熒光值減弱（P<0.01或P<0.05）。膜片鉗結(jié)果顯示，對比空白組，模型組、空白血清組的mEPSC頻率和幅度上升（P<0.01）;與空白血清組比，MK-801組、二甲雙胍+氟西汀組和左歸降糖解郁方組的mEPSC頻率和幅度下降（P<0.01）。結(jié)論 左歸降糖解郁方抗DD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞受損的保護作用機制，可能在于其能夠調(diào)控DD狀態(tài)下的海馬神經(jīng)元蛋白NR2A、NR2B的表達及突觸可塑性功能。

〔關(guān)鍵詞〕 糖尿病并發(fā)抑郁癥;海馬神經(jīng)元;突觸可塑性;膜片鉗;N-甲基-D-天冬氨酸受體;興奮性突觸后電流;左歸降糖解郁方

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標(biāo)志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2020.03.006

〔Abstract〕 Objective To investigate the intervention effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Fang on the frequency and amplitude n-methyl-d-aspartic acid receptor （NR） and miniature excitatory postsynaptic current （mEPSC） in hippocampal neurons of fetal rat under simulated diabetes mellitus complicated with depression（DD）. Methods The hippocampus of fetal rats （16-18 d） was selected， isolated， purified and cultured. The cultured cells were identified by neuron-specific enolase （NSE） immunocytochemical staining. The hippocampal primary neurons were randomly divided into 6 groups of a normal group， a model group， a blank serum group， a MK-801 group， a metformin + fluoxetine group， a Zuogui Jiangtang Jieyu Fang group. According to the grouping situation， the blank group was added 10% culture medium; other five groups were added 15 mmol/L high glucose and 50 μmol/L corticosterone to establish model; After modeling， the blank serum group， the metformin + fluoxetine group and the Zuogui Jiangtang Jieyu Fang group were added 10% volume blank serum， 10% volume metformin + fluoxetine drug content serum， 10% volume Zuogui Jiangtang Jieyu Fang drug content serum， and the MK-801 group was added 10 μmol/L MK-801， intervention for 18 h. The expression of protein NR2A and NR2B were detected by high content analysis （HCA）. The mEPSC of hippocampal neuronal cells was recorded using whole cell patch clamp technique， and the mEPSC frequency and current amplitude of neuronal cells in different groups were compared. Results Microscopic observation and NSE identification， the cultured cells were hippocampal neurons， and the positive rate was above 95%. HCA analysis showed that the cell bodies of the blank group were obvious， the morphology was intact， and synapses were interwoven into a rich neural network. Compared with the blank group， hippocampal neurons in the model group and the blank serum group showed atrophy， synaptic rupture or neural network disappeared， and the fluorescence intensity of protein NR2A and NR2B increased （P<0.01）; Compared with the blank serum group， the synaptic connections in the MK-801 group， the metformin + fluoxetine group and the Zuogui Jiangtang Jieyu Fang group were recovered， and the fluorescence intensity of protein NR2A and NR2B decreased （P<0.01 or P<0.05）. In whole cell patch clamp test， compared with the blank group， the mEPSC frequency and current amplitude of the model group and the blank serum group increased significantly （P<0.01）; Compared with the blank serum group， the mEPSC frequency and current amplitude of the MK-801 group， the metformin + fluoxetine group and Zuogui Jiangtang Jieyu Fang group decreased significantly （P<0.01）. Conclusion The mechanism of Zuogui Jiangtang Jieyu Fang in protecting hippocampal neurons damage of DD rats may be its regulation of protein NR2A， NR2B and synaptic plasticity in in hippocampal neurons under DD status.

