近平滑假絲酵母ATCC 7330對不同取代基乙酮類底物的催化效果

劉 云,王 偉,郭金玲,任立偉,羅華軍,余華順,戴秋紅,姚 鵑,龔大春*

(1.三峽大學(xué) 湖北省生物酵素工程技術(shù)研究中心，湖北 宜昌 443002；2.安琪酵母股份有限公司酶制劑事業(yè)部，湖北 宜昌 443002)

生物催化中常用的有機(jī)體是微生物，其本質(zhì)是利用微生物細(xì)胞內(nèi)的酶進(jìn)行催化[1-3]。生物催化法反應(yīng)條件溫和，催化過程具有高度的區(qū)域、化學(xué)和立體選擇性，是國內(nèi)外手性制備的主要方法[4-9]。近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)整細(xì)胞或其來源的羰基還原酶(carbonyl reductase)在消旋體醇類化合物的去消旋化、前手性酮或烯胺的不對稱還原、消旋體醇類物質(zhì)的動力學(xué)拆分等方面的手性羥基或手性胺藥物研究與開發(fā)中得到廣泛應(yīng)用[10-11]。Chadha等[12]高度評價了近平滑假絲酵母的生物催化應(yīng)用價值，把近平滑假絲酵母及其來源的酶作為有機(jī)合成中生物催化的一種“試劑”。在合適的反應(yīng)介質(zhì)中，近平滑假絲酵母ATCC 7330羰基還原酶(CpCR)能夠不對稱催化乙酮類物質(zhì)還原生成R或S型甲基醇[12-18]。CpCR的蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析，其蛋白編號為4OAQ，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 CpCR的結(jié)構(gòu)

目前，國內(nèi)對近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞催化的底物研究較少[19-20]。鑒于此，作者設(shè)計10種不同取代基的乙酮類底物，通過計算機(jī)模擬預(yù)測和實驗驗證，研究近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞催化的底物適應(yīng)性，以期為該菌株更好應(yīng)用于生物催化領(lǐng)域奠定基礎(chǔ)。

1 實驗

1.1 菌株、試劑與儀器

近平滑假絲酵母(Candidaparapsilosis)ATCC 7330，實驗室保藏。

葡萄糖、酵母浸粉、蛋白胨，北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蔗糖、乳糖、木糖，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品：1-苯乙醇、1-(1H-茚-4-基)乙醇、1-(1-萘基)乙醇、對氯苯乙醇、鄰氯苯乙醇、對氨基苯乙醇、鄰氨基苯乙醇、環(huán)丙基乙醇、環(huán)戊基乙醇、1-環(huán)己基乙醇、苯乙酮、1-(1H-茚-4-基)乙酮、1-萘乙酮、對氯苯乙酮、鄰氯苯乙酮、對氨基苯乙酮、鄰氨基苯乙酮、環(huán)丙基乙酮、環(huán)戊基乙酮、環(huán)己基乙酮，武漢藥明康德公司。所有試劑均為分析純。

VS-1300L-U型超凈工作臺，蘇凈安泰；UV1800型紫外分光光度計，日本島津；ZQLY-180型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器；4L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；DHP-9052型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20。

固體培養(yǎng)基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，瓊脂15。

斜面保藏培養(yǎng)基(g·L-1)：蔗糖20，酵母浸粉10，蛋白胨20，瓊脂20。

1.3 方法

1.3.1 CpCR與不同取代基乙酮類底物對接的仿真模擬與預(yù)測

利用Discovery Studio 2017版軟件，將CpCR分別與自行設(shè)計的10種不同取代基乙酮類底物(圖2)進(jìn)行CDOCKER對接，計算這些乙酮類底物和CpCR的結(jié)合能和相互作用能，用于預(yù)測近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞的底物適應(yīng)性和催化能力。

1.3.2 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

平板培養(yǎng)：接種后的斜面置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。

種子培養(yǎng)：平板培養(yǎng)液接種到裝液量20%的搖瓶中，于28 ℃培養(yǎng)24 h。

發(fā)酵培養(yǎng)：種子液以10%接種量接種至搖瓶或發(fā)酵罐中，于28 ℃振蕩培養(yǎng)。

圖2 10種不同取代基乙酮類底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)式

1.3.3 整細(xì)胞催化劑的制備

將長勢良好的斜面菌種挑取 1 環(huán)，接種于固體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h；經(jīng)多次轉(zhuǎn)接活化后挑選生長良好的單菌落接種于種子培養(yǎng)基中，于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng) 24 h；將種子液以10%的接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，于28 ℃、200 r·min-1培養(yǎng)48 h；將發(fā)酵液于4 ℃、4 500 r·min-1離心，并用生理鹽水洗滌3次后收集細(xì)胞，即得整細(xì)胞催化劑。

