NMD逃逸機(jī)制及其在疾病治療中的應(yīng)用

程苗苗，曹延延

綜 述

NMD逃逸機(jī)制及其在疾病治療中的應(yīng)用

程苗苗，曹延延

首都兒科研究所遺傳室，北京 100020

無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是指在病理或正常生理情況下mRNA上出現(xiàn)了提前終止密碼子(premature termination codon, PTC)，從而導(dǎo)致mRNA降解。它是一種廣泛存在的mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制。近年來，在多種疾病中發(fā)現(xiàn)某些PTC并未觸發(fā)NMD，這種現(xiàn)象被稱為NMD逃逸(NMD escape)，然而其確切機(jī)制尚不十分清楚。目前公認(rèn)的兩個(gè)學(xué)說為：(1) PTC通讀，即蛋白的翻譯可以順利通過PTC直至正常的終止密碼子，產(chǎn)生全長蛋白；(2)翻譯的重新啟動，即蛋白翻譯在PTC下游的潛在起始點(diǎn)重新開始直至終止密碼子，產(chǎn)生N端截短蛋白。目前，通過利用PTC通讀，越來越多的藥物或小分子已被成功用于無義變異相關(guān)疾病的治療。本文主要綜述了NMD逃逸的機(jī)制及其在疾病治療中的應(yīng)用和進(jìn)展，以期為進(jìn)一步了解NMD逃逸及其相關(guān)應(yīng)用概況提供參考。

NMD逃逸；無義突變；提前終止密碼子；PTC通讀

無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay, NMD)是一種廣泛存在于真核生物的mRNA質(zhì)量監(jiān)控機(jī)制，特異性識別并降解含有提前終止密碼子(premature termination codon, PTC)的mRNA[1]，同時(shí)NMD也是機(jī)體調(diào)控基因表達(dá)的重要方式之一。在正常生理情況下，mRNA的可變剪接、轉(zhuǎn)錄錯誤或程序性基因重排可產(chǎn)生PTC，觸發(fā)NMD途徑使其降解，從而阻止有害的截短蛋白的產(chǎn)生。在病理情況下，以無義和移碼變異為主的基因突變也可產(chǎn)生PTC，通過觸發(fā)NMD降解mRNA導(dǎo)致靶蛋白表達(dá)下降從而引發(fā)疾病[2,3]。約1/3已知病因的人類遺傳病是由基因突變產(chǎn)生的PTC所致[4]。

在哺乳動物細(xì)胞中，前體mRNA被剪接后在距離外顯子與外顯子連接點(diǎn)(exon-exon junction, EEJ)上游約20~24個(gè)核苷酸的位置處會形成一個(gè)外顯子–外顯子連接點(diǎn)復(fù)合物(exon-exon junction complex, EJC)。在正常的翻譯過程中，核糖體沿著mRNA移動，替換下游所有的EJC并在正常的終止密碼子處停止翻譯，產(chǎn)生全長蛋白。若mRNA中存在PTC，翻譯核糖體會在PTC處停止，募集UPF1、SMG1和兩個(gè)翻譯釋放因子(eRF1和eRF3)形成SURF復(fù)合物。該復(fù)合物通過對下游EJC的識別，使NMD的核心組分-UPF1、UPF2和UPF3相互作用，最終導(dǎo)致UPF1發(fā)生磷酸化。磷酸化的UPF1一方面靶向作用于翻譯起始因子eIF3抑制下一輪翻譯的開始，另一方面進(jìn)一步招募具有核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶活性的SMG系列因子介導(dǎo)mRNA的降解[5]。NMD效率在不同的轉(zhuǎn)錄本、細(xì)胞和組織類型以及個(gè)體間均存在廣泛的變異性，更有甚者甚至不發(fā)生NDM，即產(chǎn)生了所謂的NMD逃逸(NMD escape)現(xiàn)象。本文對NMD逃逸的機(jī)制及其在臨床中的應(yīng)用進(jìn)行了綜述。

