miRNA簇基因在山羊組織和不同時(shí)期的C2C12細(xì)胞的表達(dá)分析

李 杰，任航行，王高富，蔣 婧,孫曉燕，周 鵬

(重慶市畜牧科學(xué)院草食牲畜研究所，重慶 榮昌 402460)

【研究意義】骨骼肌的形成是一個(gè)高度復(fù)雜且有序的生物學(xué)過(guò)程，主要包括成肌決定，成肌細(xì)胞增殖，細(xì)胞周期的退出，肌肉特異性基因的表達(dá)，肌細(xì)胞融合形成多核肌管，多核肌管再經(jīng)過(guò)一系列發(fā)育變化, 最后分化成為具有功能的成熟肌纖維[1-2]。這些復(fù)雜過(guò)程的順利進(jìn)行不僅受許多編碼蛋白的因子調(diào)節(jié)，如成肌調(diào)節(jié)因子家族(MRFs)，肌細(xì)胞增強(qiáng)子因子2家族(MEF2)和對(duì)框基因(Pax)家族，而且還受到非編碼RNAs的調(diào)控，如microRNAs (miRNAs)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】miRNAs 是一類新發(fā)現(xiàn)的非編碼小分子 RNA，長(zhǎng)約22nt(核苷酸)，通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)，引起靶mRNA降解、穩(wěn)定性下降或者抑制其翻譯，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄后表達(dá)水平[3]。研究表明，miRNAs參與了增殖、分化、凋亡、發(fā)育從細(xì)胞到個(gè)體的整個(gè)生命過(guò)程及腫瘤發(fā)生過(guò)程[4]。miR-665，miR-127-3p/5p，miR-136-3p/5p, miR-432-3p/5p和miR-433同位于山羊21號(hào)染色體，形成一個(gè)特殊的miRNA簇。筆者前期用高通量測(cè)序(RNA-Seq)法對(duì)Texel 羊(MSTN突變型)與烏珠穆沁羊(MSTN野生型)胎兒骨骼肌miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miR-127-3p與miR-1/206/133在兩品種羊骨骼肌中在骨骼肌高表達(dá)miRNAs，且miR-127-3p在2個(gè)品種羊骨骼肌中差異表達(dá)[5]。Li 等的研究發(fā)現(xiàn)miR-127-3p在波爾山羊肌肉組織表達(dá)量高于巫山黑山羊，同時(shí)miR-127-3p 在增殖的C2C12細(xì)胞的表達(dá)量高于分化時(shí)期的細(xì)胞[6]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】而位于同一個(gè)miRNA簇的miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433在山羊組織和細(xì)胞的表達(dá)模式目前尚未見相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道。本研究首先以波爾山羊體組織為試驗(yàn)材料，檢測(cè)在不同組織中miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)的表達(dá)情況，接著分別檢測(cè)C2C12細(xì)胞增殖與分化不同生肌時(shí)間點(diǎn)第0、2、4、6、8 天中miRNA簇基因動(dòng)態(tài)表達(dá)模式?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】為闡明miRNA簇基因在骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控作用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

在巫山縣振興農(nóng)牧科技開發(fā)有限公司隨機(jī)選取3只成年的波爾山羊，屠宰后立即采集樣品，DEPC水清洗后裝管置于液氮中，用于肌肉組織RNA提取。C2C12細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。TRIzol Reagent購(gòu)自invitrogen公司(美國(guó))；miScript Π RT Kit與miScript SYBR Green PCR Kit 均購(gòu)自QIAGEN公司(德國(guó))；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自gibco公司(北京)；胎牛血清(FBS)、馬血清(HS)和青鏈霉素購(gòu)自HyClone公司(新西蘭)；其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

C2C12細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基(GM)為含10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到85 %左右時(shí)更換為分化培養(yǎng)基(DM)為含2 %馬血清的DMEM培養(yǎng)基，GE和DM中均需均加入1 %的雙抗, 隔天更換一次培養(yǎng)基。分別在增殖和分化階段的0、2、4、6、8 d收集細(xì)胞，用于提取細(xì)胞的miRNA。

