海南番木瓜炭疽病病原菌鑒定及其防治藥劑篩選

周子騫，李 敏，高兆銀，王 義，洪小雨，李春霞，胡美姣*

(1. 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；2. 宣化科技職業(yè)學(xué)院，河北 張家口 075100；3. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430070；4. 海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院，海南 ?？?570228)

【研究意義】番木瓜 (Caricapapaya) 俗稱木瓜，又名乳瓜、番瓜、萬壽果，素有“嶺南果王”之譽(yù)，屬番木瓜科 (Caricaceae)番木瓜屬 (Carica)[1]，為多年生常綠軟質(zhì)小喬木。在我國主要產(chǎn)區(qū)有海南、廣東、廣西、云南、福建和臺灣等省區(qū)[2]。番木瓜炭疽病則是番木瓜種植區(qū)主要病害之一，特別是在果實(shí)成熟采摘期及貯運(yùn)期間由其引起的果腐尤為嚴(yán)重。【前人研究進(jìn)展】目前國外已報道引起番木瓜炭疽病的病原真菌有Colletotrichumacutatum、C.brevisporum、C.capsici、C.demetium、C.magna以及C.truncatum等[3-6]，國內(nèi)已報道的有辣椒炭疽菌(C.capsici)和膠孢炭疽菌(C.gloeospcrides)[7-8]。【本研究切入點(diǎn)】為了明確海南番木瓜炭疽病主要病原菌的類型及篩選適宜的防治藥劑，根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合r DNA-ITS序列的測序，對該病的病原菌進(jìn)行分離鑒定，并進(jìn)行了防治殺菌劑的室內(nèi)篩選。【擬解決的關(guān)鍵問題】旨在為番木瓜炭疽病的病原識別及科學(xué)防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

番木瓜果實(shí)主要來自海南省?？谑心媳彼袌龊腿齺啞①僦莸鹊胤竟瞎麍@，在室溫下貯存待其成熟發(fā)病；健康果實(shí)采自三亞番木瓜果園，挑選新鮮、無損傷、大小成熟度一致的轉(zhuǎn)色期健康果實(shí)。

1.2 方法

1.2.1 病原微生物的分離與純化 從典型炭疽病癥狀果實(shí)的病健交界處取大小約3 mm×3 mm的組織塊，用0.1 %升汞酒精消毒30 s左右，用無菌水沖洗3～5次，將組織塊置于PDA平板上，待菌落長出后挑取邊緣菌絲進(jìn)行純化，將獲得純化的菌株進(jìn)行編號[9]。

1.2.2 病原微生物的致病性測定與病原菌再分離 根據(jù)柯赫氏法則，參考何凡等人[10]的方法稍作修改，采用刺傷接種法，對分離的40株病原菌進(jìn)行致病性測定。把健康果實(shí)置于保鮮盒中，用接種針刺傷(直徑約5 mm)果實(shí)，將培養(yǎng)4 d的菌餅接種到果實(shí)上，以接種空白的PDA塊為對照，用蘸有無菌水的脫脂棉覆在菌餅上24 h后取下，每個處理接種3個果實(shí)，每果實(shí)接種6個點(diǎn)，觀察發(fā)病情況，記錄病斑大小，分析致病性強(qiáng)弱。對發(fā)病果實(shí)再次進(jìn)行病原菌分離，比較分離前后得到的病原菌的菌落形態(tài)、色澤、菌絲及孢子等特征是否一致。試驗(yàn)重復(fù)3次。根據(jù)病斑大小評價致病力，評價標(biāo)準(zhǔn)為：平均病斑直徑：≥20 mm為強(qiáng)致病性，20～10 mm為中等致病性，≤10 mm為弱致病性。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS19.0 對病斑直徑數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