〔Keywords〕 diabetes mellitus with depression; hippocampal neurons; synapse plasticity; patch clamp; n-methyl-d-aspartic acid receptor; miniature excitatory postsynaptic current; Zuogui Jiangtang Jieyu Fang

糖尿病是繼心腦血管疾病和惡性腫瘤后的第三大類疾病，糖尿病并發(fā)抑郁癥（diabetes mellitus with depression，DD）繼發(fā)于糖尿病，并發(fā)率是非病患的3至5倍[1]，且DD患者自殺率高達10%，危險程度遠遠高于非患者[2]。目前，我國有高達1.14億的糖尿病患者和1.48億的糖尿病前期患者[3]。據(jù)第52屆歐洲糖尿病研究協(xié)會年會上公布的國際流行病和治療研究數(shù)據(jù)顯示，中國2型糖尿病患者抑郁癥發(fā)生率為10.8%[4]，居全球第四。但DD的發(fā)病機制不清，至今尚無令人滿意的治療手段。因此，研究DD的發(fā)生機制，并在此基礎(chǔ)上開展防治具有重要的意義。

在本研究中，以高糖和皮質(zhì)酮共同體外培養(yǎng)的DD胎鼠海馬原代神經(jīng)元細(xì)胞模型為研究對象[5-6]，采取高內(nèi)涵細(xì)胞成像分析技術(shù)（high content analysis，HCA）檢測蛋白NR2A、NR2B的表達，采用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進行檢測海馬神經(jīng)元細(xì)胞的微小興奮性突觸后電流（miniature excitatory postsynaptic current，mEPSC）頻率及電流幅度，同時用“滋陰益氣、化瘀解郁”為治法的左歸降糖解郁方反證，探討DD海馬神經(jīng)元細(xì)胞突觸可塑性受損的特點、規(guī)律，為疾病的有效防治提供新的理論依據(jù)與治療靶點。

1 實驗材料

1.1 ?動物

孕16～18 d的SD雌性大鼠，SPF級，體質(zhì)量350～450 g;SD雄性大鼠12只，SPF級，體質(zhì)量200～220 g，均購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2016-0002，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院的動物實驗中心，使用許可證號為SYXK（湘）2015-0003。

1.2 ?試劑

Trypsin、Ⅰ型膠原酶（美國Amresco）;DMEM/F12（1∶1）、Neurobasal medium、B27 Supplement（美國Gibco）;胎牛血清、雙抗（Penicillin和Streptomycin，美國 Hyclone）;D-glucose、CORT、L-多聚賴氨酸、TTX、PTX（美國Sigma）;神經(jīng)元特異性烯醇化酶（Wellbioscience公司）;小鼠抗大鼠β-tubin抗體、DAPI、兔抗大鼠NR2A、兔抗大鼠NR2B（英國Abcam）;R-PE標(biāo)記羊抗小鼠IgG、FITC標(biāo)記羊抗兔IgG（Proteintech公司）。

1.3 主要藥物

左歸降糖解郁方（黃芪18 g，貫葉連翹3 g，熟地黃15 g，枸杞12 g，山茱萸12 g，丹參12 g，姜黃9 g，菟絲子9 g，杜仲9 g，牛膝9 g，牡丹皮6 g），以上飲片購于湖南中醫(yī)藥大學(xué)的第一附屬醫(yī)院，由醫(yī)院的制劑科制成1.14 g/mL的口服液;鹽酸氟西汀膠囊（規(guī)格：20 mg/粒，批號：2087A，法國Patheon）;鹽酸二甲雙胍片（規(guī)格：0.25 g/片，批號：1402115，湖南湘雅制藥有限公司）。

1.4 ?主要儀器

Stemi 508體式顯微鏡（德國Zeiss）;研究級倒置顯微鏡（德國Zeiss）;X73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus）;高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（美國PerkinElmer）;Axonpatch 700B膜片鉗放大器（東樂自然基因公司）;PC-10微電極垂直拉制儀（日本Narishige）。

1.5 ?主要溶液

海馬神經(jīng)元接種培養(yǎng)液：DMEM/F12∶FBS∶B27∶Glutamax∶雙抗=87∶10∶1∶1∶1;海馬神經(jīng)元維持培養(yǎng)液：Neurobasal∶B27∶Glutamax∶雙抗=96∶2∶1∶1;海馬神經(jīng)元終止培養(yǎng)液：DMEM/F12∶FBS∶雙抗=89∶10∶1;電極記錄內(nèi)液：KCl 145.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，NaCl 5.0 mmol/L，EGTA 5.0 mmol/L，MgATP 4.0 mmol/L，Na2GTP 0.3 mmol/L，pH 7.2;電生理記錄外液：NaCl 144.0 mmol/L，KCl 10.0 mmol/L，Glucose 10.0 mmol/L，HEPES 10.0 mmol/L，CaCl2 2.0 mmol/L，pH 7.4。