1.3 miRNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

組織提前用液氮充分研磨，細(xì)胞吸棄培養(yǎng)基后，用PBS清洗2～3次，加入 TRIzol 提取 RNA。組織和細(xì)胞的總RNA按照TRIzol Reagent(Invitrogen，美國(guó))提取試劑盒的操作步驟提取。RNA完整性用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，濃度和純度采用 NanoDrop 2000 超微量分光光度計(jì)(Thermo，美國(guó)) 檢測(cè)。經(jīng)檢測(cè)完整性良好的RNA用miScript Π RT Kit(QIAGEN，德國(guó))反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。其中反應(yīng)體系為 20 μl，包含3 μl(400 ng/μl)，5×miScript HiSpec Buffer 4 μl，10×miScript Nucleics Mix 2 μl，miScript Reverse Transcriptase Mix 2 μl，RNase ddH2O 9 μl。合成產(chǎn)物-20 ℃保存?zhèn)溆?表1)。

表1 miRNA 簇基因引物序列信息Table 1 Primer information of miRNA cluster genes

1.4 RT-qPCR

按照miScript SYBR Green PCR Kit(QIAGEN, 德國(guó))試劑盒說(shuō)明書，對(duì)組織與細(xì)胞進(jìn)行熒光定量檢測(cè)分析，U6作為內(nèi)參基因。反應(yīng)體系(20 μl)：模板cDNA 1 μl，2×QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix 10 μl，10×miScript Universal Primer和引物各1 μl，RNase ddH2O 7 μl。反應(yīng)程序: 95 ℃ 預(yù)變性 15 min，94℃ 變性 15 s，55 ℃ 退火30 s，70 ℃延伸30 s, 共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次，所有反應(yīng)在7900HT Fast Real-Time PCR System(Applied Biosystems，美國(guó))中進(jìn)行。

1.5 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR中miRNA相對(duì)表達(dá)量用 2-ΔΔCT法計(jì)算，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE) 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 miRNA簇基因在山羊染色體的位置分布

由圖1可知，miRNA簇基因分布于山羊21號(hào)染色體，miR-665位置較前，而其他miRNA在染色體的位置相對(duì)集中，依次為miR-433、miR-127-5p、miR-432-3p/5p, 最后是miR-136-3p/5p。miR-433與miR-127-5p所處的位置有部分重疊基因位點(diǎn)。通過(guò)BLAST (http://www. ncbi. nlm. nih.gov/) 比較分析miRNA簇基因成熟序列，發(fā)現(xiàn)其在哺乳動(dòng)物中有較高的保守性。

Chromosome 21-NC_030828.1圖1 miRNA簇基因在山羊染色體的位置Fig.1 miRNA cluster genes in the position of goat chromosome

圖2 miRNA簇基因在波爾山羊體組織的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 Relative expression of miRNA cluster genes in Boer goats tissues

2.2 miRNA簇基因在山羊體組織的表達(dá)分析

采用qRT-PCR方法檢測(cè)波爾山羊的心、肝、脾、肺、腎和背最長(zhǎng)肌組織中miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)的表達(dá)量。由圖2 可知，miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)在山羊不同組織中均廣泛表達(dá)。miR-127-5p，miR-136-3p， miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433在肌肉中高表達(dá)，miR-136-5p和miR-665在肌肉表達(dá)量低。

2.3 miRNA簇基因在C2C12細(xì)胞不同生肌時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)表達(dá)分析

培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞，分別收集增殖和分化不同階段的細(xì)胞樣品，采用qRT-PCR分別檢測(cè)在不同生肌時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)的表達(dá)模式。由圖3可知，miR-136-3p表達(dá)量隨肌細(xì)胞增殖和分化逐漸增加，在培養(yǎng)的第8天中表達(dá)最高。miR-127-5p，miR-432-3p，miR-432-5p，miR-433和miR-136-5p表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，miR-127-5p和miR-433在增殖與分化的第6天的表達(dá)最高；miR-432-3p在增殖的第2天與分化的第6天表達(dá)最高；miR-432-5p在增殖的第4天與分化的第8天表達(dá)最高；miR-136-5p在增殖與分化的第2天表達(dá)最高。miR-665隨C2C12細(xì)胞增殖和分化表達(dá)逐漸降低。

