運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的影響

高 霖，劉 犇,2*，彭瑞妮,2，章志濤,2，張?chǎng)┰?，李?guó)生，梅 婷，鄒劍偉,2

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，肉牛羊疾病控制實(shí)驗(yàn)室，江西宜春 336000；2.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司，江西宜春 336000）

隨著集約化畜牧業(yè)的發(fā)展[1]、引種和屠宰需求增加，動(dòng)物往往需要經(jīng)歷運(yùn)輸[2]，運(yùn)輸使動(dòng)物暴露于一系列不良刺激之下，會(huì)引起機(jī)體發(fā)生多種生理和生化反應(yīng)，如躁動(dòng)不安、呼吸與心跳加速，機(jī)體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)、水分大量消耗，同時(shí)影響動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育和生產(chǎn)性能，免疫力降低，導(dǎo)致發(fā)病甚至死亡[3-5]。隨著國(guó)內(nèi)外畜禽貿(mào)易的發(fā)展，動(dòng)物調(diào)運(yùn)日益頻繁，運(yùn)輸應(yīng)激造成的經(jīng)濟(jì)損失也越來(lái)越大，已經(jīng)成為我國(guó)畜牧業(yè)快速發(fā)展的重要制約因素[6]。

小腸同時(shí)具有消化、吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和免疫屏障功能。因此，小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細(xì)胞的數(shù)量變化可以很好地反映腸道黏膜免疫系統(tǒng)的功能狀態(tài)及小腸的局部免疫狀態(tài)[7-8]。以往國(guó)內(nèi)外對(duì)動(dòng)物小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細(xì)胞的研究較多[9-11]，但在運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細(xì)胞的影響方面研究較少。本研究旨在分析短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間2 種不同運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)和淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞、肥大細(xì)胞數(shù)量及分布的影響，為深入研究畜禽運(yùn)輸應(yīng)激發(fā)病機(jī)理及解決方案提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 在江西當(dāng)?shù)厣窖蝠B(yǎng)殖場(chǎng)選擇精神狀態(tài)與健康狀況良好、體況相近、體重為（13.89±2.96）kg 且經(jīng)布魯氏菌病檢測(cè)為陰性的贛西公山羊18 頭。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 將18 頭山羊隨機(jī)平均分成3 組，即對(duì)照組、2 h 運(yùn)輸處理組和6 h 運(yùn)輸處理組。裝載前在正常條件下飼養(yǎng)山羊，對(duì)照組山羊不做處理；運(yùn)輸處理組山羊人工保定好裝載到運(yùn)輸車(chē)輛上，裝載密度為1.5 m2/只，于06:00—12:00 進(jìn)行運(yùn)輸應(yīng)激處理。運(yùn)輸應(yīng)激處理時(shí)天氣晴好、車(chē)內(nèi)溫度約25～30℃，且山羊在運(yùn)輸時(shí)禁食禁水，以35～45 km/h 的速度進(jìn)行公路運(yùn)輸。然后分別在運(yùn)輸應(yīng)激處理2 h（08:00）和6 h（12:00）后抓羊并卸載，對(duì)山羊使用速眠新肌肉注射麻醉，屠宰后分別取十二指腸、空腸、回腸中段各約5 cm，用4℃ PBS 洗凈后迅速放入4%多聚甲醛中用于后續(xù)常規(guī)染色和組織化學(xué)染色分析。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)和方法 將各腸段組織石蠟包埋制備連續(xù)切片，每隔10 張選取1 張。每只山羊隨機(jī)選擇5 張切片，經(jīng)蘇木精-伊紅（HE）、甲苯胺藍(lán)-高錳酸鉀（MTB）以及過(guò)碘酸-雪夫氏（PAS）染色后，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察。在每張切片中隨機(jī)選擇5 根典型腸絨毛，運(yùn)用圖像分析軟件對(duì)絨毛高度和隱窩深度進(jìn)行測(cè)量，然后計(jì)算絨毛高度/隱窩深度的比值（絨腺比）；分別在各腸段的每張切片中隨機(jī)選取5 根柱狀細(xì)胞排列整齊、完整性較好的典型腸絨毛，在光學(xué)顯微鏡下計(jì)算所選每根腸絨毛中的肥大細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算所選每根腸絨毛中分布的上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 用SPSS 24.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。若F 檢驗(yàn)結(jié)果顯著則再用LSD 法進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P＜0.01 表示差異極顯著，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)山羊十二指腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的影響 由表1 及圖1 可知，對(duì)照組及各運(yùn)輸處理組間十二指腸絨毛高度均無(wú)顯著變化；與對(duì)照組相比，2 個(gè)運(yùn)輸處理組隱窩深度均極顯著增大，6 h 運(yùn)輸處理組也極顯著大于2 h 運(yùn)輸處理組；對(duì)照組、2 h 和6 h 運(yùn)輸處理組絨腺比依次減小，3 組間差異極顯著。對(duì)照組、2 h 和6 h 運(yùn)輸處理組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量依次增加，3 組間差異極顯著；與對(duì)照組相比，2 個(gè)運(yùn)輸處理組肥大細(xì)胞數(shù)量均極顯著增加，其中6 h 運(yùn)輸處理組極顯著少于2 h 運(yùn)輸處理組。