1 NMD逃逸與機(jī)制

通常，當(dāng)PTC距離最后一個(gè)EEJ大于或等于50~55個(gè)核苷酸即可觸發(fā)NMD，稱為NMD途徑的50邊界規(guī)則[6]。然而，研究者發(fā)現(xiàn)某些PTC雖然符合這個(gè)規(guī)則，但是卻沒有發(fā)生NMD導(dǎo)致mRNA的降解，學(xué)者稱這種現(xiàn)象為NMD逃逸。通過分析功能基因組學(xué)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)有52.7%的人群常見的無義變異發(fā)生了NMD逃逸[7]。研究表明這些發(fā)生NMD逃逸的轉(zhuǎn)錄本，其PTC多位于距離翻譯起始位點(diǎn)較近的區(qū)域，比如一些位于人β球蛋白基因外顯子1的PTC并未觸發(fā)NMD而導(dǎo)致mRNA的降解，攜帶這類PTC的轉(zhuǎn)錄本與野生型β球蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平相當(dāng)[8]。這種現(xiàn)象也被稱為“AUG鄰近效應(yīng)”[9,10]：即在加帽介導(dǎo)的翻譯起始過程中，胞質(zhì)多聚腺苷酸結(jié)合蛋白1 (PABPC1)通過與真核起始因子eIF4G和eIF3之間的相互作用，靠近40S核糖體亞基，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)。PABPC1也因此鄰近AUG起始密碼子。隨著翻譯延伸的開始，這個(gè)閉合的環(huán)狀結(jié)構(gòu)使PABPC1與位于AUG附近PTC上的終止復(fù)合物近在咫尺。此時(shí)PABPC1競爭性的與終止復(fù)合物中的eRF3相互作用，從而削弱了eRF3與NMD關(guān)鍵因子UPF1間的作用，抑制NMD途徑。

雖然NMD逃逸的現(xiàn)象很早就有報(bào)道，但是近些年才開展系統(tǒng)性研究且確切機(jī)制尚不十分清楚，目前比較公認(rèn)的學(xué)說有兩個(gè)：PTC通讀和翻譯的重新啟動。蛋白質(zhì)的翻譯過程大體可以分為翻譯的起始、肽鏈的延伸、翻譯的終止以及翻譯終止后核糖體復(fù)合物的解體即核糖體的循環(huán)再利用四個(gè)階段。由于NMD與蛋白質(zhì)的翻譯偶聯(lián)，因此NMD逃逸也與蛋白質(zhì)的翻譯過程息息相關(guān)。

1.1 PTC通讀

PTC通讀是指在蛋白翻譯過程中，由于tRNA錯配或核糖體移碼或跳躍等原因?qū)е路g可以順利通過PTC，直至遇到正常的終止密碼子。就通讀效率而言，PTC的通讀效率約為正常終止密碼子的10倍，因而哺乳動物細(xì)胞中通讀更傾向于發(fā)生在PTC，而對于正常終止密碼子的通讀則極為罕見且低效[11]。

在生理情況下，真核生物中蛋白質(zhì)翻譯的起始需要核糖體大小亞基、起始tRNA (Met-tRNAMet)和包括起始因子(eIF1、eIF2和eIF3)在內(nèi)的幾十個(gè)蛋白因子的參與，在模板mRNA編碼區(qū)的5′端形成核糖體-mRNA-起始tRNA復(fù)合物，并將甲硫氨酸放入核糖體的P位。

蛋白翻譯起始后，隨著下一個(gè)氨基酸由氨酰- tRNA (AA-tRNA)運(yùn)送到核糖體的A位，在肽基轉(zhuǎn)移酶的催化下，與位于P位的上一個(gè)氨基酸生成肽鍵，肽鏈得以不斷延長。同時(shí)核糖體也向mRNA模板的3′端方向逐步移動一個(gè)密碼子，mRNA模板上的密碼子決定了何種AA-tRNA能被結(jié)合到A位上。當(dāng)終止密碼子(UAG、UGA或UAA)出現(xiàn)在核糖體的A位時(shí)，沒有相應(yīng)的AA-tRNA能與之結(jié)合，取而代之的是釋放因子。釋放因子能識別終止密碼子并與之結(jié)合，水解P位上多肽鏈與tRNA之間的二酯鍵。因其具有GTP酶活性，通過催化GTP水解，使肽鏈與核糖體解離。在真核細(xì)胞中，釋放因子eRF1識別終止密碼子，催化新合成的多肽鏈從P位點(diǎn)的tRNA中水解釋放出來；而具有GTP酶活性的釋放因子eRF3在多肽鏈釋放后刺激eRF1從核糖體A位解離，至此蛋白質(zhì)的合成結(jié)束。