1.2.4 病原菌鑒定 ① 形態(tài)學(xué)鑒定:從2種典型癥狀各篩選出1株強(qiáng)致病菌，分別為C1菌株和G1菌株。將純化后的2菌株轉(zhuǎn)接到PDA平板上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每日觀察，記錄菌落培養(yǎng)特征，顯微鏡菌絲形態(tài)、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)以及分生孢子形態(tài)、顏色、大小等特征。② 分子生物學(xué)鑒定：采用CATB法提取供試C1菌株和G1菌株的總DNA，采用引物ITS1和ITS4對供試菌株基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物由青島派森諾基因科技有限公司進(jìn)行測序。測序結(jié)果經(jīng)GenBank中相關(guān)菌株的ITS序列進(jìn)行同源性比較。根據(jù)同源性大小結(jié)合形態(tài)學(xué)特征最后鑒定供試菌株的種類[11]。

1.2.5 17種殺菌劑對2菌株的室內(nèi)毒力測定 ① 供試殺菌劑見表1。②測定方法。采用生長速率法。參考張焱能等人的研究方法[12-15]并適當(dāng)改進(jìn)，在培養(yǎng)4 d后的供試菌株菌落邊緣取菌塊(直徑0.5 cm)分別移至濃度為0.1、1.0和100.0 μg/mL含藥培養(yǎng)基平板上，然后置于(28±0.5)℃的恒溫培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)3 d后，根據(jù)2菌株在不同濃度含藥培養(yǎng)基上的生長情況和抑菌率大小，將每種殺菌劑設(shè)置5個質(zhì)量濃度梯度，每質(zhì)量濃度3個處理，測量菌落大小，計算抑菌率。試驗(yàn)重復(fù)3次求平均抑菌率，并以質(zhì)量濃度的對數(shù)值(x)和抑菌率的幾率值(y)求毒力回歸方程，計算相關(guān)系數(shù)、EC50值，比較供試17種殺菌劑對2株炭疽菌的毒力大小。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑-0.5)-(處理菌落直徑-0.5)/對照菌落直徑-0.5

2 結(jié)果與分析

2.1 炭疽病癥狀、病原菌分離及致病性測定

2.1.1 癥狀 番木瓜炭疽病的典型發(fā)病癥狀主要有2種，一是在受害果實(shí)果面初期出現(xiàn)圓形水漬狀小斑點(diǎn)，后期病斑擴(kuò)大，病斑中央凹陷，其上呈現(xiàn)許多黑色顆粒；二是在受害果實(shí)果面初期出現(xiàn)圓形、橢圓形的水漬狀斑點(diǎn)，后期病斑擴(kuò)大，中央凹陷，其上呈現(xiàn)出赭紅色的孢子；2種炭疽菌危害果實(shí)后，嚴(yán)重時病斑擴(kuò)展至整個果面，凹陷部果肉硬化(圖1)。

2.1.2 病原菌的分離純化 從2種典型的炭疽病病果上分離病組織，移至PDA培養(yǎng)基上，于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，得到2種形態(tài)不同的菌落。一種菌落邊緣整齊，產(chǎn)生黑色素使培養(yǎng)基變黑色，菌落灰褐色，氣生菌絲稀疏，表面密生黑色顆粒并呈輪紋狀排列；另一種菌落邊緣整齊，灰白色，氣生菌絲白色絨毛狀，表面產(chǎn)生粉紅色孢子堆。

2.1.3 病原菌的致病性 研究結(jié)果表明，供試的40株病原菌對番木瓜果實(shí)均具有一定的致病性，而對照未發(fā)病，第一種癥狀分離的18株病原菌，菌株間致病力存在顯著差異(P<0.05)，其中，C1菌株為強(qiáng)致病力菌株，占該癥狀分離菌株數(shù)的5.56 %，5株為中等致病力菌株，占27.78 %；第二種癥狀分離的22株病原菌，菌株間致病力存在顯著差異(P<0.05)，其中，G1和G8為強(qiáng)致病菌株，菌株數(shù)占該癥狀分離菌株數(shù)的9.09 %，8株為中等致病力菌株，占36.36 %，強(qiáng)、中致病力菌株見表2。將C1菌株和G1菌株接種發(fā)病后的病斑再分離，得到的病原菌與原病原菌的菌落形態(tài)一致，因此認(rèn)定這2種病原菌(代表菌株為C1和G1)為番木瓜炭疽病的病原菌(圖1)。

