基于線粒體D-loop區(qū)序列和Cyt b基因的鱘魚群體遺傳多樣性分析

孔 杰，劉 偉，李世凱，周 洲，趙 鳳

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 水產(chǎn)研究所，貴州 貴陽 550025)

【研究意義】西伯利亞鱘(A.baerii)和施氏鱘(Acipenserschrenkii)屬于鱘科(Acipenseridae)鱘屬(Acipenser)，淡水定居鱘種，是我國鱘魚養(yǎng)殖生產(chǎn)的主要品種。鱘魚是多倍體起源魚類，雜交能力強(qiáng)，由于鱘魚性成熟時間長，親魚培育成本高，導(dǎo)致養(yǎng)殖場常忽略鱘魚繁殖中的遺傳背景問題，種質(zhì)混亂現(xiàn)象普遍，而后備親魚的遺傳多樣性直接影響到苗種質(zhì)量，因此對后備親魚的遺傳多樣性研究十分必要?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】線粒體DNA(Mitochondrial DNA，mtDNA)與核基因組相比，具有變異率高、進(jìn)化速度快，無組織特異性、母系遺傳的特點，被廣泛應(yīng)用于魚類的群體遺傳學(xué)研究，如鱘鰉魚[1-2]、鯉[3]分子鑒定，鱘魚[4-6]、銀鯧[7]、裂腹魚[8-9]等的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)研究。mtDNA的不同區(qū)域進(jìn)化速度不同，適合不同水平的進(jìn)化研究。其中，線粒體控制區(qū)(D-loop)位于tRNAPro和rRNAPhe基因之間的控制區(qū)，不參與編碼蛋白，是mtDNA序列中變異最大的區(qū)域，進(jìn)化速度快，適用于親緣關(guān)系較近群體間的比較研究和種群水平差異檢測[10-11]；細(xì)胞色素b(Cytb)基因是編碼蛋白基因，進(jìn)化速度適中，適合魚類的種間和種內(nèi)遺傳分化研究[11-12]。結(jié)合D-loop和Cytb分子標(biāo)記可以更準(zhǔn)確地分析魚類種內(nèi)遺傳變異?！颈狙芯壳腥朦c】以施氏鱘和西伯利亞鱘親魚群體為研究對象，開展mtDNA Cytb基因和D-loop的序列對比分析，探討2標(biāo)記對鱘魚遺傳多樣性分析結(jié)果的差異與關(guān)系。【擬解決的關(guān)鍵問題】旨在擴(kuò)大研究結(jié)果之間橫向比較，使結(jié)果更客觀，評估養(yǎng)殖場施氏鱘和西伯利亞鱘后備親魚群體的遺傳多樣性，為鱘魚的遺傳選育提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

于2017年11月在貴州省惠水鱘魚養(yǎng)殖廠，分別采集西伯利亞鱘親本尾鰭樣本26個，施氏鱘親本尾鰭樣本29個。尾鰭樣本固定于無水乙醇中，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 基因組提取與擴(kuò)增

剪取約50 mg鱘魚鰭條樣本，液氮研磨至粉末，采用磁珠法基因組DNA(動物)抽提試劑盒(上海生工)進(jìn)行DNA提取，DNA質(zhì)量與濃度用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop lite(Thermo Scientific)紫外分光光度計進(jìn)行測定。Cytb的擴(kuò)增引物[13]，Cytb-F：5′-GACTTGAAAAACCACCGTTG-3′，Cytb-R：5′-CTCCATCTCCGGTTTACAAGAC-3′；D-loop區(qū)序列的擴(kuò)增引物[14]，tpro-F1：5′-AACTCCCAAAGCTAAGATTC-3′，phe-R2：5′-ATCCTTTAGTTAAGCTACGC-3′。

PCR反應(yīng)總體積為50 μl，其中：模板DNA 100 ng，PremixTaq25 μl，上下游引物(10 μmol/L)各1 μl，補充無菌水至50 μl。PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性45 s，54 ℃/56 ℃(D-loop/Cytb)退火45 s，72 ℃延伸90 s/2 min(D-loop/Cytb)，擴(kuò)增35個循環(huán)；最后72 ℃延伸8 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測后，由上海生工進(jìn)行測序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用MEGA 6.0 軟件對序列進(jìn)行多重比較，分析序列堿基組成、平均轉(zhuǎn)換/顛換率和變異位點。采用DnaSP 5.0 軟件統(tǒng)計獲取群體序列遺傳多樣性參數(shù)，如單倍型個數(shù)(h)、單倍型多樣性(Hd)、核苷酸多樣性(π)、平均核苷酸差異(K)和Tajima’s D、Fu’s Fs值等。