因此，蛋白質(zhì)的翻譯是終止還是繼續(xù)取決于釋放因子和非同工tRNA之間相互競爭與核糖體A位點(diǎn)的結(jié)合[3]。當(dāng)釋放因子識別PTC并與核糖體大亞基的A位結(jié)合時(shí)，則翻譯終止，觸發(fā)NMD途徑，mRNA發(fā)生降解。雖然細(xì)胞內(nèi)存在多種校正機(jī)制以確保mRNA上的密碼子可以被正確識別，但是準(zhǔn)確率仍然達(dá)不到100%。當(dāng)攜帶某種氨基酸的非同工tRNA與核糖體A位偶然結(jié)合，使無義密碼子重新被解碼為有義密碼子，PTC被該氨基酸所取代，翻譯繼續(xù)進(jìn)行，即表現(xiàn)為由于tRNA錯配導(dǎo)致的PTC通讀(圖1A)。此外，通常情況下核糖體對mRNA密碼子的識別是由起始密碼子開始，沿5′至3′端方向，一個(gè)接一個(gè)直到終止密碼子，但也有一些例外，翻譯過程中某些反式作用因子決定核糖體在mRNA特定位點(diǎn)上的讀碼框可以發(fā)生程序性移動一個(gè)或者多個(gè)核苷酸后繼續(xù)翻譯，這一過程稱為程序性核糖體移碼或核糖體跳躍(ribosome frameshifting/jumping) (圖1B)[12]。當(dāng)核糖體恰巧跳過了PTC，則引發(fā)由于核糖體跳躍導(dǎo)致的PTC通讀，但是目前尚缺少相關(guān)報(bào)道。

綜上所述，因PTC通讀引發(fā)的NMD逃逸，具有以下兩個(gè)特點(diǎn)：首先，由于未觸發(fā)NMD途徑，因此攜帶PTC轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平與野生型相當(dāng)；其次，由于PTC被氨基酸取代，且翻譯終止于正常的終止密碼子，因而可產(chǎn)生全長的蛋白質(zhì)。雖然取代PTC的氨基酸可能與正常蛋白相應(yīng)位置的氨基酸不同，但是如果該位置不是蛋白的關(guān)鍵功能區(qū)域，那么新生成的蛋白可發(fā)揮正?；虿糠终９δ?。因此，這一機(jī)制也是目前主要用于抑制病理性NMD的有害作用、上調(diào)功能蛋白的表達(dá)從而靶向治療遺傳性疾病的分子基礎(chǔ)[13]，使用氨基糖甙類抗生素、非氨基糖甙類抗生素、小分子化合物(如PTC124)以及可與PTC結(jié)合的tRNA衍生物等均可誘導(dǎo)PTC的通讀[14]。

圖1 PTC通讀機(jī)制

A：tRNA錯配。由于tRNA錯配，使PTC被解碼為有義密碼子，生成氨基酸(紅色)，翻譯繼續(xù)向下進(jìn)行，發(fā)生PTC通讀。B:核糖體跳躍。核糖體在mRNA特定位點(diǎn)上的讀碼框發(fā)生程序性移動，即程序性核糖體移碼或核糖體跳躍，當(dāng)核糖體恰巧跳過了PTC，則引發(fā)由于核糖體跳躍導(dǎo)致的PTC通讀。PTC：提前終止密碼子；Stop：終止密碼子；eRF1：翻譯釋放因子1；eRF3：翻譯釋放因子3；藍(lán)色為野生型氨基酸序列；紅色為非野生型氨基酸序列。

