乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中l(wèi)incRNAs表達(dá)譜比較分析

任巧玲，張家慶，陸東鋒，王璟，陳俊峰，馬強(qiáng)，白獻(xiàn)曉，郭紅霞，高彬文，邢寶松

研究報(bào)告

乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中l(wèi)incRNAs表達(dá)譜比較分析

任巧玲1，張家慶1，陸東鋒2，王璟1，陳俊峰1，馬強(qiáng)1，白獻(xiàn)曉1，郭紅霞1，高彬文1，邢寶松1

1. 河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002 2. 河南花花牛實(shí)業(yè)總公司，鄭州 450000

初產(chǎn)母豬斷奶后能否正常發(fā)情對(duì)養(yǎng)豬生產(chǎn)影響重大，也是初產(chǎn)母豬被淘汰的主要原因。本研究以乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬為研究對(duì)象，首次利用RNA-seq技術(shù)對(duì)其下丘腦-垂體-卵巢軸中的基因間長(zhǎng)鏈非編碼RNAs(long intergenic noncoding RNAs, lincRNAs)進(jìn)行篩選比較，得到lincRNAs的表達(dá)圖譜，并對(duì)其特征和功能進(jìn)行了初步分析。結(jié)果顯示，在乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中鑒定得到3519個(gè)lincRNAs，以發(fā)情組為對(duì)照共有17個(gè)lincRNAs存在差異表達(dá)，其中12個(gè)表達(dá)上調(diào)，5個(gè)表達(dá)下調(diào)(FC≥2,<0.05)。選擇4個(gè)差異表達(dá)的lincRNAs經(jīng)qRT-PCR驗(yàn)證，其表達(dá)水平與測(cè)序結(jié)果基本一致。對(duì)這17個(gè)差異表達(dá)的lincRNAs進(jìn)行GO分析、KEGG通路分析及l(fā)incRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)這些lincRNAs主要與豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟、卵巢細(xì)胞分化及顆粒細(xì)胞凋亡等生殖活動(dòng)相關(guān)。本研究結(jié)果豐富了豬lincRNAs數(shù)據(jù)資源，為進(jìn)一步深入研究初產(chǎn)母豬的生殖機(jī)能提供了理論依據(jù)。

lincRNAs；乏情；發(fā)情；初產(chǎn)母豬；下丘腦–垂體–卵巢軸

初產(chǎn)母豬乏情或發(fā)情延遲已成為養(yǎng)豬生產(chǎn)中的一個(gè)常見(jiàn)難題。大長(zhǎng)二元母豬作為當(dāng)今瘦肉型商品豬生產(chǎn)的主要母本，其乏情問(wèn)題對(duì)生產(chǎn)的影響重大。造成初產(chǎn)母豬乏情的主要原因有遺傳、環(huán)境、營(yíng)養(yǎng)和管理水平等因素，隨著規(guī)?；i場(chǎng)管理水平的提高及動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的深入，非遺傳因素已得到了很好的改善。近年來(lái)，一些學(xué)者從基因遺傳方面對(duì)母豬情期控制進(jìn)行了一些有意義的探索。研究發(fā)現(xiàn)在發(fā)情和乏情母豬的下丘腦–垂體–卵巢軸中許多生殖激素基因的表達(dá)發(fā)生了明顯的改變，如、、、、和等在乏情母豬體內(nèi)顯著下調(diào)，這些基因均與母豬的發(fā)情等生殖活動(dòng)密切相關(guān)[1,2]。Kong等[2]報(bào)導(dǎo)在發(fā)情和乏情全同胞初產(chǎn)母豬的垂體和卵巢中均檢測(cè)到的表達(dá)量較高，且存在顯著差異(<0.01)，并證實(shí)了該基因通過(guò)調(diào)控卵泡細(xì)胞的發(fā)育平衡來(lái)最終調(diào)控?cái)嗄毯蟪醍a(chǎn)母的發(fā)情行為。另外，研究表明由編碼的NKB與其受體NK3R結(jié)合能夠促進(jìn)GnRH的釋放進(jìn)而誘導(dǎo)動(dòng)物初情期的啟動(dòng),當(dāng)發(fā)生突變時(shí)，導(dǎo)致低促性腺激素綜合癥的發(fā)生，動(dòng)物初情期啟動(dòng)失敗[3~5]。下丘腦–垂體–卵巢軸(hypothalamic- pituitary-ovarian axis, HPOA)是一個(gè)完整而協(xié)調(diào)的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，它的每個(gè)環(huán)節(jié)均有其獨(dú)特的神經(jīng)內(nèi)分泌功能，并且互相調(diào)節(jié)、互相影響，在哺乳動(dòng)物的生殖活動(dòng)中起著主要的調(diào)節(jié)作用，也是研究動(dòng)物生殖問(wèn)題的關(guān)鍵切入點(diǎn)。

