維藥睡蓮花生藥學(xué)檢測(cè)及其沒食子酸含量測(cè)定

陳 偉，古孜麗阿依·庫(kù)爾班，王曉敏，劉 利，周 凡*

(1.新疆華世丹藥物研究有限責(zé)任公司,新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

維吾爾藥材睡蓮花為睡蓮科植物雪白睡蓮NymphaeacandidaPres1.的干燥花，維藥名尼魯法爾?！端幬镏畧@》記載睡蓮花具有治療小兒驚風(fēng)、風(fēng)熱感冒所致頭疼及咳嗽等作用[1-2]；《本草再新》載其具有“清心涼血，解熱毒，治驚癇，消濕去風(fēng)，治瘡疥”等諸多功效[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明，睡蓮花所含的多元酚、沒食子酸和蘆丁類成分具有抗氧化、保護(hù)肝臟損傷、調(diào)節(jié)血壓緊張素釋放等藥理作用[4]。睡蓮花在現(xiàn)代藥物(如維藥祖卡木顆粒等[5])中的應(yīng)用也日趨廣泛。目前有關(guān)睡蓮花的研究報(bào)道多集中于其化學(xué)成分的研究[6]，關(guān)于其質(zhì)量控制方面的報(bào)道較少，未見相關(guān)性狀測(cè)量數(shù)據(jù)及花苞切片的顯微鑒別[7]，高效液相圖譜分離度不高、峰形特異性不明顯[8]。因此，作者按照《中華人民共和國(guó)藥典》2015版第一部附錄方法對(duì)睡蓮花藥材進(jìn)行分析，對(duì)睡蓮花花苞切片進(jìn)行顯微鑒別，對(duì)睡蓮花藥材進(jìn)行薄層色譜(TLC)鑒別，并構(gòu)建睡蓮花中沒食子酸含量的高效液相色譜(HPLC)檢測(cè)方法，以期進(jìn)一步提高其質(zhì)量控制水平。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥材

睡蓮花：批號(hào)H30180801、H30163104，新疆維麥迪森藥業(yè)； 批號(hào)16071001，新疆本草堂藥房。

1.2 試劑與儀器

沒食子酸對(duì)照品，批號(hào)110831-201605，中國(guó)食品藥品研究院；乙酸乙酯，批號(hào)20170104，天津紅巖試劑廠；環(huán)己烷，批號(hào)20160213，天津斯巴夫化工有限公司；甲酸，批號(hào)20160820，天津大漠化學(xué)試劑廠；色譜級(jí)甲醇，批號(hào)T20110922，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；色譜級(jí)磷酸，批號(hào)631-61-8，上海提坦實(shí)業(yè)有限公司。

LC-20AD型高效液相色譜儀，日本島津； FA1004型電子分析天平，上海舜平科學(xué)儀器有限公司；SK33000CHC型超聲波清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；WFH-203BCN型薄層分析儀，上海精細(xì)儀器有限公司；FP40型馬弗爐，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；2BE2000型倒置顯微鏡，重慶光電儀器有限公司。

2 結(jié)果與討論

2.1 睡蓮花藥材分析結(jié)果

按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)第一部附錄方法，測(cè)定3批睡蓮花藥材70%乙醇浸出物的水分、總灰分、酸不溶性灰分及沒食子酸等含量，結(jié)果見表1。

表1 睡蓮花藥材的分析結(jié)果

Tab.1 Analytic results ofNymphaeacandidaPresl.

批號(hào)花苞質(zhì)量g水分%總灰分%酸不溶性灰分%浸出物%沒食子酸mg·g-1H301808010.707.6010.612.6739.341.55H301631041.186.1910.601.6134.971.31160710010.376.489.612.6724.631.44平均值0.756.7510.272.3232.981.43

2.2 睡蓮花花苞切片的顯微鑒別

按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)第一部附錄方法，對(duì)批號(hào)H30180801的睡蓮花藥材粉末進(jìn)行顯微鑒別，結(jié)果見圖1。同時(shí)，對(duì)睡蓮花花苞進(jìn)行徒手切片，經(jīng)水合氯醛加熱透化后進(jìn)行顯微鑒別，結(jié)果見圖2。

a.非腺毛 b.螺紋導(dǎo)管 c.星狀石細(xì)胞 d.花粉 e.支持細(xì)胞 f.木纖維

a.星狀石細(xì)胞 b.螺紋導(dǎo)管 c.內(nèi)表皮層 d.外表皮層

從圖1可知，睡蓮花藥材粉末中有大量非腺毛。從圖2可知，睡蓮花花苞切片內(nèi)外表皮層間夾雜大量星狀石細(xì)胞，表皮下層有大量導(dǎo)管，表皮細(xì)胞狹長(zhǎng)，氣孔為長(zhǎng)圓形。