1.3.4 整細(xì)胞催化過程

反應(yīng)介質(zhì)和萃取劑根據(jù)底物和產(chǎn)物的極性特點來確定。將6.5 g濕細(xì)胞置于32.5 mL磷酸緩沖溶液(pH值6.5,10 mmol·L-1)中，制得細(xì)胞懸浮液；取0.1 g底物用1.5 mL丙酮溶解，加入到細(xì)胞懸浮液中；28 ℃、150 r·min-1培養(yǎng)一定時間后，用3×50 mL乙酸乙酯(環(huán)丙基乙酮用3×50 mL乙醚)萃取，無水硫酸鈉干燥，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，定容在容量瓶中，備用。

1.3.5 整細(xì)胞催化產(chǎn)物的分離

1-(1H-茚-4-基)乙醇、環(huán)丙基乙醇、環(huán)戊基乙醇、1-環(huán)己基乙醇采用氣相色譜柱DB-wax分離(汽化室溫度250 ℃,檢測器溫度250 ℃,柱溫350 ℃,氮載氣流速1.0 mL·min-1)。紫外吸收比較強(qiáng)的物質(zhì)1-苯乙醇、1-(1-萘基)-乙醇、對氯苯乙醇、鄰氯苯乙醇、鄰氨基苯乙醇、對氨基苯乙醇等采用高效液相色譜柱OB-H分離(流動相為正己烷∶異丙醇=9∶1，柱溫30 ℃，紫外檢測波長254 nm，進(jìn)樣量10 μL)。

1.3.6 化學(xué)收率、光學(xué)收率和催化劑周轉(zhuǎn)數(shù)的計算

化學(xué)收率和光學(xué)收率：采用外標(biāo)法定量檢測醇類產(chǎn)物。

催化劑周轉(zhuǎn)數(shù)：1 mol整細(xì)胞催化劑1 s催化轉(zhuǎn)化底物的摩爾數(shù)。用來表征催化劑的催化能力，催化劑周轉(zhuǎn)數(shù)越大，催化能力越強(qiáng)。

以苯乙酮轉(zhuǎn)化為苯乙醇為例，化學(xué)收率、光學(xué)收率、催化劑周轉(zhuǎn)數(shù)的計算如下：

(1)

(2)

(3)

式中：酶(CpCR)分子量為41 kDa，酶用量為10 mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 CpCR與10種不同取代基乙酮類底物結(jié)合能力的模擬計算

近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞作為一種生物催化劑，能夠催化還原各種有機(jī)酮類化合物生成手性羥基化合物。利用Discovery Studio 2017版軟件，將CpCR分別與自行設(shè)計的10種不同取代基乙酮類底物進(jìn)行模擬對接，計算結(jié)合能和相互作用能，結(jié)果見表1。

表1 CpCR與10種不同取代基乙酮類底物的結(jié)合能和相互作用能/(kJ·mol-1)

Tab.1 The docking energy and interaction energy of CpCR combined with ten ethyl ketone substrates with different substituted groups/(kJ·mol-1)

項目芳環(huán)取代基ⅠⅡⅢ帶不同取代基的苯環(huán)取代基ⅣⅤⅥⅦ脂環(huán)取代基ⅧⅨⅩ結(jié)合能-13.9220.17-1.39-14.34-12.43-19.41-12.730.760.9114.74相互作用能-16.66-15.87-17.27-17.06-19.9-23.68-14.18-9.45-20.3-2.62

從表1可以看出：

(1)CpCR與3類10種不同取代基乙酮類底物模擬對接的結(jié)合能差異較大。除了受空間位阻影響的1-(1H-茚-4-基)乙酮(Ⅱ)外，電子云密度高的芳環(huán)取代(包括帶不同取代基的苯環(huán)取代)乙酮類底物的結(jié)合能比電子云密度低的脂環(huán)取代乙酮類底物低得多，前者結(jié)合能為負(fù)值，比較容易發(fā)生催化還原反應(yīng)；而后者結(jié)合能為正值，催化還原難度加大。表明近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞對芳環(huán)取代乙酮類物質(zhì)的光學(xué)選擇性優(yōu)于脂環(huán)取代乙酮類底物。

(2)CpCR與同類不同取代基乙酮類底物模擬對接的對接能差異也較大。對于芳環(huán)取代基，其與CpCR的結(jié)合能大小依次為Ⅱ>Ⅲ>Ⅰ，可以預(yù)測在CpCR大基團(tuán)口袋區(qū)域中苯乙酮(Ⅰ)最容易被還原，而1-(1H-茚-4-基)乙酮(Ⅱ)由于空間位阻效應(yīng)較難與CpCR結(jié)合，被還原的難度最大；對于帶不同取代基的苯環(huán)取代基，其與CpCR的結(jié)合能大小依次為Ⅴ>Ⅶ>Ⅳ>Ⅵ，對位取代苯乙酮比鄰位取代苯乙酮更容易被還原，其中對氨基苯乙酮(Ⅵ)最容易被還原；對于脂環(huán)取代基，結(jié)合能均為正值，說明脂環(huán)取代乙酮類底物電子云密度大大降低，使得CpCR對其適應(yīng)性大大降低，導(dǎo)致光學(xué)選擇性降低。