Menkes綜合征是一種由基因突變導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運(yùn)障礙而引起的多系統(tǒng)受累的X連鎖隱性遺傳病，患者主要表現(xiàn)為神經(jīng)系統(tǒng)變性和結(jié)締組織異常。基因位于Xq13.3，包含23個(gè)外顯子，編碼1500個(gè)氨基酸的蛋白產(chǎn)物ATP7A。Kaler等[15]報(bào)道了1例Menkes綜合征患者攜帶有c.746C>T (p.Arg201Ter)無義變異，該變異在基因的第3外顯子產(chǎn)生一個(gè)PTC?；颊遚DNA的Sanger測序在相應(yīng)位置可見明顯C>T的堿基替換峰，提示攜帶PTC的mRNA轉(zhuǎn)錄本未發(fā)生顯著的降解；應(yīng)用Western blot和免疫組化分析患兒細(xì)胞，均可檢測到少量全長ATP7A蛋白。以上的檢測結(jié)果符合由于通讀機(jī)制導(dǎo)致的NMD逃逸特點(diǎn)。因此，作者推斷攜帶c.746C>T (p.Arg201Ter)無義變異的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了通讀導(dǎo)致的NMD逃逸，為了進(jìn)一步明確該通讀是否源于tRNA錯配，作者試圖檢測氨基酸序列，遺憾的是此例患者NMD抑制效率不是很高，未能足量分離和純化通讀產(chǎn)物。但是，酵母互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)揭示該突變體表達(dá)的蛋白仍保留有部分銅轉(zhuǎn)運(yùn)功能，提示PTC的通讀產(chǎn)物保留了部分功能。加之該患者在出生后不久即被診斷并進(jìn)行銅注射治療，因此治療效果顯著，無明顯的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀出現(xiàn)[15]。

1.2 翻譯的重新啟動

蛋白質(zhì)翻譯終止后，留下一個(gè)由mRNA、位于P位的去?；?tRNA和核糖體組成的翻譯終止后核糖體復(fù)合物。隨后，在ATP酶ABCE1、起始因子eIF3、eIF1、eIF1A以及eIF3j的協(xié)同作用下，翻譯終止后核糖體復(fù)合物解體為mRNA、去酰化-tRNA和核糖體單體或其亞基[3]。解體后的核糖體進(jìn)入新一輪的蛋白質(zhì)合成。

翻譯的重新啟動是指在PTC的下游存在著AUG，即潛在的翻譯起始點(diǎn)。由于Met的三聯(lián)密碼同為AUG與起始密碼子相同，因此可作為PTC下游翻譯重新啟動的潛在起始點(diǎn)。翻譯終止后，核糖體復(fù)合物并未完全解離進(jìn)入再循環(huán)，而是沿著mRNA繼續(xù)滑動，當(dāng)它遇到潛在的翻譯起始點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)的翻譯重新開始[16]。

已有報(bào)道鄰近翻譯起始密碼子的PTC，由于在其下游重新啟動了有效的翻譯導(dǎo)致攜帶該P(yáng)TC的mRNA轉(zhuǎn)錄本發(fā)生了NMD逃逸，包括神經(jīng)鞘瘤相關(guān)基因[17]、乳腺癌相關(guān)基因、基因[18]、α和β珠蛋白基因[10]等，提示有效的翻譯重新啟動可能存在著邊界效應(yīng)，位于邊界內(nèi)的PTC可通過翻譯重新啟動而逃離NMD，而邊界外的PTC則不能；此外，不同基因轉(zhuǎn)錄本的重新啟動，其邊界也有所不同，即便是密切相關(guān)的α和β珠蛋白基因也是如此。