3 討 論

通常miRNA與其宿主基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的同時(shí)會(huì)受到多種因子的調(diào)控，miRNA卻往往表現(xiàn)出一定的組織和時(shí)空的特異性。miR-1/miR-206 /miR-133僅在肌肉組織中特異表達(dá)，而miR-127-3p在動(dòng)物的多個(gè)組織廣泛表達(dá)，且在肌肉、皮膚和脾臟中表達(dá)較高[6-7]。本研究采用qRT-PCR法對(duì)波爾山羊組織中miRNA簇基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)在山羊不同組織中均廣泛表達(dá)。miR-127-5p，miR-136-3p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433在肌肉中高表達(dá)，miR-136-5p和miR-665在肌肉表達(dá)量低。揭示了miRNAs的組織表達(dá)特征，確定了miRNA簇基因與山羊肌肉表型的關(guān)系。骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育主要表現(xiàn)為肌細(xì)胞數(shù)量的增加和體積的增大，這兩方面的順利進(jìn)行依賴于成肌細(xì)胞的增殖和分化[8]。miRNAs在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因表達(dá)，在成肌細(xì)胞增殖和分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用[9]。筆者近期研究發(fā)現(xiàn) miR-127-3p 表達(dá)量隨 C2C12 肌細(xì)胞分化逐漸增高，暗示 miR-127-3p 參與骨骼肌細(xì)胞分化的調(diào)控[6]。體外培養(yǎng)C2C12成肌細(xì)胞，采用qRT-PCR法分別檢測(cè)在C2C12增殖和分化不同生肌時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞中miRNA簇基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)miR-136-3p表達(dá)量隨肌細(xì)胞增殖和分化逐漸增加。miR-127-5p，miR-432-3p，miR-432-5p，miR-433和miR-136-5p表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低，miR-665在C2C12增殖和分化的過(guò)程中表達(dá)逐漸降低。該研究首次確定miRNA簇基因在山羊體組織的表達(dá)水平，并分析C2C12細(xì)胞增殖和分化階段的動(dòng)態(tài)表達(dá)模式。

圖3 miRNA簇基因在C2C12細(xì)胞增殖和分化的不同階段的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 Relative expression of miRNA cluster genes during C2C12 myoblast proliferation and differentiation