2.2 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)山羊空腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的影響 由圖2、表1 可知，與對(duì)照組相比，運(yùn)輸處理組絨毛高度均極顯著減小，但2 個(gè)運(yùn)輸處理組間差異不顯著；與對(duì)照組相比，6 h 運(yùn)輸處理組隱窩深度極顯著增大，2 h 運(yùn)輸處理組無(wú)顯著變化；對(duì)照組、2 h 運(yùn)輸處理組和6 h 運(yùn)輸處理組的絨腺比依次減小，3 組間差異極顯著。對(duì)照組、2 h 運(yùn)輸處理組和6 h 運(yùn)輸處理組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量依次增加，3 組間差異極顯著；與對(duì)照組相比，2 個(gè)運(yùn)輸處理組肥大細(xì)胞數(shù)量均極顯著增加，但2 個(gè)運(yùn)輸處理組之間差異不顯著。

2.3 運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)山羊回腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的影響 由圖3、表1 可知，運(yùn)輸處理組絨毛高度與對(duì)照組相比變化均不顯著，但2 h 運(yùn)輸處理組顯著大于6 h運(yùn)輸處理組；與對(duì)照組相比，2 h 運(yùn)輸處理組隱窩深度極顯著增大，6 h 運(yùn)輸處理組隱窩深度顯著減?。慌c對(duì)照組相比，2 h 運(yùn)輸處理組絨腺比極顯著減小，6 h 運(yùn)輸處理組極顯著增大。對(duì)照組、2h 和6h 運(yùn)輸處理組上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞和杯狀細(xì)胞數(shù)量依次增加，3 組間差異極顯著；與對(duì)照組相比，2 個(gè)運(yùn)輸處理組肥大細(xì)胞數(shù)量均極顯著升高，其中6 h 運(yùn)輸處理組顯著低于2h 運(yùn)輸處理組。

表1 山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)及其免疫相關(guān)細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

小腸是營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所，正常的小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)是保證機(jī)體充分消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的基礎(chǔ)。小腸絨毛是小腸黏膜的主要結(jié)構(gòu)，是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的特有結(jié)構(gòu)，因此小腸絨毛高度和絨腺比是評(píng)價(jià)小腸發(fā)育和消化吸收功能的重要指標(biāo)[12-13]。腸絨毛高時(shí)，成熟的絨毛細(xì)胞多，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收能力強(qiáng)；腸隱窩深度體現(xiàn)了腸腺細(xì)胞的生成率，隱窩變淺，說(shuō)明細(xì)胞成熟率升高，分泌能力強(qiáng)[14]。因此，當(dāng)絨腺比增大時(shí)，小腸絨毛吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力增強(qiáng)，反則亦然[15-16]。本研究結(jié)果表明，除6 h 運(yùn)輸處理組山羊回腸絨腺比極顯著大于對(duì)照組外，2 個(gè)運(yùn)輸處理組山羊其他各腸段絨腺比均極顯著小于對(duì)照組；除2 h 運(yùn)輸處理組空腸及6 h 運(yùn)輸處理組回腸外，與對(duì)照組相比，運(yùn)輸處理組山羊其他各腸段腸隱窩深度均極顯著增加；運(yùn)輸處理組山羊各腸段腸絨毛高度與對(duì)照組相比也均有一定變化。這些變化說(shuō)明運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)造成了一定的損傷，使小腸的消化吸收能力下降。多項(xiàng)研究表明，肉牛經(jīng)長(zhǎng)途運(yùn)輸后，體重均有一定的降低，運(yùn)輸后約2 周才逐漸恢復(fù)至運(yùn)輸前狀態(tài)[17-18]，這也佐證了運(yùn)輸應(yīng)激使小腸黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致小腸消化吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力降低，最后可能間接引起動(dòng)物體重下降。

