桿菌七肽抗菌譜和溶血性的研究

張 江，李火明，蔡文通，周曉容

（1.安杰利（重慶）生物科技有限公司，重慶402460；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所獸醫(yī)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江哈爾濱 150069；3.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶402460）

在飼料中應(yīng)用抗生素可明顯提高動(dòng)物生長(zhǎng)性能、降低死亡率，提高生產(chǎn)效益，但也存在一定弊端和潛在危害，如降低動(dòng)物免疫力、增加細(xì)菌耐藥性以及影響食品安全。根據(jù)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第194 號(hào)，自2020 年1 月1日起，除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑禁止使用，標(biāo)志著飼用抗生素作為促生長(zhǎng)劑將停止在飼料中使用，因此抗菌肽、微生物制劑、植物提取物以及酸化劑等抗生素替代品逐漸受到關(guān)注而成為研究熱點(diǎn)。抗菌肽（Antimicrobial Peptides，AMP）是生物體產(chǎn)生的一種與宿主防御相關(guān)的具有先天性免疫作用的小分子活性多肽?？咕牡闹饕饔脵C(jī)理是破壞微生物的細(xì)胞膜而使細(xì)菌裂解死亡，其抑菌殺菌機(jī)理區(qū)別于傳統(tǒng)的抗生素，故不易產(chǎn)生耐藥性[1-2]。大量試驗(yàn)研究結(jié)果顯示，抗菌肽（如腸桿菌肽、天蠶素等）可替代抗生素在畜禽飼料上使用，能明顯降低動(dòng)物腹瀉和提高生產(chǎn)性能[3-5]。桿菌七肽（又名腺苷七肽，Microcin 七肽）是20 世紀(jì)90 年末發(fā)現(xiàn)的腸桿菌屬（Enterobacter）、乳桿菌屬（Lactobacillus）等微生物分泌的小分子抗菌肽，其能抑制多種微生物，包括大腸桿菌（Escherichia coli）、沙門氏菌（Salmonella）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）等革蘭氏陰性細(xì)菌和部分革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌[6-7]。桿菌七肽包含7 個(gè)氨基酸殘基（序列為MATGNAD），其C 端氨基酸殘基的羧基與單磷酸腺苷（AMP）的磷酸鍵通過共價(jià)鍵結(jié)合形成核酸肽；其主要通過破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和干擾微生物蛋白翻譯過程實(shí)現(xiàn)抑菌作用[8-9]。桿菌七肽可以通過微生物發(fā)酵和化學(xué)合成法生成，是一種潛在的抗生素替代品，但在國(guó)內(nèi)產(chǎn)業(yè)化研究剛起步[10]。本研究采用不同動(dòng)物來(lái)源的病原菌和益生菌作為指示菌，研究桿菌七肽的抗菌譜以及溶血性，為飼用抗生素替代品的研發(fā)和體外評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌制劑與樣品 各菌株、來(lái)源及培養(yǎng)條件見表1。桿菌七肽產(chǎn)品中桿菌七肽含量為10%，載體為玉米芯粉和麥芽糊精，由安杰利（重慶）生物科技有限公司提供。

1.1.2 主要試劑和儀器 MH（A）、MH（B）、營(yíng)養(yǎng)肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、MRS 肉湯、MRS 瓊脂、BHI、BHI（A）、TCBS 瓊脂、YPD、TSA 等微生物培養(yǎng)基購(gòu)自北京奧博星生物。小鼠紅細(xì)胞（南京森貝伽生物科技有限公司），胃蛋白酶（MERCK）、胰蛋白酶（MERCK）。超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）、滅菌鍋（日立(中國(guó))有限公司）、培養(yǎng)箱（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、厭氧罐（包括厭氧產(chǎn)期袋）（日本三菱化學(xué)株式會(huì)社）、搖床（蘇州培英實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.2 試劑配制及樣品處理

1.2.1 試劑的配制 培養(yǎng)基的配制按照各培養(yǎng)基標(biāo)簽要求進(jìn)行稱取和配制。人工胃液按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 年版Ⅳ部）配制：取稀鹽酸16.4 mL，加水約800 mL 與胃蛋白酶10 g，搖勻后，加水稀釋成1 000 mL[12]。人工腸液按照《中華人民共和國(guó)藥典》（2015 年版Ⅳ部）配制：取磷酸二氫鉀6.8 g，加水500 mL 使溶解，用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 至6.8；另取胰酶10 g，加水適量使溶解，將兩液混合后，加水稀釋至1 000 mL[12]。