2 方法

2.1 ?海馬神經(jīng)元原代培養(yǎng)

孕16～18 d的SD大鼠，按照4 mL/kg腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，待無翻正反射后，開腹腔取胎鼠。取胎鼠的全腦放于DMEM/F12溶液中，在解剖顯微鏡下分離出海馬，剝?nèi)ザ嘤嗟哪X白質(zhì)及血膜。將海馬剪碎，按1∶1加入0.2 %Ⅰ型膠原酶和0.25%胰蛋白酶，37 ℃消化15 min，終止消化，取上清過200目細(xì)胞篩，濾液1 000 r/min離心5 min，棄上清，細(xì)胞沉淀重懸，計數(shù)，細(xì)胞懸液以0.8×105個/mL的密度接種在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（0.1 mg/mL 的L-多聚賴氨酸溶液預(yù)先包被）中，置37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4 h后全量換成維持培養(yǎng)液，第7天半量更換維持培養(yǎng)液。

2.2 ?神經(jīng)元化學(xué)鑒定

將海馬神經(jīng)元細(xì)胞接種到預(yù)先包被的96孔培養(yǎng)板中，密度為5×103個/孔，37 ℃培養(yǎng)7 d后，棄培養(yǎng)液，冷的0.01 mol/L PBS洗3次，每次5 min，分別加入4%的多聚甲醛固定30 min、0.25%的Triton X-100作用15 min、5%的BSA封閉30 min，洗3次，加NSE和β-tubin相關(guān)抗原抗體（1∶100），4 ℃濕盒孵育過夜，洗3次，加入FITC和R-PE標(biāo)記的二抗（1∶200），37 ℃孵育1 h，洗3次，加入細(xì)胞核染色劑DAPI室溫孵育20 min，洗3次，最后每孔加50 μL PBS，HCA觀察、拍照、分析。

2.3 ?制備含藥血清

12只SD大鼠，雄性，SPF級，體質(zhì)量200～220 g，隨機分成空白血清組、二甲雙胍+氟西汀組、左歸降糖解郁方組每組4只?？瞻籽褰M灌胃蒸餾水;二甲雙胍+氟西汀組用臨床等效劑量的二甲雙胍（0.18 g/kg）+氟西?。?.8 g/kg）灌胃;左歸降糖解郁方組灌胃給予人臨床3倍有效量的左歸降糖解郁方溶液（32.82 g/kg），均連續(xù)灌胃3 d，2次/d。在最后一次給藥1 h后，大鼠腹主動脈采血，靜置2 h，離心（10 min，4 500 r/min），取上清液，水?。?6 ℃，30 min），過濾后-80 ℃低溫保存。

2.4 ?分組、造模、干預(yù)

將胎鼠海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞隨機分組：空白組、模型組、空白血清組、MK-801組、二甲雙胍+氟西汀組、左歸降糖解郁方組。培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞10 d后，根據(jù)分組加入高糖溶液（15 μmol/L）、皮質(zhì)酮溶液（50 μmol/L）。然后，空白組加入10%的培養(yǎng)液，MK-801組于造模后加入10 μmol/L的NR阻斷劑溶液（MK-801），空白血清組、二甲雙胍+氟西汀組、左歸降糖解郁方組分別加入10%的空白血清、二甲雙胍+氟西汀含藥血清、左歸降糖解郁方含藥血清，干預(yù)18 h。

2.5 ?指標(biāo)檢測

2.5.1 ?HCA檢測蛋白NR2A、NR2B的表達 ?將海馬神經(jīng)元原代細(xì)胞培養(yǎng)7 d，根據(jù)分組造模18 h，采用NSE進行免疫化學(xué)染色，用HCA系統(tǒng)觀察、拍照、分析。以熒光強度表示NR2A、NR2B蛋白的表達。