表1 17種供試殺菌劑Table 1 17 kinds of test fungicides

注：懸浮劑為SC，乳油為EC，可濕性粉劑WP，水分散粒劑為WG，微乳劑為ME，水乳劑為EW，可溶粒劑為SG。

表2 炭疽病不同菌株對番木瓜果實(shí)的致病力測定Table 2 Pathogenicity of different isolates to papaya fruit

注：不同小寫字母表示P<0.05水平下顯著性差異(F-text)。
Note: Values followed by different lowercase letters within each column indicate significantly different at 0.05 levels byF-test.

2.2 病原菌鑒定

研究表明，C1菌株在PDA培養(yǎng)基上生長較慢(圖2)，生長速度為1.22～1.38 cm/d；初為灰白色，菌落近圓形，后期菌絲呈灰褐色，其上有有許多黑色顆粒呈輪紋狀分布；分生孢子盤上密生剛毛，剛毛黑色，頂端漸尖，基部膨大；分生孢子梗無色、圓柱形、瓶體式產(chǎn)孢；分生孢子鐮刀型，略彎，無色，單孢，兩端鈍形, 大小為2.21～4.81 μm×17.12～28.92 μm。G1菌株在PDA培養(yǎng)基上生長較快，生長速度為2.08～2.13 cm/d；氣生菌絲初期為白色絨毛狀，菌落圓形且邊緣整齊，后期菌絲呈灰白色絮狀，菌落上有赭紅色的分生孢子堆；分生孢子盤上產(chǎn)生黑色剛毛，頂端漸尖少數(shù)頂端呈乳突狀；分生孢子梗無色、圓柱形、瓶體式產(chǎn)孢；分生孢子圓柱形，無色，單孢，可見一或兩個油球，兩端鈍圓，大小為2.58～7.21 μm×7.42～17.71 μm。

A、C：炭疽病自然發(fā)病癥狀；B、D：分別是C1菌株和G1菌株接種癥狀；E：對照A,C: Anthranose natural symptoms with C1 and G1; B,D: Symptoms of pathogens C1 and G1; E:CK圖1 番木瓜炭疽病癥狀Fig.1 Anthranose Symptoms of papaya

測序結(jié)果顯示C1菌株(登錄號：KP784422)與辣椒炭疽菌(Colletotrichumcapsici)的同源性達(dá)到99 %，而G1菌株(登錄號：MH265979)與膠孢炭疽菌(C.gloeospcrides)的同源性也達(dá)到了99 %。分別將2個序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對發(fā)現(xiàn)C1菌株和辣椒炭疽菌(C.capsici)、G1菌株和膠孢炭疽菌(C.gloeospcrides)的同源性分別都達(dá)到了99 %。另外選取同源性高低不同的菌株進(jìn)行多重序列比較，并做系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明C1 菌株與辣椒炭疽菌(C.capsici)遺傳距離最小，聚為一類，G1菌株與膠孢炭疽菌(C.gloeospcrides)遺傳距離最小聚為一類(圖3)。在結(jié)合C1菌株和G1菌株的形態(tài)學(xué)特征，確定C1菌株為辣椒炭疽菌(C.capsici)，G1為膠孢炭疽菌(C.gloeospcrides)。

A:C1菌株在PDA上的菌落形態(tài)；B:分生孢子；C:分生孢子盤、剛毛及分生孢子；D:G1菌株在PDA上的菌落形態(tài)；E:分生孢子；F:分生孢子盤、剛毛及分生孢子A:Colony morphology of pathogen C1 on PDA; B:Conidia; C: Conidia disk, bristles and conidia; D: Colony morphology of pathogen G1 on PDA; E: Conidia; F: Conidia disk, bristles and conidia圖2 病原菌形態(tài)特征Fig.2 Morphological characteristics of anthracnose pathogens

圖3 基于炭疽菌rDNA-ITS序列構(gòu)建的C1菌株和G1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of isolate C1and G1 based on rDNA-ITS sequences of Colletotrichum spp.