圖1 各組山羊十二指腸淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞（400×）

圖2 各組山羊空腸淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞（400×）

圖3 各組山羊回腸淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞（400×）

小腸黏膜不僅具有吸收營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，還能應(yīng)對(duì)致病性抗原入侵和不良因素刺激，進(jìn)而使機(jī)體保持內(nèi)環(huán)境的相對(duì)穩(wěn)定，維持機(jī)體正常生命活動(dòng)的免疫屏障功能[19-21]。小腸黏膜免疫系統(tǒng)由分布在小腸黏膜內(nèi)的淋巴組織和免疫活性細(xì)胞共同組成，構(gòu)成了抵抗病原體入侵的第一道免疫屏障，黏膜的免疫狀況是小腸能否抵抗外來(lái)病原感染和入侵的關(guān)鍵因素。小腸黏膜內(nèi)免疫活性細(xì)胞的數(shù)量和分布情況與小腸黏膜的免疫狀況密切相關(guān)[22]。小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞是小腸黏膜免疫系統(tǒng)的效應(yīng)部分之一[23-24]，也是機(jī)體小腸黏膜免疫系統(tǒng)中和外來(lái)抗原及微生物接觸最早的免疫細(xì)胞。因此，小腸黏膜上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞的數(shù)量和分布情況可以較好地反映小腸局部黏膜的免疫狀況。本研究結(jié)果表明，運(yùn)輸處理組山羊各腸段腸絨毛上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組均極顯著增加，提示運(yùn)輸應(yīng)激對(duì)山羊小腸黏膜免疫系統(tǒng)有較強(qiáng)的免疫激活作用，使其發(fā)生免疫反應(yīng)，以此抵抗運(yùn)輸應(yīng)激時(shí)細(xì)菌、病毒以及寄生蟲(chóng)等的侵襲[23]。

杯狀細(xì)胞是專(zhuān)門(mén)合成、分泌黏蛋白的分泌型腸上皮細(xì)胞，其分泌的黏蛋白與水和無(wú)機(jī)鹽等共同構(gòu)成覆蓋于腸道表面的黏液系統(tǒng)[25-27]。黏液系統(tǒng)在腸黏膜上皮表面形成屏障，對(duì)上皮有保護(hù)和潤(rùn)滑的作用，同時(shí)對(duì)食物消化率的提高較為重要[8]。還有研究認(rèn)為，在尚未建立起被動(dòng)免疫的初生動(dòng)物的腸道免疫中，杯狀細(xì)胞起著更為重要的防御作用[28]。杯狀細(xì)胞曾被認(rèn)為只是一種單純的分泌細(xì)胞[29]，但最近有研究觀察到，杯狀細(xì)胞可以通過(guò)形成杯狀細(xì)胞相關(guān)抗原通道將抗原轉(zhuǎn)移到固有層內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞[30]。本研究表明，運(yùn)輸處理組山羊各腸段腸絨毛上皮內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)較對(duì)照組均極顯著增加，提示運(yùn)輸應(yīng)激一定程度上損傷了山羊小腸黏膜，導(dǎo)致機(jī)體可能通過(guò)增加小腸絨毛內(nèi)杯狀細(xì)胞數(shù)量及其分泌黏蛋白含量，來(lái)抵御病原微生物的侵襲以及有害物質(zhì)對(duì)小腸上皮的損害。

肥大細(xì)胞通過(guò)其分泌的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)不僅能介導(dǎo)速發(fā)型變態(tài)反應(yīng)，還在先天性免疫以及獲得性免疫中起著重要作用。研究表明，肥大細(xì)胞能通過(guò)表達(dá)CD40、CD40L 促進(jìn)抗原遞呈細(xì)胞、T 細(xì)胞、B 細(xì)胞的活化，還能通過(guò)表達(dá)和分泌一系列免疫相關(guān)分子、細(xì)胞因子發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)等作用[31]。本研究結(jié)果顯示，運(yùn)輸處理組山羊各腸段腸絨毛肥大細(xì)胞數(shù)相比于對(duì)照組均有極顯著增加，提示在運(yùn)輸應(yīng)激條件下肥大細(xì)胞被激活，可能發(fā)揮一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)，短時(shí)間和長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)輸應(yīng)激均對(duì)山羊小腸黏膜結(jié)構(gòu)造成了較大損傷，且運(yùn)輸后山羊小腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、杯狀細(xì)胞和肥大細(xì)胞數(shù)量顯著增加，表明運(yùn)輸應(yīng)激顯著影響了山羊小腸的局部免疫狀態(tài)，小腸黏膜免疫系統(tǒng)被激活，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和免疫屏障作用。