Jagannathan等[7]利用生物信息學(xué)方法分析了人群中單核苷酸變異下游50個(gè)密碼子的序列，研究發(fā)現(xiàn)與同義變異相比，Met在無義變異下游的50個(gè)密碼子內(nèi)存在顯著的富集：57%的罕見和85%的常見無義變異在其下游50個(gè)密碼子內(nèi)存在Met，即潛在的翻譯起始點(diǎn)；而只有52%的同義變異存在該現(xiàn)象,且這一富集現(xiàn)象僅在編碼序列的前10%中成立。以上研究提示，有效的翻譯重新啟動與正常的起始密碼子、PTC和潛在起始密碼子3者之間的距離有關(guān)。首先，翻譯終止后的核糖體與正常的起始密碼子足夠接近，也就是PTC需要靠近正常的翻譯起始密碼子；其次PTC距離下游的潛在起始點(diǎn)也較近，使得核糖體可以相對較快的遇到起始位點(diǎn)重啟翻譯。

盡管翻譯的重新啟動一直被認(rèn)為是NMD逃逸的重要原因，但其發(fā)生的具體機(jī)制尚不十分清楚。具有短uORF轉(zhuǎn)錄本的翻譯后重新啟動是機(jī)體應(yīng)對環(huán)境變化調(diào)節(jié)基因表達(dá)的途徑之一。研究發(fā)現(xiàn)這類轉(zhuǎn)錄本在翻譯終止后，只有核糖體的大亞基和去酰化tRNA被循環(huán)再利用，小亞基仍保留在mRNA上，進(jìn)入下游從而發(fā)生翻譯的重新啟動。進(jìn)一步研究顯示真核生物起始因子eIF3，在翻譯的延伸和終止過程中可與核糖體發(fā)生短暫結(jié)合[19,20]，eIF3可特異性穩(wěn)定小亞基，使其不被循環(huán)，保留eIF3的核糖體能夠繼續(xù)向下游移動，識別PTC下游的潛在起始密碼子重新啟動翻譯(圖2)。綜上所述，因翻譯的重新啟動引發(fā)的NMD逃逸，同樣由于未觸發(fā)NMD途徑，攜帶PTC轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄水平也與野生型相當(dāng)；其次，翻譯重新啟動發(fā)生于PTC下游的潛在起始點(diǎn)，因而可產(chǎn)生N端截短蛋白。

圖2 翻譯的重新啟動機(jī)制

PTC：提前終止密碼子；Stop：終止密碼子；eRF1：翻譯釋放因子1；eRF3：翻譯釋放因子3；AUG：起始密碼子；eIF3：真核起始因子3。

基因與乳腺癌的發(fā)生高度相關(guān)，該基因發(fā)生突變使女性容易罹患乳腺癌和卵巢癌。該基因定位于17q21，含有23個(gè)外顯子，在DNA修復(fù)、細(xì)胞周期調(diào)控、蛋白質(zhì)泛素化和染色質(zhì)重塑中發(fā)揮重要作用[21]。Buisson等[22]研究發(fā)現(xiàn)基因的移碼變異185delAG (c.68_69delAG)和188del11 (c.71_81del)，分別在第36位(Ter36)和39(Ter39)位氨基酸位置產(chǎn)生PTC，且均位于第3外顯子理論上應(yīng)該觸發(fā)NMD，但是Northern blot檢測顯示攜帶突變的轉(zhuǎn)錄本與野生型表達(dá)量相當(dāng)；Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Ter36與Ter39突變質(zhì)粒可以產(chǎn)生N端截短蛋白。以上檢測結(jié)果符合由翻譯的重新啟動所致的NMD逃逸。進(jìn)一步分析基因序列顯示在PTC下游22(Met48)和262(Met128)核苷酸的位置分別存在有Met，即潛在的翻譯起始位點(diǎn)。為了明確翻譯重新啟動的具體位置，研究者利用定點(diǎn)誘變技術(shù)分別將Ter36與Ter39突變體的Met48和Met128突變?yōu)槔i氨酸轉(zhuǎn)染細(xì)胞，Western blot發(fā)現(xiàn)當(dāng)Met48突變?yōu)槔i氨酸時(shí)，Ter36+Met48Val與Ter39+Met48Val突變體產(chǎn)生的蛋白條帶與均與Met48突變之前一致；而當(dāng)Met128突變?yōu)槔i氨酸時(shí)，Ter36+Met128Val與Ter39+Met128Val突變體則不產(chǎn)生N端截短蛋白。由此推測185delAG(c.68_69delAG)和188del11 (c.71_81del)變異發(fā)生NMD逃逸是原于在PTC下游的Met128位置發(fā)生了翻譯的重新啟動。