(2)CpCR與3類10種不同取代基乙酮類底物模擬對接的相互作用能均為負(fù)值，可以預(yù)測近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞對10種不同取代基乙酮類底物均有一定的催化能力。

2.2 近平滑假絲酵母ATCC 7330對10種不同取代基乙酮類底物的催化效果(表2)

表2 近平滑假絲酵母ATCC 7330對10種不同取代基乙酮類底物的催化效果

Tab.2 Catalytic effect ofCandidaparapsilosisATCC 7330 on ten ethyl ketone substrates with different substituted groups

編號底物名稱分子量最佳轉(zhuǎn)化時間/h化學(xué)收率/%光學(xué)收率/%催化劑周轉(zhuǎn)數(shù)/s-1Ⅰ 苯乙酮120.07292.9799.991.56×105Ⅱ1-(1H-茚-4-基)乙酮158.048100.00 98.80 1.88×105Ⅲ1-萘乙酮170.01298.7999.906.96×105Ⅳ對氯苯乙酮154.61299.0099.008.80×105Ⅴ鄰氯苯乙酮154.61299.0099.008.80×105Ⅵ對氨基苯乙酮135.02495.12100.004.40×105Ⅶ鄰氨基苯乙酮135.04887.0079.221.92×105Ⅷ環(huán)丙基乙酮84.012064.1863.000.92×105Ⅸ環(huán)戊基乙酮112.248100.0057.002.68×105Ⅹ環(huán)己基乙酮126.22453.1285.112.52×105

從表2可以看出：

(1)對于3種芳環(huán)取代乙酮類底物(Ⅰ～Ⅲ)，近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞催化產(chǎn)物構(gòu)型均為R型，可實現(xiàn)較高的化學(xué)收率和光學(xué)收率，其中1-(1H-茚-4-基)乙酮的化學(xué)收率最高；近平滑假絲酵母ATCC 7330對3種芳環(huán)取代乙酮類底物的催化能力大小依次為Ⅲ>Ⅱ>Ⅰ，與底物的芳環(huán)電子云密度大小順序正好一致，說明芳環(huán)取代乙酮類底物的電子云密度越大，整細(xì)胞的催化效果越好；從光學(xué)收率看，苯乙酮和1-萘乙酮均能得到99.90%以上的光學(xué)純度，與結(jié)合能預(yù)測一致。

(2)對于4種帶不同取代基的苯環(huán)取代乙酮類底物(Ⅳ～Ⅶ)，近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞對氯取代苯乙酮的催化效果較對氨基取代苯乙酮的催化效果好，這可能是因為，氯對苯環(huán)的共軛效應(yīng)貢獻(xiàn)較大，使得羰基上氧的電子云密度較大，從而提高了整細(xì)胞催化效率；近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞對鄰氨基取代苯乙酮的催化效果較差，光學(xué)收率也較低，這可能與鄰氨基取代苯乙酮與CpCR模擬對接時的相互作用能較高有關(guān)；對氨基苯乙酮、對氯苯乙酮、鄰氯苯乙酮與CpCR模擬對接時的結(jié)合能均較低，其產(chǎn)物光學(xué)收率均達(dá)到99.00%以上，與結(jié)合能預(yù)測一致，但鄰氨基苯乙酮表現(xiàn)出中等的化學(xué)收率和光學(xué)收率，其原因還在進(jìn)一步研究中。

(3)對于3種脂環(huán)取代乙酮類底物(Ⅷ～Ⅹ)，光學(xué)收率均較低(57.00%～85.11%)，說明近平滑假絲酵母ATCC 7330對脂環(huán)取代乙酮類底物的適應(yīng)性較差，與預(yù)測的結(jié)合能較高(為正值)一致；從化學(xué)收率和催化劑周轉(zhuǎn)數(shù)來看，近平滑假絲酵母ATCC 7330對環(huán)戊基乙酮的催化效果較好。

3 結(jié)論

從近平滑假絲酵母ATCC 7330對3類10種不同取代基乙酮類底物的催化效果可以看出，近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞催化對芳環(huán)取代乙酮類底物的光學(xué)選擇性優(yōu)于脂環(huán)取代乙酮類底物，對氨基苯乙酮的光學(xué)選擇性最高，與模擬對接預(yù)測的結(jié)合能大小一致；從催化劑周轉(zhuǎn)數(shù)來看，近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞對10種不同取代基乙酮類底物的催化能力大小依次為對氯苯乙酮=鄰氯苯乙酮>1-萘乙酮>對氨基苯乙酮>環(huán)戊基乙酮>環(huán)己基乙酮>鄰氨基苯乙酮>1-(1H-茚-4-基)乙酮>苯乙酮>環(huán)丙基乙酮，與對接模擬預(yù)測有一定差距，說明近平滑假絲酵母ATCC 7330整細(xì)胞的催化能力除了與結(jié)合能有關(guān)外，還與細(xì)胞的滲透性、反應(yīng)溶劑等因素有關(guān)，需要做進(jìn)一步研究。