1.2.2 指示菌菌懸液的準(zhǔn)備 細(xì)菌復(fù)蘇：各指示菌菌種均平板劃線培養(yǎng)20 h（布氏桿菌培養(yǎng)5 d）；挑取單菌落相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)12～14 h（布氏桿菌培養(yǎng)3 d），待用。指示菌稀釋：用生理鹽水將菌液稀釋至OD600吸光值為0.1（細(xì)菌約108CFU/mL，酵母菌約106CFU/mL），備用。

1.2.3 待測(cè)樣品處理 先配制抗菌肽產(chǎn)品原液，稱取1.28 g樣品定容于10 mL 容量瓶中，制成128 000 μg/mL 的樣品液，震蕩混合均勻，超聲波處理10 min。吸取適量上述溶液于具塞滅菌離心管中，5 000 r/min 離心2 min，取上清液于0.45 μm 濾膜過濾，取過濾液，將前面過濾的1 mL 左右液體棄去，收集后面過濾的液體，然后用無(wú)菌水進(jìn)行倍比梯度稀釋，其桿菌七肽濃度為6 400、3 200、1 600、800、400、200、100、50、25 μg/mL。

1.3 抑菌試驗(yàn) ①于超凈工作臺(tái)內(nèi)，向每個(gè)滅菌培養(yǎng)皿中傾注10 mL 的高壓滅菌過的水瓊脂（1.2%～1.5%瓊脂）進(jìn)行鋪底，每個(gè)培養(yǎng)皿厚度均一，待水瓊脂冷卻凝固后，將滅菌后的牛津杯（7.9 mm）置于瓊脂之上，每個(gè)平皿可等距離放置3～7 個(gè)牛津杯。②吸取150 μL 指示菌菌液（1.2.2 準(zhǔn)備的菌懸液）加入到恒溫至（50±5）℃的相應(yīng)的瓊脂培養(yǎng)基中，輕輕搖勻，避免起泡，此時(shí)菌在培養(yǎng)基的含量為106CFU/mL。 ③將上述加過菌液的瓊脂培養(yǎng)基倒入放有牛津杯的凝固的瓊脂培養(yǎng)皿中，每個(gè)平皿倒15～20 mL，待其冷卻凝固。用鑷子取出牛津杯，吸取150 μL 的待檢樣品注入到相應(yīng)的孔內(nèi)，設(shè)立滅菌水為空白對(duì)照，同時(shí)在培養(yǎng)皿上做好標(biāo)記，將培養(yǎng)皿放入2～8℃冰箱內(nèi)放置1～2 h 進(jìn)行樣品的擴(kuò)散。④將培養(yǎng)皿移入37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8～10 h 后（布氏桿菌培養(yǎng)時(shí)間約為5 d），觀察平板中的抑菌圈直徑，并用直尺或游標(biāo)卡尺進(jìn)行測(cè)量抑菌圈直徑，同時(shí)用無(wú)菌水作為對(duì)照。布氏桿菌在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所P3 實(shí)驗(yàn)室操作，其他病原菌在P2 及實(shí)驗(yàn)室操作。

1.4 溫度對(duì)桿菌七肽抗菌活性的影響 取抗菌肽樣品12.8 g，定溶于100 mL 去離子水，分成4 份為1～4 號(hào)樣，每份25 mL，1～3 號(hào)樣分別與 70、80、90℃水浴處理 10 min，4 號(hào)樣為對(duì)照室溫放置。以大腸桿菌CGMCC44102 為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌試驗(yàn)同1.3。每個(gè)試驗(yàn)2 個(gè)重復(fù)。

表1 菌株來(lái)源及培養(yǎng)條件

1.5 體外消化對(duì)桿菌七肽抗菌活性的影響 取抗菌肽樣品1.28 g，定溶于10 mL 人工胃液中，開始計(jì)時(shí)，分別在30、60、120 min 不同時(shí)間點(diǎn)取樣加NaOH 中和pH為7，85℃處理5 min 滅活蛋白酶，然后梯度稀釋，以CGMCC44102 指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌試驗(yàn)同1.3。每個(gè)試驗(yàn)2 個(gè)重復(fù)。