2.5.2 ?膜片鉗電生理檢測mEPSC ?選擇培養(yǎng)第11～14天的海馬神經(jīng)元細(xì)胞，檢測前18 h細(xì)胞造模，檢測時TTX工作濃度為1 μmol/L，PTX工作濃度為10 μmol/L。玻璃電極入液電阻顯示3～8 MΩ為正常，鉗制電位為-60 mV，GΩ封接，破膜，全細(xì)胞記錄模式記錄mEPSC，電極電阻大于20 MΩ、漏電流大于-200 pA 的選擇不要，連續(xù)記錄5 min，每組至少記錄8個細(xì)胞。

2.6 ?統(tǒng)計學(xué)處理

采用Excel 2016、SPSS 17.0、Clamfit相關(guān)軟件來進行數(shù)據(jù)的分析;采用“x±s”的方式表達實驗數(shù)據(jù);采用ANOVA法檢驗實驗指標(biāo);采用LSD法兩兩比較方差齊，方差不齊則用Dunnett's T3法分析，P<0.05表示差異是有統(tǒng)計學(xué)的意義。

3 結(jié)果

3.1 ?海馬神經(jīng)元鑒定

將培養(yǎng)了7 d后的海馬神經(jīng)元置于倒置熒光顯微鏡下觀察，其胞體飽滿、突觸互相交織，構(gòu)成了豐富的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。HCA系統(tǒng)檢測顯示NSE染色后，綠色熒光為陽性者，陽性率高達95%，則該陽性細(xì)胞為海馬神經(jīng)元。結(jié)果見圖1。

3.2 ?各組NR2A、NR2B蛋白表達的熒光值比較

空白組中神經(jīng)元的形態(tài)完整，突起從橫交錯形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)。和空白組比較，模型組與空白血清組的數(shù)軸突間發(fā)生斷裂，NR2A、NR2B蛋白的熒光值明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）;和空白血清組相比，MK-801組、二甲雙胍+氟西汀組、左歸降糖解郁方組突觸網(wǎng)絡(luò)連接恢復(fù)正常，NR2A、NR2B的熒光值呈現(xiàn)減弱趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01或P<0.05）。結(jié)果見圖2-4。

3.3 ?各組海馬神經(jīng)元mEPSC的記錄比較

同空白組比，模型組、空白血清組細(xì)胞的mEPSC頻率和幅度呈上升狀態(tài)（P<0.01）;和空白血清組比較，MK-801組、二甲雙胍+氟西汀組、左歸降糖解郁方組細(xì)胞的mEPSC頻率和電流幅度顯著下降（P<0.01）。結(jié)果見圖5-6。

4 討論

DD的發(fā)生和下丘腦-垂體-腎上腺軸（the hypo？鄄thalamic-pituitary-adrenal axis，HPA）的亢進緊密相關(guān)，尤其是與促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（corticotropin releasing hormone，CRH）[7]、皮質(zhì)醇（cortisol，COR）的釋放相關(guān)[8]。海馬神經(jīng)元新生障礙會引發(fā)HPA軸的失調(diào)，而HPA失調(diào)是產(chǎn)生抑郁的主要因素[9]。在學(xué)習(xí)記憶與情緒信息的處理活動中，海馬作為關(guān)鍵腦區(qū)參與其中。海馬的突觸可塑性和長時程增強（long-term potentiation，LTP）、長時程抑制（long-term depres？鄄sion，LTD）分別被認(rèn)為是學(xué)習(xí)記憶的生物學(xué)基礎(chǔ)和細(xì)胞分子機制[10]。