lincRNA (long intergenic noncodingRNA, lincRNA)是一類由蛋白編碼基因間的非編碼序列轉(zhuǎn)錄且轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的功能性RNA分子[6]。隨著高通量RNA-seq技術(shù)的發(fā)展，不同物種中越來(lái)越多的lincRNAs被鑒定，至今在哺乳動(dòng)物基因組中已發(fā)現(xiàn)3500多種lincRNAs，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)一些lincRNAs在不同的生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，如表觀遺傳調(diào)控[7]、多能性維持和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控[8]、X染色體失活[9]及生殖調(diào)控[10,11]等。與mRNA相比，lincRNA的表達(dá)水平在組織間變化更大，許多l(xiāng)incRNAs優(yōu)先在大腦和睪丸組織中表達(dá)[6]。lincRNAs的組織特異性表達(dá)表明其具有發(fā)育和細(xì)胞類型特異性功能[12]。目前l(fā)incRNAs在初產(chǎn)母豬乏情和發(fā)情狀態(tài)下丘腦–垂體–卵巢軸中的表達(dá)及功能還鮮有報(bào)導(dǎo)。為了探索lincRNAs在初產(chǎn)母豬下丘腦-垂體-卵巢中的表達(dá)情況及對(duì)生殖活動(dòng)的影響，本研究對(duì)乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中的lincRNAs進(jìn)行全基因組篩選比較，并對(duì)其特征和功能進(jìn)行了初步分析，為進(jìn)一步深入研究初產(chǎn)母豬的生殖機(jī)能提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和樣品制備

試驗(yàn)豬為體況和年齡基本一致的半同胞初產(chǎn)大長(zhǎng)二元母豬，由河南鄢陵天鵬牧業(yè)有限公司提供。在同等條件下飼養(yǎng)在同一圈舍內(nèi)，每天用同一頭公豬試情1~2次，選取斷奶后7 d有明顯發(fā)情反應(yīng)的3頭視為正常發(fā)情母豬(發(fā)情組)，屠宰后分別取下丘腦、垂體和卵巢，用生理鹽水沖洗后，立即放入液氮中保存。選取公豬試情到21 d仍無(wú)任何發(fā)情反應(yīng)的3頭視為乏情母豬(乏情組)，屠宰后分別取下丘腦、垂體和卵巢，處理方法同發(fā)情母豬。

1.2 樣品總RNA提取

采用RNAiso Plus (日本TaKaRa公司)試劑盒分別提取乏情組3頭母豬和發(fā)情組3頭母豬的下丘腦、垂體和卵巢組織總RNA，用Nano-Drop ND-2000紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Scientific公司)分析濃度，用Agilent BioAnalyzer 2100 (加拿大Agilent Tech-nologies公司)進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)，所有樣品要求：260 nm/280 nm>2.1，RIN>8.0。分別取等量乏情和發(fā)情母豬的下丘腦、垂體、卵巢質(zhì)檢合格的RNA混合成6個(gè)樣品池。

1.3 cDNA文庫(kù)構(gòu)建和RNA-seq

分別從6個(gè)混池中取大約20 μg RNA，用帶有Oligo(dT)的磁珠(無(wú)錫百邁格生物科技有限公司)富集PolyA+RNA，并加入RNA斷裂試劑(美國(guó)Ambion公司)使之片段化。用六堿基隨機(jī)引物和M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶(上海生工生物工程股份有限公司)合成第一鏈cDNA，用DNA聚合酶Ⅰ、RNase H和dNTPs (上海生工生物工程股份有限公司)合成第二鏈cDNA。依照Illumina Hiseq2500測(cè)序平臺(tái)的要求，對(duì)構(gòu)建的6個(gè)cDNA文庫(kù)依次進(jìn)行末端修復(fù)、3′末端加A、連接接頭后純化、PCR擴(kuò)增富集、定量，質(zhì)檢符合要求后上機(jī)測(cè)序。測(cè)序工作由上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司完成。