2.3 睡蓮花藥材的薄層色譜鑒別

取3批睡蓮花藥材粉末(過4號(hào)篩)各1.0 g，加甲醇6 mL，超聲(功率180 W，頻率53 kHz) 40 min，過濾，濾液作為供試溶液。取沒食子酸對(duì)照品適量，加甲醇制成0.5 mg·mL-1對(duì)照溶液。分別吸取供試溶液和對(duì)照溶液各10 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸(8∶6∶1，體積比)為展開劑，飽和，展開。取出晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液，晾干至斑點(diǎn)清晰，如圖3所示。

a.沒食子酸對(duì)照品 b.睡蓮花(H30163104) c.睡蓮花(H30180801) d.睡蓮花(16071001)

2.4 睡蓮花中沒食子酸含量測(cè)定

2.4.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipe×DB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.05%的磷酸(5∶95，體積比) ；檢測(cè)波長(zhǎng)271 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL·min-1。

2.4.2 對(duì)照溶液的配制

精密稱取5.0 mg沒食子酸對(duì)照品置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得濃度為0.50 mg·mL-1的對(duì)照儲(chǔ)備液。再精密吸取儲(chǔ)備液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，即得50.0 μg·mL-1對(duì)照溶液。

2.4.3 供試溶液的配制

精密稱取3批睡蓮花藥材粉末(過4號(hào)篩)各1.0 g，分別置于具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，稱量；超聲(功率180 W，頻率53 kHz)20 min，放冷，再稱量；用甲醇補(bǔ)足損失質(zhì)量，過0.45 μm濾膜，濾液作為供試溶液。

2.4.4 HPLC圖譜

沒食子酸對(duì)照溶液和睡蓮花供試溶液的HPLC圖譜如圖4所示。

2.4.5 線性關(guān)系考察

精密吸取對(duì)照儲(chǔ)備液適量，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成濃度(μg·mL-1)分別為100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562 5的對(duì)照溶液。精密吸取上述各溶液10 μL，按色譜條件進(jìn)樣分析。以濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖5)，擬合得沒食子酸線性回歸方程：y=65753x+11842,R2=1。結(jié)果表明，沒食子酸濃度在1.562 5～100 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

圖4 沒食子酸對(duì)照溶液(a)和睡蓮花供試溶液(b)的HPLC圖譜

2.4.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取沒食子酸對(duì)照溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，沒食子酸峰面積的RSD為0.4072%，表明儀器精密度良好。

2.4.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取睡蓮花藥材(批號(hào)H30180801)供試溶液，于室溫下分別放置0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、24 h后進(jìn)樣檢測(cè)。結(jié)果顯示，沒食子酸峰面積的RSD為0.9754%，表明睡蓮花供試溶液在室溫下放置24 h仍穩(wěn)定。

圖5 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.8 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱取6份已知含量的睡蓮花藥材粉末(批號(hào)16071001)0.05 g，精密加入25 μg·mL-1沒食子酸對(duì)照溶液2.5 mL，按2.4.3制備供試溶液，按色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果見表2。

表2 沒食子酸加標(biāo)回收率(n=6)

Tab.2 Adding standard recovery of gallic acid(n=6)

序號(hào)稱樣量/g樣品含量/mg加入量/mg測(cè)得量/mg回收率/%10.05070.06970.06250.131498.7620.05020.06900.06250.1322101.0830.05030.06920.06250.128695.1340.05100.07010.06250.131798.5750.05050.06940.06250.131599.3360.05000.06880.06250.130298.32

由表2可知，沒食子酸的平均加標(biāo)回收率為98.53%，RSD為1.98%(n=6)。

2.4.9 樣品測(cè)定

取3批睡蓮花藥材樣品，按2.4.3方法制備供試溶液，按色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到3批睡蓮花藥材中沒食子酸平均含量為1.43 mg·g-1。