2 結(jié)果與分析

2.1 西伯利亞鱘與施氏鱘的序列對比

2.1.1 Cytb序列 對西伯利亞鱘、施氏鱘Cytb序列測序并經(jīng)人工序列校正，選擇西伯利亞鱘1075 bp、施氏鱘1068 bp進(jìn)行序列比對。從表1看出，西伯利亞鱘Cytb基因在1075 bp序列中，變異位點5個，均為單突變位點。A、T、C、G堿基的平均含量分別為26.1 %、27.1 %、31.6 %和15.2 %，A+T含量略高于G+C含量，基于最大似然法估算的轉(zhuǎn)換/顛換比為4.0。

施氏鱘Cytb基因在1068 bp序列中，變異位點4個，約占分析位點的0.4 %，其中簡約信息位點3個，單突變位點1個。A、T、C、G堿基的平均含量分別為26.7 %、26.9 %、31.9 %和14.6 %，A+T含量略高于G+C含量，基于最大似然法估算的轉(zhuǎn)換/顛換比為3.0。

2.1.2 D-loop序列 對西伯利亞鱘、施氏鱘D-loop全序列測序并經(jīng)人工序列較正，選擇施氏鱘780 bp，西伯利亞鱘994 bp進(jìn)行序列比對。從表1還可看出，西伯利亞鱘D-loop在994 bp序列中，變異位點2個，約占分析位點的0.2 %，其中簡約信息位點1個，單突變位點1個。A、T、C、G堿基的平均含量分別為32.3 %、32.0 %、21.7 %和14.0 %，A+T含量明顯高于G+C含量，基于最大似然法估算的轉(zhuǎn)換/顛換比為1.0。

施氏鱘D-loop在780 bp序列中，共有變異位點55個，約占分析位點的7.0 %，其中簡約信息位點39個，單突變位點16個。A、T、C、G堿基的平均含量分別為30.2 %、31.6 %、20.4 %和17.8 %，A+T含量明顯高于G+C含量，基于最大似然法估算的轉(zhuǎn)換/顛換比為4.2。

表1 西伯利亞鱘和施氏鱘的序列信息 Table 1 Base sequence information of A. baerii and A. schrenkii population

2.2 親魚群體遺傳多樣性

2.2.1 施氏鱘 從表2～3看出，基于D-loop基因，施氏鱘親魚養(yǎng)殖群體多態(tài)性位點數(shù)為55個、單倍型5個、單倍型多樣性0.707、核苷酸多樣性0.02242、平均核苷酸差異16.906。共定義了5個單倍型，其中Hap5為優(yōu)勢單倍型，代表14個個體，占總體個數(shù)的48.3 %。

基于Cytb基因，施氏鱘親魚養(yǎng)殖群體多態(tài)性位點數(shù)為4個、單倍型4個、單倍型多樣性0.612、核苷酸多樣性0.00114、平均核苷酸差異1.221。共定義了4個單倍型，其中Hap2為優(yōu)勢單倍型，代表17個個體，占總體個數(shù)的58.6 %。

2.2.2 西伯利亞鱘 從表2～3還可看出，基于Cytb基因，西伯利亞鱘親魚養(yǎng)殖群體多態(tài)性位點數(shù)為5個、單倍型多樣性0.151、核苷酸多樣性0.00036、平均核苷酸差異0.385。共定義了3個單倍型，其中Hap1為優(yōu)勢單倍型，代表24個個體，占總體個數(shù)的92.3 %。

基于D-loop基因，西伯利亞鱘親魚養(yǎng)殖群體多態(tài)性位點數(shù)為2個、單倍型多樣性0.385、核苷酸多樣性0.00040、平均核苷酸差異0.400。共定義了3個單倍型，其中Hap1為優(yōu)勢單倍型，代表20個個體，占總體個數(shù)的76.9 %。

2.3 中性檢驗

從表4看出，西伯利亞鱘群體基于Cytb和D-loop的Tajima’s D值分別為-2.0020和-0.50721，F(xiàn)u’s Fs值分別為-0.527和-0.445，可推測在西伯利亞鱘親魚群體中低頻率等位基因占主導(dǎo)作用。

表2 西伯利亞鱘和施氏鱘的遺傳多樣性參數(shù)Table 2 Genetic diversity of A. baerii and A. schrenkii population

表3 基于Cyt b和D-loop序列的單倍型在西伯利亞鱘和施氏鱘群體中的分布Table 3 Distribution of haplotype in Cyt b and D-loop sequences of A. baerii and A. schrenkii population

表4 西伯利亞鱘和施氏鱘的中性檢驗結(jié)果Table 4 Neutrality test of A. baerii and A. schrenkii population

施氏鱘群體基于Cytb和D-loop的Tajima’s D值分別為0.3826和0.8636，F(xiàn)u’s Fs值分別為0.674和17.108，且其P值不顯著，表明該群體未經(jīng)歷過種群擴(kuò)張。