取抗菌肽樣品1.28 g，定溶于10 mL 人工腸液中，開始計(jì)時(shí)，分別在30、60、120 min 不同時(shí)間點(diǎn)，85 ℃處理5 min 滅活蛋白酶然后梯度稀釋，以CGMCC44102 指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，抑菌試驗(yàn)同1.3。每個(gè)試驗(yàn)2 個(gè)重復(fù)。

1.6 溶血性試驗(yàn) 試驗(yàn)方法參考[13]：用PBS 調(diào)整小鼠紅細(xì)胞濃度為1%；在試管中用PBS 將桿菌七肽產(chǎn)品濃度調(diào)整為 2 000、1 000、500、250 μg/mL，加入等體積的紅細(xì)胞懸液，則濃度為1 000、500、250、125 μg/mL（對(duì)應(yīng)桿菌七肽為 100、50、25、12.5 μg/mL），以 PBS為陰性對(duì)照，以1% Tritonx-100 為陽(yáng)性對(duì)照，37℃感作1 h，觀察試管渾濁度；1 000×g 離心5 min；將上清液依次加入96 孔板，測(cè)定OD540值。溶血率=（檢測(cè)孔OD540－陰性孔OD540）/（陽(yáng)性孔OD540－陰性孔OD540）×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 抑菌圈直徑、溶血率采用Excel 表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié) 果

2.1 桿菌七肽對(duì)不同微生物的抑制作用 通過對(duì)18 株不同微生物（10 株革蘭氏陰性菌，7 株革蘭氏陽(yáng)性菌，1 株真菌）的抑制作用（表2）發(fā)現(xiàn)，桿菌七肽對(duì)10 株革蘭氏陰性菌都有抑制作用，如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌、綠膿桿菌、副溶血弧菌、嗜水氣假單胞菌以及布氏桿菌，而只對(duì)2 株革蘭氏陽(yáng)性菌具有抑制作用，即產(chǎn)期莢膜梭菌（又名魏氏梭菌）。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，桿菌七肽對(duì)同種菌不同株或不同血清型的抑制效果也不盡相同，抗菌肽稀釋到50 μg/mL 對(duì)大腸桿菌和沙門氏菌有一定的抑制作用。抗菌肽稀釋到50 μg/mL 對(duì)副溶血弧菌NF1517 仍然有抑制作用，而抗菌肽稀釋到800 μg/mL 對(duì)副溶血弧菌ATCC17802 的抑菌圈消失，沒有抑制作用。桿菌七肽稀釋到50 μg/mL 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC3038仍然有抑菌圈，而桿菌七肽釋到200 μg/mL 對(duì)產(chǎn)氣莢膜梭菌CVCC2027 沒有發(fā)現(xiàn)抑菌作用。同時(shí)，在本試驗(yàn)條件下，桿菌七肽對(duì)李斯特菌、金黃色葡萄球菌、植物乳桿菌、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母菌均沒有抑制作用。

2.2 溫度對(duì)桿菌七肽抑菌活性的影響 由表3 可見，不同溫度（70、80、90℃）處理抗菌肽10 min 后稀釋成不同濃度，與對(duì)照（室溫放置）比較，桿菌七肽抑菌圈的直徑?jīng)]有發(fā)生明顯變化。

2.3 人工胃液、腸液對(duì)桿菌七肽抑菌活性的影響 由表4 可見，用人工腸液處理抗菌肽后稀釋成不同濃度，與未處理比較，60 min 之前，其抑菌圈直徑未發(fā)生明顯變化，90 min 時(shí)，抑菌圈減少0.5～1 mm，說明其抗菌肽活性稍微下降。表5 顯示，人工胃液處理抗菌肽后，稀釋成不同濃度與對(duì)照（0 min）比較，30 min 時(shí)其抑菌圈直徑輕微減小，但隨后（30～90 min）其抑菌圈的直徑?jīng)]有明顯變化，說明抗菌肽活性沒發(fā)生明顯變化。2.4 桿菌七肽溶血性試驗(yàn) 如表6 所示，不同濃度（12.5～100 μg/mL）桿菌七肽產(chǎn)品處理紅細(xì)胞，其溶血率均小于5%。