1.4 序列比對(duì)和轉(zhuǎn)錄本構(gòu)建

6個(gè)文庫(kù)測(cè)序獲得的Raw reads進(jìn)行質(zhì)控處理獲得Clean reads，用Tophat (v2.0.14)軟件把每個(gè)樣本的Clean reads比對(duì)到豬參考基因組(11.1) (表1)。用Cufflinks (v2.2.1)把比對(duì)上的片段拼接成轉(zhuǎn)錄本(GTF格式)，把來(lái)自乏情組和發(fā)情組的6個(gè)Cufflinks拼接轉(zhuǎn)錄本用Cufflinks軟件包中的Cuffmerge融合成1個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄組，后續(xù)用這個(gè)非冗余轉(zhuǎn)錄組來(lái)鑒定novel lincRNAs。

表1 6個(gè)cDNA文庫(kù)測(cè)序質(zhì)量和比對(duì)信息統(tǒng)計(jì)分析

1.5 lincRNAs鑒定

乏情和發(fā)情母豬下丘腦、垂體、卵巢融合非冗余轉(zhuǎn)錄組中的lincRNAs通過(guò)以下步驟鑒定[13,14]： (1)用Cuffcompare把融合轉(zhuǎn)錄本與Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知注釋比對(duì)，去除可能的已知轉(zhuǎn)錄本；(2)過(guò)濾掉單外顯子和長(zhǎng)度小于200 bp的轉(zhuǎn)錄本；(3)只挑選離Ensembl中注釋的豬的任何編碼基因或持家的非編基因至少500 bp遠(yuǎn)的轉(zhuǎn)錄本；(4)分別用蛋白編碼潛力計(jì)算軟件CNCI和CPAT預(yù)測(cè)所篩選轉(zhuǎn)錄本的編碼潛力，二者取交集即為lincRNAs (圖1)。

1.6 差異表達(dá)的lincRNAs和差異表達(dá)的mRNAs篩選

利用DESeq軟件(http://bioconductor.org/packages/ release/bioc/html/DESeq.html)對(duì)各樣本的counts數(shù)目進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理(采用baseMean值來(lái)估算表達(dá)量)，計(jì)算差異倍數(shù)，并采用NB (負(fù)二項(xiàng)分布檢驗(yàn)的方式)對(duì)reads數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，篩選<0.05且Fold Change>2的為差異表達(dá)的lincRNAs和mRNAs。lincRNAs和mRNAs表達(dá)量計(jì)算用FPKM法，即每百萬(wàn)片段中來(lái)自某一基因每千堿基長(zhǎng)度的片段數(shù)目。

1.7 lincRNAs功能預(yù)測(cè)

對(duì)于差異表達(dá)的17個(gè)lincRNAs，計(jì)算每個(gè)lincRNA與蛋白編碼基因之間的Pearson相關(guān)系數(shù)，選取<0.05，||>0.8的基因，即為與之共表達(dá)的編碼基因。使用 DAVID軟件在線對(duì)共表達(dá)蛋白編碼基因進(jìn)行功能富集和通路分析，用超幾何檢驗(yàn)，找出與整個(gè)基因組背景相比，共表達(dá)基因顯著富集的GO條目和KEGG通路。

1.8 lincRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

為了鑒定差異表達(dá)的lincRNAs和差異表達(dá)的mRNAs之間的相互作用，在lincRNAs和mRNAs進(jìn)行Pearson相關(guān)性分析的基礎(chǔ)上構(gòu)建了lincRNA- mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。即先選取<0.05，||>0.8關(guān)系對(duì)，然后用Cytoscape軟件來(lái)構(gòu)建lincRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。