1.3 其他影響NMD逃逸的因素

除PTC通讀和翻譯的重新啟動外，還存在其他一些因素可能導(dǎo)致PTC的NMD逃逸[23,24]，如mRNA的剪接。當(dāng)mRNA的選擇性剪接將包含PTC的外顯子從轉(zhuǎn)錄本中去除，則不再發(fā)生NMD。同樣，如果PTC下游的某個(gè)單一內(nèi)含子拼接效率低下，PTC下游沒有EJC來發(fā)出NMD信號，從而無法觸發(fā)NMD。其他影響NMD效率的因素還有3′非翻譯區(qū)(UTR)的序列和結(jié)構(gòu)。一些含有長3′ UTR的mRNA中存在著抑制NMD的順式作用元件。研究發(fā)現(xiàn)位于基因mRNA的3′UTR前200個(gè)核苷酸的位置存在一個(gè)順式作用元件，當(dāng)其位于終止密碼子下游附近時(shí)可以抑制NMD的發(fā)生[25]。此外，由于NMD是一個(gè)翻譯依賴的過程，影響翻譯的順式作用元件和反式作用因子均可以影響NMD的結(jié)局。

2 NMD逃逸在疾病治療方面的進(jìn)展

隨著對NMD及其逃逸的研究深入，近幾年提出來許多針對PTC相關(guān)疾病的治療策略，研究主要集中在對PTC通讀機(jī)制的應(yīng)用，即通過使用藥物使致病的PTC發(fā)生通讀，上調(diào)有功能的蛋白表達(dá)，從而抑制病理性NMD的有害作用。通讀治療已經(jīng)被證明是治療無義變異相關(guān)疾病的較成功方案，已在囊性纖維化、杜氏肌營養(yǎng)不良(Duchenne muscular dystrophy, DMD)、血友病、代謝紊亂、眼遺傳性疾病和癌癥等疾病中取得良好的療效。

PTC通讀的治療首個(gè)突破發(fā)生在20世紀(jì)晚期，研究者發(fā)現(xiàn)一些化合物能夠在序列中引入一種天然氨基酸取代PTC，從而發(fā)生通讀產(chǎn)生完整的多肽鏈，避免因觸發(fā)NMD導(dǎo)致的mRNA降解[26]。隨著研究的深入，越來越多的藥物被確定使用(表1)。目前比較成功的治療方法主要有兩類，即藥物和分子生物學(xué)干預(yù)，用于治療PTC引起的疾病。

2.1 氨基糖苷類

氨基糖苷類是應(yīng)用較廣的一類抗生素，可通過干擾核糖體校正作用減少核糖體翻譯過程的提前終止。氨基糖苷類藥物選擇性地與核糖體的解碼中心結(jié)合，導(dǎo)致氨基酸的隨機(jī)引入，從而克服肽鏈中的PTC，發(fā)生通讀[33]。例如，慶大霉素是一種常見的氨基糖苷類抗生素，通過與真核核糖體結(jié)合發(fā)揮無義抑制活性[34]，選擇性地在PTC中引入氨基酸，但不影響正常終止密碼子。在作用過程中，慶大霉素通過促進(jìn)近同工tRNA與核糖體A位點(diǎn)的結(jié)合而抑制校對過程，使翻譯的保真度降低，從而導(dǎo)致誤讀和/或PTC抑制[35]。