2.3 17種殺菌劑對2菌株的抑制作用

試驗(yàn)結(jié)果表明，供試17種殺菌劑對C1和G1菌株菌絲生長均有不同程度的抑制作用(表3)。對于C1菌株500 mg/mL咪鮮胺WG毒力最強(qiáng)，EC50的值僅為0.03 μg/mL，其次為300 mg/mL咯菌腈SC和250 mg/mL丙環(huán)唑EC，EC50值分別為0.06 和0.13 μg/mL均小于1 μg/mL；EC50值小于10 μg/mL的有410 mg/mL苯醚甲環(huán)唑SC、500 mg/mL異菌脲WP 和750 mg/mL抑霉唑硫酸鹽SG，EC50的值分別為2.86 g/mL、5.00 μg/mL和8.11 μg/mL；EC50值小于20 μg/mL的有227 mg/mL二氰蒽醌SC、100 mg/mL多抗霉素WP、750 mg/mL百菌清WP、200 mg/mL抑霉唑EW、250 mg/mL溴菌腈ME、500 mg/mL福美雙WP和400 mg/mL嘧霉胺SC。對于G1菌株300 mg/mL咯菌腈SC毒力最強(qiáng)，EC50的值僅為0.01 μg/mL，其次為500 mg/mL咪鮮胺WG、250 mg/mL丙環(huán)唑EC、200 mg/mL抑霉唑EW、410 mg/mL苯醚甲環(huán)唑SC和430 mg/mL戊唑醇SC，EC50值分別為0.02、0.08、0.47、0.84和0.91μg/mL，均小于1 μg/mL；EC50的值小于10 μg/mL的有500 mg/mL多菌靈WP、750 mg/mL抑霉唑硫酸鹽SG、500 mg/mL福美雙WP、500 mg/mL異菌脲WP和500 mg/mL嘧菌酯WG，EC50的值分別為1.18、1.96、2.54、7.19和8.33μg/mL；EC50的值小于20 μg/mL的有25 %溴菌腈ME和75 %百菌清WP。

表3 17種殺菌劑對2株炭疽菌的毒力測定Table 3 Toxicity determination of 17 fungicides against two Colletotrichum spp.

續(xù)表3 Continued table 3

殺菌劑種類毒力回歸方程(y=ax+b) 相關(guān)系數(shù)(r)EC50值平均EC50值C.gloeospcridesy=1.177x+4.65560.9840??1.96異菌脲C.capsiciy=0.6219x+4.56550.9799??5.006.09C.gloeospcridesy=1.0274x+4.11960.9732??7.19抑霉唑C.capsiciy=0.4938x+4.45450.9660??12.736.60C.gloeospcridesy=1.3809x+5.44940.9913??0.47福美雙C.capsiciy=0.6771x+4.23010.9438?13.718.13C.gloeospcridesy=0.5098x+4.79350.9973??2.54百菌清C.capsiciy=0.4011x+4.55950.9759??12.5413.8C.gloeospcridesy=0.8515x+3.9970.9536?15.06二氰蒽醌C.capsiciy=0.4769x+4.52050.8783?10.1317.42C.gloeospcridesy=0.8381x+3.83250.9880??24.72戊唑醇C.capsiciy=0.4067x+4.36560.9862??36.3018.6C.gloeospcridesy=0.8656x+5.03610.9831??0.91多抗霉素C.capsiciy=0.9407x+4.00580.9494?11.4064.51C.gloeospcridesy=0.7432x+3.46120.9378?117.63嘧霉胺C.capsiciy=0.816x+3.95550.9217?19.0693.04C.gloeospcridesy=0.6195x+3.6230.9100?167.02溴菌腈C.capsiciy=0.851x+4.05580.9608??12.8793.04C.gloeospcridesy=1.2837x+3.50580.9736??14.59代森錳鋅C.capsiciy=0.5703x+3.02910.9977??2856.943843.54C.gloeospcridesy=0.4202x+3.4520.9860??4830.14嘧菌酯C.capsiciy=0.1788x+3.74740.9936??10129612.715064810.50C.gloeospcridesy=0.3609x+4.66770.9282?8.33多菌靈C.capsiciy=0.3421x+3.83940.9700?2469.311235.25C.gloeospcridesy=0.9838x+4.9280.9013?1.18