圖1 豬lincRNAs鑒定流程

1.9 差異表達(dá)lincRNAs qRT-PCR驗(yàn)證

分別選取2個(gè)表達(dá)上調(diào)和2個(gè)表達(dá)下調(diào)的lincRNAs進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證(每個(gè)組織重復(fù)3次)。RNA為實(shí)驗(yàn)室測(cè)序時(shí)提取凍存的RNA，即乏情母豬(3個(gè)下丘腦樣品、3個(gè)垂體樣品、3個(gè)卵巢樣品)和發(fā)情母豬(3個(gè)下丘腦樣品、3個(gè)垂體樣品、3個(gè)卵巢樣品)的總RNA。用RevertAid Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Thermo Scientific公司)合成cDNA，根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTM(日本TaKaRa公司)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。以為內(nèi)參基因，引物由武漢賽維爾生物科技有限公司設(shè)計(jì)、合成，引物序列見(jiàn)表2。用2–ΔΔCt法計(jì)算lincRNAs的相對(duì)表達(dá)量。檢驗(yàn)對(duì)相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)表示為“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean± SD)，<0.05表示差異顯著，<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄本組裝及l(fā)incRNAs鑒定

為了鑒定乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中的lincRNAs，首先用Illumina Hiseq2500對(duì)乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬的下丘腦、垂體和卵巢組織進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，去除接頭及低質(zhì)量序列后，平均每個(gè)樣本得到52,400,881條clean reads，平均有42,364,859條比對(duì)到了豬的參考基因組(11.1)，平均比對(duì)率為80.85% (表1)。利用Cufflinks重建了每個(gè)樣本的轉(zhuǎn)錄組，并用Cuffmerge軟件將乏情和發(fā)情母豬的下丘腦、垂體、卵巢的重建轉(zhuǎn)錄組融合成1套無(wú)冗余的轉(zhuǎn)錄組，共有55,734條轉(zhuǎn)錄本，利用CNCI軟件預(yù)測(cè)得到3754條lincRNAs，利用CPAT軟件預(yù)測(cè)得到4220條lincRNAs，二者的交集為3519條lincRNAs (圖1)。這些lincRNAs分布在除Y染色體以外的所有染色體上(圖2)。

2.2 lincRNAs結(jié)構(gòu)特征分析

以前的研究已經(jīng)表明人和小鼠的lincRNAs與其蛋白編碼基因在結(jié)構(gòu)上有很大的差異，如轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度、外顯子長(zhǎng)度和外顯子數(shù)量等。為了鑒定本研究分析的3519個(gè)lincRNAs是否也具有這些特征，將這些lincRNAs與Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中所注釋的豬mRNAs (更新于2019年6月，共有48,413個(gè)mRNAs)進(jìn)行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)lincRNAs的這些特征與以往的研究十分類似[15,16]：轉(zhuǎn)錄本平均長(zhǎng)度(1797 bp)明顯小于mRNA (3551 bp) (圖3A)，外顯子平均長(zhǎng)度(571 bp)大于mRNA (285 bp) (圖3B)，外顯子平均個(gè)數(shù)(3.1個(gè))小于mRNA (12個(gè)) (圖3C)。

表2 引物序列信息

圖2 lincRNAs在染色體上的分布

圖3 lincRNAs和mRNAs轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度、外顯子長(zhǎng)度和外顯子個(gè)數(shù)比較

A：轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度比較；B：外顯子長(zhǎng)度比較；C：外顯子個(gè)數(shù)比較。

2.3 差異表達(dá)lincRNAs和差異表達(dá)mRNAs的表達(dá)譜

為探討lincRNAs的功能，利用DEseq軟件對(duì)乏情組和發(fā)情組下丘腦–垂體–卵巢軸中的lincRNAs進(jìn)行差異表達(dá)分析。共有17個(gè)lincRNAs存在差異表達(dá)，以發(fā)情組為對(duì)照組，其中12個(gè)上調(diào)表達(dá)，5個(gè)下調(diào)表達(dá)(FC≥2，<0.05) (表3)。這17個(gè)lincRNAs中，TCONS_00035245上調(diào)倍數(shù)最高(log2FC值為15.665)，TCONS_00032971下調(diào)倍數(shù)最高(log2FC值為16.210)。散點(diǎn)圖(圖4A)揭示了這17個(gè)lincRNAs在兩組間的變化情況，聚類分析熱圖(圖5A)揭示了這17個(gè)lincRNAs在不同樣本間表達(dá)模式的關(guān)系，即乏情組的3種組織聚為一類，發(fā)情組的3種組織聚為一類，在兩組間都是垂體和卵巢的表達(dá)模式更為相似，聚為一小類。