表1 基于促通讀機(jī)制的藥物研究應(yīng)用現(xiàn)況

Hurler綜合征被認(rèn)為是最嚴(yán)重的遺傳性溶酶體貯積病，為常染色體隱性遺傳病。由于基因變異導(dǎo)致所編碼的α-L-艾杜糖醛酸苷酶缺乏，溶酶體內(nèi)的粘多糖(GAG)不能正常降解，引發(fā)粘多糖貯積病。基因位于1號染色體，p.Gln70Ter和p.Trp402Ter是歐洲裔Hurler綜合征患者中較常見的兩種無義變異[36]。2001年，Keeling等[37]使用Hurler綜合征成纖維細(xì)胞系研究了慶大霉素對基因p.Gln70Ter和p.Trp402Ter變異的抑制活性，發(fā)現(xiàn)經(jīng)慶大霉素處理后可以顯著提升α-L-艾杜糖醛酸苷酶的活性。但是由于長期應(yīng)用慶大霉素產(chǎn)生副作用，研究者也嘗試設(shè)計(jì)更為有效且毒性更小的氨基糖苷類藥物，其中一種氨基糖苷類衍生物-NB84，在療效上可恢復(fù)α-L-艾杜糖醛酸苷酶活性，且?guī)缀鯖]有毒性[31]。

2.2 Ataluren

Ataluren (原稱PTC124)是一種非氨基糖苷類的小分子化合物，能夠在mRNA轉(zhuǎn)錄本的PTC位置隨機(jī)插入氨基酸，誘導(dǎo)PTC通讀，而不影響正常的終止密碼子[38]。DMD由編碼抗肌萎縮蛋白的基因突變引起，患者主要表現(xiàn)為進(jìn)行性近端肌肉無力，導(dǎo)致行走困難、依賴輪椅以及最終的呼吸和心臟衰竭惡化。由無義變異產(chǎn)生PTC導(dǎo)致截短蛋白或蛋白質(zhì)功能喪失約占DMD病例的13%。Ataluren是通過藥物的高通量篩選和化學(xué)優(yōu)化而被發(fā)現(xiàn)的，它可以誘導(dǎo)核糖體讀取PTC，而不是正常的終止密碼子。當(dāng)在無義突變的DMD小鼠模型中測試時(shí)，Ataluren可產(chǎn)生全長的功能性抗肌萎縮蛋白。在隨后的人DMD實(shí)驗(yàn)也成功誘導(dǎo)出了全長功能性抗肌萎縮蛋白[39]?；赑TC124藥物的有效性，2017年P(guān)TC124通過了歐盟的年度審核。目前，PTC公司正在進(jìn)行一個(gè)隨機(jī)雙盲、安慰劑對照、國際多中心的III期臨床試驗(yàn)，以進(jìn)一步證實(shí)PTC124長期治療無義變異的DMD患者的效果和安全性。該臨床試驗(yàn)總目標(biāo)入組人數(shù)250人，中國入組人數(shù)50人，預(yù)期2021年將公布結(jié)果(https://clinicaltrials.gov; http://www.china-drugtrials.org.cn)。

2.3 抑制子tRNA

無義抑制子是一種tRNA的衍生物，其反密碼子能夠識別PTC，繼而在PTC處摻入氨基酸，產(chǎn)生全長功能蛋白，防止翻譯發(fā)生終止。抑制子介導(dǎo)的密碼子–反密碼子的相互作用，可以避免由于核糖體校正而發(fā)生的氨酰-tRNA排斥，因此可以有效抑制PTC。研究表明，抑制子tRNA可用于人體由無義變異引起的疾病的體細(xì)胞基因治療。遺傳性彌漫性胃癌(HDGC)是一種侵襲性、無法治愈的胃癌，主要由基因的無義變異引起，導(dǎo)致截短的E-鈣粘蛋白產(chǎn)生[40]。最近一項(xiàng)關(guān)于HDGC的研究顯示，在給予抑制子tRNA誘導(dǎo)后，108個(gè)具有HDGC家族史的家庭中，有23個(gè)家庭(21.3%)的癌癥的發(fā)病顯著延遲，并使由攜帶PTC的基因可以編碼產(chǎn)生大約30%功能性E-鈣粘蛋白[41]。