表2 桿菌七肽對(duì)不同菌株的抑菌效果（抑菌圈直徑） mm

表3 不同溫度處理抗菌肽后的抑菌效果（抑菌圈直徑） mm

表4 人工腸液處理抗菌肽后的抑菌效果（抑菌圈直徑） mm

表5 人工胃液處理抗菌肽后的抑菌效果（抑菌圈直徑） mm

表6 不同濃度抗菌肽產(chǎn)品對(duì)紅細(xì)胞溶血率 %

3 討 論

抑制腸道有害微生物生長(zhǎng)被認(rèn)為是飼用抗生素促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)的重要作用機(jī)理之一，故對(duì)病原菌的抑制效果可作為飼用抗生素替代品的研究和評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[11]。管碟法能夠直觀看到抗菌藥物對(duì)指示菌的抑菌作用所形成的抑菌圈，因此被廣泛應(yīng)用在抗菌譜和抗菌活性測(cè)定的實(shí)驗(yàn)中，該方法簡(jiǎn)單、快捷、成為抗菌物質(zhì)評(píng)價(jià)的重要方法[12]。對(duì)于同種抗菌劑，藥物濃度（或效價(jià)）與抑菌圈面積呈正比或直徑（diameter）的平方（D2）呈正比[13-15]，故抑菌圈直徑是評(píng)價(jià)指示菌對(duì)抗菌劑的敏感程度的重要指標(biāo)?？咕V是抗菌劑所能抑制和殺滅微生物的屬和種的集合，是抗菌肽的重要特性[16]。通過抑菌試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，桿菌七肽對(duì)受試的10 株革蘭氏陰性細(xì)菌都有抑菌作用，而只對(duì)7 株中的2 株革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌有抑制作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性益生菌植物乳桿菌、屎腸球菌、枯草芽孢桿菌也沒有抑制作用，說明桿菌七肽的抗菌譜主要為革蘭氏陰性細(xì)菌。

高溫制粒是飼料常用的加工方式，其可以減少飼料中的病原微生物、減少動(dòng)物采食過程中的浪費(fèi)、提高飼料消化率。本試驗(yàn)通過高溫水浴處理模擬飼料高溫過程，發(fā)現(xiàn)桿菌七肽對(duì)大腸桿菌的抑制效果沒有發(fā)生變化，這表明桿菌七肽對(duì)于高溫具有很好的穩(wěn)定性，其活性可以耐受飼料的高溫制粒過程?？咕耐ㄟ^口服形式飼喂動(dòng)物后在腸道起作用，必須具備耐受胃腸道的各種苛刻條件，而通過人工模擬腸胃液來(lái)體外評(píng)價(jià)是一種快速有效的方式。通過人工腸液和胃液處理?xiàng)U菌七肽發(fā)現(xiàn)，桿菌七肽對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑基本不受影響或影響很小，說明桿菌七肽在體外人工胃液和腸液中活性穩(wěn)定。溶血現(xiàn)象是指紅細(xì)胞被破壞后血紅蛋白被釋放出來(lái)，其反映了某種物質(zhì)對(duì)紅細(xì)胞細(xì)胞膜有破壞作用，從而反映了藥物的安全性。一些抗菌肽對(duì)動(dòng)物細(xì)胞存在溶血性而無(wú)法臨床應(yīng)用[17-18]，故溶血性是評(píng)價(jià)抗菌肽安全性的重要指標(biāo)，溶血性通過測(cè)定溶血率來(lái)評(píng)價(jià)，溶血率小于5%，就認(rèn)為測(cè)試藥物沒有溶血性[18]。本研究通過溶血性試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不同濃度的桿菌七肽對(duì)紅細(xì)胞溶血率均小于5%，說明其紅細(xì)胞溶血率低，具有較好的安全性。以上結(jié)果表明，桿菌七肽對(duì)細(xì)菌具有明顯的抑制作用，其穩(wěn)定性和安全性較高，體外試驗(yàn)的抑制效果能否在體內(nèi)腸道中體現(xiàn)，同時(shí)能否在生產(chǎn)中實(shí)現(xiàn)其促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，需要通過動(dòng)物飼喂試驗(yàn)和對(duì)生產(chǎn)性能、腸道微生物以及其免疫指標(biāo)的測(cè)定而得出替代某種或者某類飼用抗生素的結(jié)論。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，桿菌七肽是一種抗菌譜主要為革蘭氏陰性細(xì)菌的抗菌肽，對(duì)蛋白酶和熱處理具有很好的耐受性，紅細(xì)胞溶血率低，具有良好的開發(fā)應(yīng)用前景，能否有效替代飼用抗生素，需要體外試驗(yàn)進(jìn)一步研究，而具體的替代飼用抗生素可行性和方案，有待于結(jié)合動(dòng)物試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。