同時(shí)，對(duì)mRNAs差異表達(dá)分析顯示，共有72 mRNAs存在差異表達(dá)，以發(fā)情組為對(duì)照，其中的35個(gè)上調(diào)，37 個(gè)下調(diào)(FC≥2，<0.05)。在一個(gè)組(乏情組或發(fā)情組)平均表達(dá)量較高，且在另一組表達(dá)量大于1 (乏情組或發(fā)情組)的17個(gè)mRNAs具體情況如表4所示。同樣，散點(diǎn)圖(圖4B)揭示了這72個(gè)mRNAs在兩組間的變化情況，聚類分析熱圖(圖5B)揭示了這72個(gè)mRNAs在不同樣本間表達(dá)模式的關(guān)系，該模式關(guān)系與上述的17個(gè)lincRNAs相似。

2.4 差異表達(dá)lincRNAs驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-seq結(jié)果的可靠性，選取4個(gè)差異表達(dá)的lincRNAs進(jìn)行驗(yàn)證(圖6)。RNA-seq生物信息學(xué)分析篩選的17個(gè)差異表達(dá)lincRNAs均為與對(duì)照組相比在下丘腦、垂體、卵巢3種組織中表達(dá)趨勢(shì)一致的lincRNAs。qRT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示，TCONS_00012288在下丘腦(圖6A)有上調(diào)趨勢(shì)(>0.05)，TCONS_00001098在卵巢(圖6C)有下調(diào)趨勢(shì)(>0.05)，但RNA-seq結(jié)果為T(mén)CONS_00012288表達(dá)下調(diào)，TCONS_00001098表達(dá)上調(diào)。除上述兩種情況外，其他所有l(wèi)incRNAs在下丘腦、垂體和卵巢中的結(jié)果均與RNA-seq相同，即上調(diào)的lincRNAs與對(duì)照組相比，在下丘腦、垂體和卵巢中均為上調(diào)的趨勢(shì)，下調(diào)的lincRNAs與對(duì)照組相比，在下丘腦、垂體、卵巢中均為下調(diào)的趨勢(shì)。

表3 17個(gè)差異表達(dá)lincRNAs相關(guān)信息

圖4 差異表達(dá)lincRNAs和mRNAs散點(diǎn)圖

A：差異表達(dá)lincRNAs散點(diǎn)圖；B：差異表達(dá)mRNAs散點(diǎn)圖。

圖5 差異表達(dá)lincRNAs和mRNAs聚類分析熱圖

A：差異表達(dá)lincRNAs聚類分析熱圖；B：差異表達(dá) mRNAs聚類分析熱圖。

表4 17個(gè)差異表達(dá)的mRNAs相關(guān)信息

圖6 差異表達(dá)lincRNAs的qRT-PCR驗(yàn)證

A：差異表達(dá)lincRNAs在下丘腦中的相對(duì)表達(dá)量；B：差異表達(dá)lincRNAs在垂體中的相對(duì)表達(dá)量；C：差異表達(dá)lincRNAs在卵巢中的相對(duì)表達(dá)量。*表示<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；**表示<0.01，差異顯著。

2.5 GO富集和KEGG通路分析

為了預(yù)測(cè)差異表達(dá)lincRNAs的功能，對(duì)17個(gè)差異表達(dá)的lincRNAs經(jīng)Pearson相關(guān)分析共得到256個(gè)共表達(dá)基因。這些基因前30富集的GO條目如圖7所示。GO分析表明與lincRNAs共表達(dá)基因最富集條目為正調(diào)控NF-kappa轉(zhuǎn)錄因子的活動(dòng)(生物學(xué)過(guò)程，GO:0051092)、蛋白磷酸酶1(細(xì)胞組分，GO:00164)和細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(分子功能，GO:000469)。此外，KEGG通路分析表明，與lincRNAs共表達(dá)基因主要與疾病的發(fā)生發(fā)展、抗原加工遞呈、T細(xì)胞受體信號(hào)通路和細(xì)胞粘附分子等通路相關(guān)(圖8)。

2.6 lincRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析

17個(gè)差異表達(dá)的lincRNAs和72個(gè)差異表達(dá)的mRNAs，在分析其存在共表達(dá)關(guān)系的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了lincRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(圖9)。在這個(gè)網(wǎng)絡(luò)中共包括89個(gè)節(jié)點(diǎn)和274個(gè)關(guān)系對(duì)，其中有174個(gè)正調(diào)控關(guān)系對(duì)，100個(gè)負(fù)調(diào)控關(guān)系對(duì)。此外，分析還顯示，1個(gè)mRNA可能與1~11個(gè)lincRNAs相關(guān)，而1個(gè)lincRNA則與3~33個(gè)mRNAs相關(guān)。