3 結(jié)語與展望

近年來，關(guān)于NMD逃逸的研究成果很多，但機(jī)制仍未得到完全闡明。隨著研究的深入，PTC相關(guān)疾病的致病機(jī)制和藥物治療越來越成為研究的熱點(diǎn)，目前研究成果主要集中在促通讀藥物的研發(fā)，這些藥物為遺傳病的治療帶來了新希望。然而，促通讀藥物的臨床應(yīng)用仍存在很多亟待解決的問題，如慶大霉素等氨基糖苷類藥物的長期應(yīng)用有耳毒性、腎毒性等副作用，靜脈注射仍是許多氨基糖苷類藥物的用藥途徑，不適于患者長期應(yīng)用。此外，由于NMD逃逸和新型藥物的作用機(jī)制尚未完全闡明，使得藥物在臨床試驗(yàn)中療效不穩(wěn)定。針對這些問題，尚需開展更多NMD逃逸機(jī)制以及藥物作用機(jī)制的研究，以提高藥物療效的特異性。

綜上所述，NMD逃逸使得攜帶PTC的轉(zhuǎn)錄本仍可編碼具有部分功能的蛋白質(zhì)，緩解患者表型。最近，馬志鵬等[42]通過引入PTC利用NMD途徑構(gòu)建敲除基因的斑馬魚突變體，但是卻發(fā)現(xiàn)該突變體發(fā)育正常并未出現(xiàn)預(yù)期的異常表型；同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)該突變體中多個(gè)capn家族基因上調(diào)彌補(bǔ)基因的功能，推測發(fā)生這種現(xiàn)象是由于遺傳補(bǔ)償效應(yīng)，并提出假設(shè)：無義突變mRNA通過提高同源基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)補(bǔ)償效應(yīng)。經(jīng)實(shí)驗(yàn)證實(shí)無義突變與核酸序列同源性是激活遺傳補(bǔ)償效應(yīng)的兩個(gè)必要條件。該研究闡釋了PTC不導(dǎo)致表型的另一重要機(jī)制，也為PTC相關(guān)疾病的致病機(jī)制和藥物治療研究提供了新方向。

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The NMD escape mechanism and its application in disease therapy

Miaomiao Cheng, Yanyan Cao

Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) refers to the degradation of mRNA due to the presence of premature stop codon (PTC) on mRNA under pathological or physiological conditions. NMD is widely considered an mRNA-specific quality control process. Recently it was discovered that some PTCs do not trigger NMD in a variety of diseases – a process known as NMD escape; however, its exact mechanism remains unclear. At present, there are two widely accepted mechanistic hypotheses during NMD escape. The first is PTC read-through, in which protein translation undergoes PTC until the normal stop codon is encountered, producing a full-length protein. The second is translation reinitiation, in which protein translation recommences at the potential start codon downstream of PTC and terminates at the stop codon, producing an N-terminal truncated protein. Currently, an increasing number of drugs or small molecules that use PTC read-through have been successfully applied to treat nonsense variation-associated diseases. In this review, we summarize the NMD mechanism and discuss the application and progress in our understanding of NMD escape in disease therapy. This review should provide a useful framework to advance current understanding of the research and application of NMD escape.

NMD escape; nonsense mutation; premature stop codon (PTC); PTC read-through

2019-12-20;

2020-02-25

北京市自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：5163028)，國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號：81500979)，國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(編號：2016YFC0901505)和中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(編號：2016-I2M-1-008)資助[Supported by Beijing Natural Science Foundation (No.5163028)，the National Natural Science Foundation of China (No.81500979), the National Key Research and Development Program of China (No.2016YFC0901505), and CAMS Initiative for Innovative Medicine(No.2016-I2M-1-008)]

程苗苗，碩士研究生，專業(yè)方向：兒科學(xué)。E-mail: 1245156226@qq.com

曹延延，博士，副研究員，研究方向：脊髓性肌萎縮癥的分子機(jī)制。E-mail: caoyanyan@bjmu.deu.cn

10.16288/j.yczz.19-335

2020/2/28 8:29:33

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200226.1720.001.html

(責(zé)任編委: 盧大儒)