NR是一種谷氨酸敏感性的離子通道受體[11]，海馬神經(jīng)元的調(diào)亡、突觸重塑及5-羥色胺系統(tǒng)都能受到NR相關(guān)通路的調(diào)控，且與HPA軸亢進導(dǎo)致的海馬損傷緊密相關(guān)。HPA軸激活過度后會引起COR、CRH的含量不斷增高，其相關(guān)受體糖皮質(zhì)激素受體的表達下調(diào)和促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素受體1活化異常，進一步影響NR而導(dǎo)致海馬受損。COR含量的增高使糖皮質(zhì)激素受體的表達下調(diào)，促使轉(zhuǎn)錄和合成谷氨酰胺合成酶基因相對減少，谷氨酸在細(xì)胞內(nèi)不斷累積并向細(xì)胞外釋放，使興奮性受體NR的相關(guān)蛋白NR2A、NR2B亞單位水平和其受體通道的結(jié)合位點數(shù)量增多，引發(fā)海馬的神經(jīng)興奮性毒性，導(dǎo)致海馬損傷[12]。在突觸可塑性過程中NR發(fā)揮了關(guān)鍵性作用，是由于其影響著突觸可塑性的發(fā)動機（調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的濃度），介導(dǎo)突觸細(xì)胞內(nèi)部分信號通路，從而影響突觸傳遞的LTP和LTD[13]。

神經(jīng)元細(xì)胞的突觸自發(fā)性活動包括興奮性的和抑制性的[14]。神經(jīng)元興奮性的突觸活動：mEPSC、自發(fā)興奮性突觸后電流（spontaneous excitatory postsynaptic current，sEPSC）、自發(fā)動作電流（spontaneous action current，sAC）。由神經(jīng)元突觸前膜Glu的釋放引起的突觸后膜反應(yīng)稱為mEPSC，其頻率的變化與突觸前谷氨酸釋放的頻率成正比，而幅度的變化則反映同時刻突觸前谷氨酸釋放數(shù)目和突觸后膜受體的數(shù)目、反應(yīng)性的變化[15]。mEPSC不受TTX影響，但在有大量的鈉通道參與的sEPSC、sAC反應(yīng)中，TTX能同時阻斷突觸前的電壓門控性鈉通道（即自發(fā)動作電位）和突觸后的電壓門控性鈉通道（sEPSC、sAC）。抑制性的活動：微小抑制性突觸后電流（miniature inhibitory postsynaptic current，mIPSC）、自發(fā)抑制性突觸后電流（spontaneous inhibitory postsynaptic current，sIPSC），分別和mEPSC、sEPSC發(fā)生的機制相同，但TTX可阻斷sIPSC，且抑制性遞質(zhì)GABA可同時介導(dǎo)兩者。故在實驗中，加阻斷劑PTX阻斷GABA介導(dǎo)的IPSC反應(yīng)，加阻斷劑TTX阻斷mEPSC。

本實驗中用HCA檢測，結(jié)果顯示模型組中胎鼠海馬神經(jīng)元較多的出現(xiàn)萎縮和突觸斷裂，細(xì)胞周圍碎片明顯增多，和空白組相比，模型組的NR2A、NR2B熒光值增強，提示神經(jīng)元受損和相關(guān)蛋白表達異常。而海馬神經(jīng)元的損傷程度在經(jīng)左歸降糖解郁方干預(yù)后有所降低，且蛋白NR2A、NR2B的熒光值表達與空白組相接近，提示左歸降糖解郁方可防止海馬神經(jīng)元受損，其相關(guān)作用機制可能是通過調(diào)控NR的相關(guān)蛋白。在膜片鉗實驗中，和空白組比，模型組和空白血清組的海馬神經(jīng)元細(xì)胞的mEPSC頻率、電流幅度都顯著上升，提示在模型組中，由海馬神經(jīng)元突觸前膜釋放的Glu量增多和突觸后膜相關(guān)受體反應(yīng)加強;和空白血清組比較，左歸降糖解郁方組的mEPSC頻率、電流幅度降低，且與二甲雙胍+氟西汀組的結(jié)果比較無明顯差異，提示左歸降糖解郁方可減少釋放海馬神經(jīng)元突觸前Glu隨機量子的數(shù)目、減弱突觸后受體的過度激活，且MK-801組的結(jié)果提示NR可能是導(dǎo)致DD海馬神經(jīng)元受損及參與突觸可塑的關(guān)鍵點。

綜上，左歸降糖解郁方對DD模型細(xì)胞的保護機制可能在于其調(diào)控NR相關(guān)蛋白的表達和調(diào)節(jié)神經(jīng)元突觸可塑性的功能，后續(xù)實驗我們將繼續(xù)從在體水平探討左歸降糖解郁方對DD海馬神經(jīng)元突觸可塑性的保護作用。

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