3 討論

近年來(lái)研究表明，越來(lái)越多的lincRNAs參與哺乳動(dòng)物的生殖調(diào)控，如lincRNA-介導(dǎo)哺乳動(dòng)物X染色體失活[9]，lincRNA-在黃體形成和妊娠維持中起重要作用[17]，lincRNA-和與人類的胎盤(pán)和胎兒發(fā)育密切相關(guān)[18]。與人類和其他哺乳動(dòng)物相比，lincRNAs是如何調(diào)控母豬生殖活動(dòng)的還未見(jiàn)報(bào)道[19,20]。本研究首次對(duì)乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中的lincRNAs進(jìn)行了鑒定和分析，系統(tǒng)研究了乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中差異表達(dá)lincRNAs和mRNAs的比較圖譜，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了初步的探索，為深入研究lincRNAs在初產(chǎn)母豬情期啟動(dòng)中的作用提供分子生物學(xué)參考，也為深入闡明初產(chǎn)母豬復(fù)雜的生殖機(jī)制提供了新的分子標(biāo)記方向。

本研究共鑒定出3519條lincRNAs，這些lincRNAs的轉(zhuǎn)錄本平均長(zhǎng)度為1797 bp，外顯子平均長(zhǎng)度為571 bp，外顯子平均個(gè)數(shù)為3.1，分布在除Y染色體以外的所有染色體上。與蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本相比較，這些lincRNAs具有較短的轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度、較少的外顯子個(gè)數(shù)和較長(zhǎng)的外顯子長(zhǎng)度，這些特征與以往的研究報(bào)導(dǎo)一致[15,16]。在這些lincRNAs中共有17個(gè)存在差異表達(dá)，以發(fā)情組為對(duì)照其中12個(gè)上調(diào)，5個(gè)下調(diào)。同時(shí)也對(duì)mRNAs的表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)共有72個(gè)mRNAs存在差異表達(dá)，以發(fā)情組為對(duì)照其中35個(gè)上調(diào)表達(dá)，37個(gè)下調(diào)表達(dá)。