從對2菌株的平均EC50值看，410 mg/mL咪鮮胺WG<300 mg/mL咯菌腈SC<250 mg/mL丙環(huán)唑EC，均EC50值均小于1 μg/mL；其次410 mg/mL苯醚甲環(huán)唑SC<750 mg/mL抑霉唑硫酸鹽SG<500 mg/mL異菌脲WP，平均EC50均小于10 μg/mL；平均EC50值小于20 μg/mL是200 mg/mL抑霉唑EW<500 mg/mL福美雙WP<750 mg/mL百菌清WP<227 mg/mL二氰蒽醌SC<430 mg/mL戊唑醇SC。EC50值均高于100 μg/mL是多菌靈和代森錳鋅。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采集番木瓜炭疽病病果，采用柯赫氏法則對病原菌進(jìn)行分離、純化和致病性測定，根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合其rDNA-ITS區(qū)域的序列分析對病原菌進(jìn)行鑒定，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明導(dǎo)致海南番木瓜炭疽病的主要病原菌為辣椒炭疽菌(C.capsici)和膠孢炭疽菌(C.gloeospcrides)。在供試的17種殺菌劑中，500 μg/mL咪酰胺WG、300 μg/mL咯菌腈SC和250 mg/mL丙環(huán)唑EC對番木瓜炭疽病有較好的抑菌效果。

4 討 論

李建瑩等人研究表明炭疽菌在番木瓜生產(chǎn)中，從剛剛坐果的幼果到成熟采摘前的大果均可進(jìn)行潛伏侵染[16]。劉秀娟等人在1990-1992年對海南省番木瓜各種植區(qū)進(jìn)行了貯藏期發(fā)病調(diào)查，表明在番木瓜果皮中存在很多潛伏侵染的病原真菌，其中就以番木瓜膠孢炭疽菌(C.gloeospcrides)發(fā)生最普遍且致病性最強(qiáng)[17]。炭疽病一直為海南省番木瓜貯藏期的重要病害，本研究根據(jù)對病原真菌形態(tài)鑒定、致病性測定以及其rDNA-ITS序列同源性分析結(jié)果，進(jìn)一步確定辣椒炭疽菌(C.capsici)和膠孢炭疽菌(C.gloeospcrides)為番木瓜炭疽病的主要致病菌。

李敏等人對番木瓜膠孢炭疽菌進(jìn)行了室內(nèi)毒力測定，在供試的21中殺菌劑中，參考EC50值及斜率值綜合分析認(rèn)為，咪鮮胺、苯醚甲環(huán)唑、丙環(huán)唑、戊唑醇等均有較好的抑菌效果[18]。吳偉懷等人對番木瓜果腐鐮刀菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測定，結(jié)果表明在供試的9種藥劑中咪鮮胺的抑菌效果最為顯著[19]。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，不同殺菌劑對番木瓜炭疽病病原菌的抑制作用不同，其中500 mg/mL咪鮮胺WG、300 mg/mL咯菌腈SC和250 mg/mL丙環(huán)唑EC 這3種殺菌劑抑菌能力最強(qiáng)，410 mg/mL苯醚甲環(huán)唑SC、750 mg/mL抑霉唑硫酸鹽SG和500 mg/mL異菌脲WP 3種殺菌劑也具有較好的抑菌效果。綜合分析認(rèn)為，410 mg/mL咪鮮胺WG、300 mg/mL咯菌腈SC和250 mg/mL丙環(huán)唑可作為番木瓜炭疽病的防治藥劑。