2.5 討論

(1)由于缺乏睡蓮花花苞切片顯微鑒別的文獻(xiàn)報(bào)道，而其粉末顯微結(jié)構(gòu)與其它類似蓮花接近，無法從整體上區(qū)分睡蓮花與偽品的顯微結(jié)構(gòu)差異。本實(shí)驗(yàn)在生藥學(xué)檢測(cè)基礎(chǔ)上，對(duì)睡蓮花花苞切片進(jìn)行了顯微鑒別，結(jié)果顯示，睡蓮花花苞切片為典型的“三明治”結(jié)構(gòu)，上下層有大量的表皮細(xì)胞和支持細(xì)胞，中間分布大量特異性的星狀石細(xì)胞，可作為睡蓮花的專屬鑒別項(xiàng)目。

(2)睡蓮花花苞的主要成分有煙花苷、多元酚、沒食子酸和槲皮素等；在睡蓮花花朵的13種乙酸乙酯提取物中，沒食子酸和槲皮素具有顯著保護(hù)肝臟損傷作用(40.12%)，其抑制DPPH自由基的IC50值分別可達(dá)1.78 μg·mL-1和1.97 μg·mL-1[12]。由于沒食子酸具有易被氧化的特性，本實(shí)驗(yàn)比較了提取溶劑、提取方式、料液比和提取時(shí)間對(duì)沒食子酸含量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比純水和乙酸乙酯，沒食子酸在甲醇溶液中更穩(wěn)定，72 h內(nèi)含量無顯著降低；超聲提取和加熱回流提取對(duì)沒食子酸含量影響不大；料液比為1∶10(g∶mL)時(shí)沒食子酸含量最高；超聲20 min時(shí)沒食子酸含量最高，且無氧化產(chǎn)物雜質(zhì)干擾。

(3)在睡蓮花藥材薄層色譜鑒別中，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比了石油醚∶乙酸乙酯、環(huán)己烷∶乙酸乙酯∶甲酸兩種展開體系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，后者斑點(diǎn)更清晰，無拖尾現(xiàn)象?；诖耍x擇甲醇-1%冰乙酸、甲醇-0.05%磷酸進(jìn)行流動(dòng)相對(duì)比實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，流動(dòng)相甲醇-0.05%磷酸的pH值更低，離子強(qiáng)度更高，在低波長(zhǎng)時(shí)對(duì)本底影響更小，沒食子酸色譜峰的分離度相應(yīng)更高。

3 結(jié)論

維藥睡蓮花具有降熱止咳、益心護(hù)腦、祛除“乃孜來”等多種功效，對(duì)感冒、心血管疾病、咽炎及肝炎有一定療效[9-10]。但目前國(guó)內(nèi)上市的以睡蓮花為主藥的藥物只有維藥祖卡木顆粒(已被納入醫(yī)保目錄[11])。究其原因，可能是睡蓮花質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的不夠完善。目前，睡蓮花質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)只有《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)(維吾爾藥分冊(cè))》，檢測(cè)方法僅為顯微鑒別[2]。為提升維藥睡蓮花的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，按照《中華人民共和國(guó)藥典》(2015年版)第一部附錄方法對(duì)睡蓮花藥材進(jìn)行分析，對(duì)睡蓮花花苞切片進(jìn)行顯微鑒別，對(duì)睡蓮花藥材進(jìn)行TLC鑒別，并構(gòu)建睡蓮花中沒食子酸含量的HPLC檢測(cè)方法。結(jié)果表明，睡蓮花花苞切片顯微形態(tài)特征明顯，睡蓮花藥材粉末特征細(xì)胞顯微形態(tài)清楚；TLC圖譜斑點(diǎn)清晰，Rf值與對(duì)照品一致；沒食子酸濃度在1.562 5～100 μg·mL-1之間與色譜峰面積呈良好線性關(guān)系(R2=1)，精密度實(shí)驗(yàn)RSD為0.4072%,平均加標(biāo)回收率為98.53%(RSD=1.98%,n=6)。該研究補(bǔ)充了睡蓮花花苞切片的顯微鑒別，新建了睡蓮花的TLC鑒別，優(yōu)化了睡蓮花中沒食子酸含量的HPLC檢測(cè)方法。