圖7 共表達(dá)基因最富集的前30個(gè)GO條目

GO：ID代表該功能在GO數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)。

lincRNAs通常不編碼蛋白質(zhì)，而是通過(guò)與染色體或蛋白質(zhì)結(jié)合來(lái)實(shí)現(xiàn)自身的功能，特別是與某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。最近的研究已經(jīng)表明lincRNAs的生物學(xué)功能可以通過(guò)與之共表達(dá)的基因來(lái)預(yù)測(cè)。為了進(jìn)一步探討差異表達(dá)lincRNAs對(duì)初產(chǎn)母豬情期啟動(dòng)等生殖活動(dòng)的影響，對(duì)與之共表達(dá)的256個(gè)基因進(jìn)行了GO富集和KEGG通路分析。對(duì)發(fā)情母豬而言，共表達(dá)基因富集到的MAP激酶活性(GO：0004709)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(GO：0004693)、細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白激酶復(fù)合物(GO：0000307)和膠原分解過(guò)程(GO：0030574)等GO條目都直接或間接與母豬發(fā)情生物學(xué)機(jī)制相關(guān)。動(dòng)物發(fā)情最顯著的生理特征是卵巢上的卵泡發(fā)育成熟并排卵，在發(fā)情期卵母細(xì)胞受到促性腺激素的刺激后恢復(fù)第一次減數(shù)分裂，在這一過(guò)程中卵母細(xì)胞發(fā)生了一系列的變化，如染色體聚集、核仁解體、生發(fā)泡破裂(GVBD)、紡錘體組裝和排出第一極體(PB1)[21~24]。成熟促進(jìn)因子(maturation promoting factor, MPF)在哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過(guò)程中起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用，它發(fā)揮活性的催化亞基就是由細(xì)胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶構(gòu)成[25,26]。在豬卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體培養(yǎng)過(guò)程中抑制MPF的活性，卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟顯著受阻，同時(shí)MPF活性還影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過(guò)程中母源基因的表達(dá)[27]。在發(fā)育不良的豬卵母細(xì)胞內(nèi)，MPF催化亞基和調(diào)節(jié)亞基的mRNA和蛋白表達(dá)水平都顯著降低[28]。這說(shuō)明MPF的高水平表達(dá)及正常激活在豬卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中起關(guān)鍵作用。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)是一類廣泛存在于真核細(xì)胞中的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過(guò)程中也具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，MAPK調(diào)控卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過(guò)程中微管和染色質(zhì)的行為，在小鼠卵母細(xì)胞減數(shù)分裂時(shí)，即使MPF的活性被抑制，MAPK依然能夠誘導(dǎo)卵母細(xì)胞染色質(zhì)凝聚和紡錘體形成[29,30]。在豬卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟過(guò)程中，用MAPK專用抑制劑抑制MAPK的活性，染色體分離、第一極體排出和MⅡ期紡錘體的形成都被抑制[31]。另外，GO條目膠原分解過(guò)程(GO：0030574)與發(fā)情動(dòng)物的排卵行為密切相關(guān)。在蛋白分解酶的作用下，排卵前卵泡頂端膠原分解和細(xì)胞死亡是卵泡即將破裂排卵的標(biāo)志。因此推測(cè)，對(duì)發(fā)情母豬而言，差異表達(dá)lincRNAs主要是通過(guò)調(diào)控卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟過(guò)程來(lái)影響母豬的生殖活動(dòng)。對(duì)乏情母豬而言，最值得關(guān)注的GO條目是正調(diào)控NF-kB轉(zhuǎn)錄因子的活性(GO:0051092)，該條目在分子功能模塊最為富集。NF-kB作為信號(hào)傳導(dǎo)通路的中樞，參與許多生物過(guò)程的調(diào)控，如炎癥和免疫反應(yīng)、細(xì)胞增殖和凋亡、細(xì)胞分化等[32~35]。NF-kB異?；罨烧{(diào)節(jié)與細(xì)胞增殖和凋亡有關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡，并且已有研究證實(shí)NF-kB具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，NF-kB亞單位的種類及數(shù)量在細(xì)胞凋亡中起著決定性的作用[36,37]。研究表明NF-kB直接參與豬卵巢細(xì)胞的增殖和分泌活動(dòng)，NF-kB的兩個(gè)亞基P65和P50均有抑制豬卵巢顆粒細(xì)胞分化的作用，且P50在過(guò)表達(dá)時(shí)，促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡[38,39]。因此推測(cè)，差異表達(dá)的lincRNAs可能通過(guò)異?；罨疦F-kB信號(hào)通路，抑制了卵巢細(xì)胞的分化，促進(jìn)了顆粒細(xì)胞的凋亡，引起了卵泡閉鎖，最終導(dǎo)致母豬乏情。

Pathway：ID代表該通路在KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)中的編號(hào)。

藍(lán)色節(jié)點(diǎn)代表差異表達(dá)lincRNAs，黃色節(jié)點(diǎn)代表差異表達(dá)mRNAs，綠線代表正相關(guān)，紅線代表負(fù)相關(guān)。

本研究利用lincRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析來(lái)確定差異表達(dá)的lincRNAs和差異表達(dá)的mRNAs之間的關(guān)系。在這個(gè)lincRNA-mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)中，基因關(guān)聯(lián)到的lincRNAs (11個(gè))最多，在人體內(nèi)該基因編碼的蛋白NIBP參與膜泡運(yùn)輸過(guò)程，增強(qiáng)TNTα誘導(dǎo)的NF-kB活性，直接與IKK和MAP3K14相互作用，參與NF-kB信號(hào)通路的經(jīng)典激活和替代激活[40,41]，NIBP在進(jìn)化過(guò)程中高度保守，而豬又擁有與人類極為相似的基因特征，因此，推測(cè)差異表達(dá)的lincRNAs通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)來(lái)參與NF-kB信號(hào)通路的激活過(guò)程，從而影響母豬的生殖活動(dòng)。另外，該網(wǎng)絡(luò)與TCONS_00009672共表達(dá)的基因與卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟密切相關(guān)。是一個(gè)休眠的母源mRNA，在卵母細(xì)胞成熟過(guò)程中被招集并翻譯來(lái)調(diào)控組蛋白的去乙?；c成熟相關(guān)的組蛋白乙?；浇档蛯?duì)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟正常進(jìn)行及染色體準(zhǔn)確分離至關(guān)重要，被SiRNA耗盡的卵母細(xì)胞出現(xiàn)了嚴(yán)重的染色體錯(cuò)排、著絲粒–微管連接不當(dāng)、SAC功能受損、胞質(zhì)分裂缺陷和MⅡ非整倍體發(fā)生率增加[42,43]。因此，在豬下丘腦–垂體–卵巢軸中的鑒定TCONS_ 00009672很有可能也是通過(guò)調(diào)節(jié)基因來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)卵母細(xì)胞成熟發(fā)育的影響，從而影響母豬的發(fā)情活動(dòng)，詳盡的機(jī)理還得進(jìn)一步的挖掘探討。