3 討 論

3.1 西伯利亞鱘與施氏鱘的Cyt b、D-loop序列信息

線粒體基因組中A、T、G、C的分布呈不均一性[15]，而堿基A+T含量高的線粒體基因在進(jìn)化中更具優(yōu)勢[16]。本研究西伯利亞鱘、施氏鱘D-loop的A+T含量分別為64.3 %和61.8 %，大于其Cytb的A+T含量，表明堿基組成具有偏倚性。施氏鱘群體D-loop的A+T含量高于牛翠娟等[6]研究的施氏鱘群體(57.9 %)，與王巍等[5]研究的施氏鱘群體(61.8 %)和西伯利亞群體(62.2 %)的含量相當(dāng)。由此推斷，本研究施氏鱘和西伯利亞鱘群體的D-loop比Cytb基因在進(jìn)化中更具優(yōu)勢。

在生物體進(jìn)化中顛換不斷積累，因此轉(zhuǎn)換/顛換比不斷減小，一般認(rèn)為轉(zhuǎn)換/顛換比小于2時，基因序列突變已經(jīng)達(dá)到飽和狀態(tài)[17]。本研究西伯利亞鱘D-loop的轉(zhuǎn)換/顛換比小于2，表明突變已達(dá)飽合狀態(tài)。

基于Cytb和D-loop分析施氏鱘群體的Tajima’s D和Fu’s Fs值為正值，表明施氏鱘群體的中等頻率等位基因占主導(dǎo)，該種群在經(jīng)歷瓶頸時使稀有等位基因丟失，且其P值不顯著，表明該群體未經(jīng)歷過種群擴(kuò)張?；贑ytb和D-loop分析西伯利亞鱘群體的Tajima’s D和Fu’s Fs值均為負(fù)值，表明西伯利亞鱘群體中存在許多稀有等位基因，可能是在定向選擇中削弱了原有等位基因在群體中的頻率。

3.2 西伯利亞鱘與施氏鱘的遺傳多樣性

遺傳多樣性是魚類遺傳育種的一個重要參考指標(biāo)，其高低意味著生物適應(yīng)生存能力的強(qiáng)弱，多樣性越高生物體便有越豐富的育種和遺傳改良潛力[18-19]。衡量一個種群mtDNA的遺傳多樣性有2個重要指標(biāo)：單倍型多樣性(Hd)和核苷酸多態(tài)性(π)[20]。π值考慮了各種mtDNA單倍型在群體中所占的比例，因此反映一個群體多態(tài)程度往往比單純的遺傳距離平均值更準(zhǔn)確，π值高則說明種群的遺傳多樣性較高[21]。

牛翠娟等[6]通過D-loop序列對施氏鱘群體的遺傳多樣性分析顯示，核苷酸多樣性(π)為0.011，單倍型多樣性(Hd)為0.768，認(rèn)為后備親魚有一定的遺傳變異程度。王巍等[5]對鱘魚的遺傳多樣性分析顯示，施氏鱘(π=0.002，Hd=0.608)、西伯利亞鱘(π=0.005，Hd=0.706)后備親魚群體遺傳多樣性偏低。從其他魚類的遺傳多樣性看，香魚群體[22]D-loop的π=0.00199、Hd=0.81075，Cytb的π=0.00028、Hd=0.323，其群體遺傳水平較低；赤眼鱒野生群體[11]D-loop的π=0.0284、Hd=0.963，Cytb的π=0.0426、Hd=0.9710，具有較高的遺傳多樣性水平。本研究基于mtDNA Cytb基因、D-loop序列研究的遺傳多樣性顯示，西伯利亞鱘Cytb的π=0.00036、Hd=0.151，D-loop的π=0.0040、Hd=0.385；施氏鱘Cytb的π=0.00114、Hd=0.612，D-loop的π=0.02242、Hd=0.707；施氏鱘群體的遺傳多樣性略高于西伯利亞鱘群體，但與上述多樣性豐富的魚類相比，西伯利亞鱘、施氏鱘后備親魚群體的遺傳多樣性均較匱乏。因此，在繁殖中應(yīng)注意引進(jìn)其他產(chǎn)地的親魚，以增加現(xiàn)有后備親魚群體的遺傳多樣性。

本研究初步反映了西伯利亞鱘、施氏鱘親魚群體的遺傳背景、遺傳結(jié)構(gòu)以及遺傳變異水平，但mtDNA標(biāo)記與核基因標(biāo)記并不成正相關(guān)關(guān)系?？梢越Y(jié)合核基因組分子標(biāo)記如SSR、SNP，以更全面的展示該群體的遺傳多樣性，為親魚選育、苗種培育提供更充分的理論依據(jù)。

4 結(jié) 論

施氏鱘和西伯利亞鱘群體的D-loop比Cytb基因在進(jìn)化中更具優(yōu)勢；西伯利亞鱘D-loop區(qū)突變已達(dá)飽合狀態(tài)；施氏鱘群體的中等頻率等位基因占主導(dǎo)，該群體未經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，西伯利亞鱘群體中存在許多稀有等位基因；西伯利亞鱘、施氏鱘后備親魚群體的遺傳多樣性均較匱乏。