本研究發(fā)現(xiàn)miR-127-5p在山羊組織中廣泛表達(dá)，其在增殖的C2C12細(xì)胞的表達(dá)量高于分化時(shí)期，這與筆者等[6]的研究確定miR-127-3p在山羊體組織廣泛表達(dá)，其在增殖的肌細(xì)胞的表達(dá)量高于分化時(shí)期的結(jié)果是一致。但文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-127在桐城豬組織的表達(dá)高于長(zhǎng)白豬，而且miR-127主要在胚胎發(fā)育的中后期保持較高的表達(dá)水平，在發(fā)育的早期和出生后表達(dá)相對(duì)低[7]。這顯然不同于miR-127在豬上的研究報(bào)道。分析原因可能是miR-127 基因在經(jīng)pre-miR-127剪輯后生成兩種形式的成熟的miRNA：miR-127-3p 和miR-127-5p，而該研究?jī)H是檢測(cè)miR-127-5p的表達(dá)水平。miR-433在肌肉組織和C2C12細(xì)胞高表達(dá)，其與miR-127來(lái)自于同一個(gè)重疊基因位點(diǎn)，暗示miR-433可能也在成肌增殖與分化過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。但目前研究多集中報(bào)道m(xù)iR-433抑制乳腺癌增長(zhǎng)[10]，食管癌的增殖與侵襲[11]以及人骨肉瘤細(xì)胞凋亡[12]等醫(yī)學(xué)方面。miR-432基因在經(jīng)pre-miR-432剪輯后生成兩種形式的成熟的miRNA：miR-432-3p 和miR-432-5p。miR-432-3p在肌肉組織高表達(dá)，在增殖的C2C12細(xì)胞的表達(dá)量高于分化時(shí)期，暗示miR-432-3p可能參與骨骼肌肌細(xì)胞的生成，與肌肉生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)。這與Ma等[13]發(fā)現(xiàn)miR-432在小鼠的組織與細(xì)胞的表達(dá)是一致的。但是Ma主要分析了細(xì)胞前期中的miR-432的表達(dá)，該研究檢測(cè)miR-432-3p增殖與分化過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)。miR-432-5p在肌肉組織和C2C12細(xì)胞高表達(dá)，需要進(jìn)一步的深入研究其在成肌細(xì)胞生成過(guò)程中的調(diào)控功能。miR-136-3p在波爾山羊肌肉組織中高表達(dá)，其表達(dá)量隨著肌細(xì)胞增殖和分化逐漸增加。Lu等[14]高通量測(cè)序(RNA-Seq)法分析發(fā)現(xiàn)在豬骨骼肌miR-136表達(dá)量高。之前利用高通量測(cè)序(RNA-Seq)法對(duì)胚胎期和出生的簡(jiǎn)洲大耳羊的背最長(zhǎng)肌miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，發(fā)現(xiàn)miR-136-5p是骨骼肌高表達(dá)miRNA[15]。該研究主要分析成年山羊miR-136-5p的表達(dá)水平，可能是由于miR-136-5p在山羊的早期發(fā)育高表達(dá)，而成年后表達(dá)量減少。進(jìn)一步揭示了miR-136對(duì)哺乳動(dòng)物骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育起重要作用。研究報(bào)道m(xù)iR-665抑制卵巢癌細(xì)胞的增長(zhǎng)和遷移[16]，同時(shí)MiR-665還抑制髓核細(xì)胞的增殖和基質(zhì)降解[17]。miR-665在C2C12細(xì)胞增殖和分化的過(guò)程中表達(dá)逐漸降低。暗示可能其在C212細(xì)胞中是具有相同的抑制作用。

通過(guò)體內(nèi)和體外研究分析miRNA簇基因(miR -665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)表達(dá)模式，確定在個(gè)體與細(xì)胞水平miRNAs的表達(dá)水平，系統(tǒng)闡述了miRNA簇基因表現(xiàn)出一定的組織和時(shí)空的特異性，揭示其對(duì)肌肉生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)控的分子機(jī)理，不但對(duì)將來(lái)畜禽基因工程育種，也對(duì)人類肌肉疾病的發(fā)病機(jī)理的研究與治療提供參考。

4 結(jié) 論

體內(nèi)組織檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miRNA簇基因(miR-665，miR-127-5p，miR-136-3p，miR-136-5p，miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433)在山羊不同組織中均廣泛表達(dá)。miR-127-5p, miR-136-3p， miR-432-5p，miR-432-3p和miR-433在肌肉中高表達(dá)，miR-136-5p和miR-665在肌肉表達(dá)量低。體外細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，miR-136-3p表達(dá)量隨肌細(xì)胞增殖和分化逐漸升高；miR-127-5p，miR-432-3p，miR-432-5p，miR-433和miR-136-5p表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)；miR-665在隨C2C12細(xì)胞增殖和分化表達(dá)逐漸降低。綜上，推測(cè)miRNA簇基因可能參與骨骼肌細(xì)胞增殖與分化的過(guò)程。下一步將通過(guò)構(gòu)建過(guò)表達(dá)、干擾載體，轉(zhuǎn)染衛(wèi)星細(xì)胞或成肌細(xì)胞，系統(tǒng)闡述miRNA簇基因?qū)趋兰∩L(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控功能。