本研究通過(guò)RNA-seq技術(shù)分析了乏情和發(fā)情初產(chǎn)母豬下丘腦–垂體–卵巢軸中l(wèi)incRNAs的表達(dá)圖譜，并對(duì)差異表達(dá)lincRNAs的功能進(jìn)行初步分析，發(fā)現(xiàn)這些lincRNAs主要與卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂成熟、卵巢細(xì)胞分化及顆粒細(xì)胞凋亡等生殖活動(dòng)相關(guān)，但與重要生殖激素相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程并未預(yù)測(cè)到，存在測(cè)序沒(méi)有生物學(xué)重復(fù)，預(yù)測(cè)到的差異表達(dá)lincRNAs并不全面所致的可能。

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Comparison and analysis of lincRNAs expression profile in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis of anestrous and estrous primiparous sows

Qiaoling Ren1, Jiaqing Zhang1, Dongfeng Lu2, Jing Wang1, Junfeng Chen1, Qiang Ma1, Xianxiao Bai1, Hongxiao Guo1, Binwen Gao1, Baosong Xing1

The normal estrus in weaned primiparous sows has a great impact on pig production and abnormal estrus is the main reason for the elimination of primiparous sows. In this study, we studied the long intergenic noncoding RNAs (lincRNAs) in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis of anestrous and estrous primiparous sows. These long intergenic noncoding RNAs (lincRNAs) were screened and compared through RNA-seq analysis. The expression profiles of lincRNAs were obtained and their characteristics and functions were preliminarily analyzed. There are 3519 novel lincRNAs identified in the hypothalamic-pituitary-ovarian axis of anestrous and estrous primiparous sows. Compared with estrous primiparous sows, 17 differentially expressed lincRNAs were indentified, including 12 up-regulated lincRNAs and 5 down-regulated lincRNAs (FC≥2,<0.05). The four lincRNA transcripts obtained through selection were verified by qRT-PCR, which are consistent with the RNA-seq results. The GO, KEGG pathway, and lincRNA-mRNA co-expression network analysis of these 17 lincRNAs revealed that these lincRNAs were mainly involved in reproductive activities, such as oocyte meiosis mature, ovarian cells differentiation and granulosa cells apoptosis. The results enriched the data resources of pig lincRNAs and provided useful information for further research about the reproductive performance of primiparous sows.

lincRNAs; anestrus; estrus; primiparous sows; hypothalamic-pituitary-ovarian axis

2019-11-14;

2020-02-29

河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新創(chuàng)意項(xiàng)目(編號(hào)：2020CX06)，河南省重點(diǎn)研發(fā)專項(xiàng)(編號(hào)：182102110063)，河南省財(cái)政預(yù)算科研專項(xiàng)項(xiàng)目(編號(hào)：2019CY015)和河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院自主創(chuàng)新項(xiàng)目(編號(hào)：2019ZC42)資助[Supported by Science and Technology Innovation Program (No. 2020CX06), Key Special Rresearch and Development Program of Henan Province (No. 182102110063), Henan Province Financial Budget for Scientific Research Program (No. 2019CY015), and the Program for Independent Innovative Research in Henan Academy of Agricultural Sciences (No. 2019ZC42)]

任巧玲，碩士，副研究員，研究方向：豬的育種與營(yíng)養(yǎng)。E-mail: renql76@163.com

張家慶，博士，助理研究員，研究方向：豬的育種與繁殖。E-mail: zjq8650612@163.com

任巧玲和張家慶為并列第一作者。

邢寶松，博士，副研究員，研究方向：豬的育種與管理。E-mail: baosong@126.com

10.16288/j.yczz.19-347

2020/3/17 10:34:49

URI: http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.r.20200316.1144.002.html

(責(zé)任編委: 李明洲)