管花肉蓯蓉藥渣中多糖提取工藝及體外抗氧化活性研究

艾拉旦·麥麥提艾力，楊 婷，袁 潔，艾拉旦·艾力，姚 軍*，游 林

(1.新疆醫(yī)科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆醫(yī)科大學厚博學院，新疆 克拉瑪依 834000；3.和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司，新疆 和田 848000)

管花肉蓯蓉(Cistanchetubulosa)為列當科管花肉蓯蓉Cistanchetubulosa(Schenk) Wight的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，又稱南疆大蕓、硬大蕓。管花肉蓯蓉生長于海拔800～1 400 m的沙地或半固定沙丘、干涸老河床、湖盆低地等，常寄生于檉柳和梭梭的根部。管花肉蓯蓉具有補腎壯陽、潤腸通便、保肝、抗衰老、抗疲勞、增強免疫力及益智等功效[1-4]，主治腎陽不足、精血虧虛、陽痿不孕、腰膝酸軟、筋骨無力、腸燥便秘等癥[5-6]。

國內(nèi)外對管花肉蓯蓉的研究熱點主要集中于醇提取的苯乙醇苷類成分[7-8]，其指標性成分為松果菊苷和毛蕊花糖苷?；哪馍惾睾凸芑ㄈ馍惾厥恰吨腥A人民共和國藥典》(2015年版)收載品種，均以松果菊苷和毛蕊花糖苷為指標成分進行質(zhì)量控制。研究發(fā)現(xiàn)，荒漠肉蓯蓉多糖具有抗衰老、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、改善人體造血功能等功效，且毒副作用小[9]。管花肉蓯蓉主產(chǎn)于新疆和田地區(qū)，已實現(xiàn)大面積人工栽培，其產(chǎn)量占全國的70%。截至2017年上半年，于田縣管花肉蓯蓉種植面積達11 700 hm2，接種管花肉蓯蓉面積為10 300 hm2，年產(chǎn)量突破10 000 t，已作為肉蓯蓉的新基原進入市場[10]。和田地區(qū)肉蓯蓉企業(yè)采用醇提法提取管花肉蓯蓉中的苯乙醇苷類成分，進行中成藥和保健品的研發(fā)，已上市產(chǎn)品有蓯蓉總苷膠囊、復方蓯蓉益智膠囊、肉蓯蓉黑米保健酒等[11]，但醇提后的藥渣一般作為廢物處理。

作者所在課題組在實驗中發(fā)現(xiàn)管花肉蓯蓉藥渣中的多糖含量較為豐富，但有關多糖有效成分含量[12]、藥理藥效的報道較少。為此，作者對管花肉蓯蓉多糖的提取工藝及體外抗氧化活性進行研究，擬為管花肉蓯蓉多糖的綜合利用奠定理論基礎，促進管花肉蓯蓉加工產(chǎn)業(yè)技術升級。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

管花肉蓯蓉藥渣，新疆和田帝辰醫(yī)藥生物科技有限公司。

無水乙醇、濃硫酸，天津富宇精細化工有限公司；蒽酮，上?？曝S實業(yè)有限責任公司；無水葡萄糖，天津致遠化學試劑有限公司；抗壞血酸，天津天新精細化工開發(fā)中心；二苯代苦味?；?DPPH)，上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司；新亞銅試劑、過氧化氫、硫酸亞鐵、水楊酸等均為分析純。

AB135-S型分析天平，瑞士梅特勒公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；EYELA OSB-2100型油浴鍋、EYELA N-1001型旋轉蒸發(fā)儀，上海愛郎儀器有限公司；UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

葡萄糖溶液：精密稱取10.08 mg葡萄糖于100 mL容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，即得0.100 8 mg·mL-1葡萄糖溶液。

硫酸蒽酮溶液：精密稱取蒽酮0.1 g于100 mL容量瓶中，加硫酸溶解并定容至刻度，搖勻，即得1.0 mg·mL-1硫酸蒽酮溶液。

1.2.2 標準曲線的繪制

參照《中華人民共和國藥典》(2015年版)中多糖含量測定項繪制標準曲線[13]：分別精密量取0.100 8 mg·mL-1葡萄糖溶液0.4 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL置于具塞試管中，用蒸餾水補足至2.0 mL；加入1.0 mg·mL-1硫酸蒽酮溶液6 mL，立即搖勻，靜置15 min后冰水浴冷卻15 min；以蒸餾水為空白，測定不同濃度葡萄糖溶液在625 nm處的吸光度。以葡萄糖濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.3 管花肉蓯蓉多糖的提取

脫脂：將管花肉蓯蓉藥渣粉碎，過65目篩，按1∶3(g∶mL，下同)的料液比加入95%乙醇回流脫脂2 h，過濾，常溫晾干，得脫脂管花肉蓯蓉藥渣。

提?。喝∶撝幵?0 g，加蒸餾水提取，過濾，濃縮濾液，加入4倍體積的無水乙醇，4 ℃下靜置24 h，抽濾，沉淀晾干，得管花肉蓯蓉多糖，稱重，密封保存，備用。

本實驗中，管花肉蓯蓉藥渣中多糖含量在40%～70%之間，為提高指標的科學性，按式(1)計算多糖提取率：

(1)

式中：m1為多糖質(zhì)量，g；m0為藥渣質(zhì)量，g。

1.2.4 提取工藝優(yōu)化

1.2.4.1 單因素實驗

影響管花肉蓯蓉多糖提取率的主要因素是料液比、提取時間、提取溫度。采用單因素實驗，分別考察料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取時間(1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h)、提取溫度(70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃)對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響。

1.2.4.2 正交實驗

為了優(yōu)化管花肉蓯蓉藥渣中多糖的提取工藝[14]，在單因素實驗的基礎上，以管花肉蓯蓉多糖提取率為指標，以提取溫度、料液比、提取時間為考察因素進行正交實驗，每個實驗重復3次。

1.2.5 體外抗氧化活性評價

1.2.5.1 對DPPH自由基清除能力的測定

配制濃度分別為20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、60 μg·mL-1、80 μg·mL-1、100 μg·mL-1的管花肉蓯蓉多糖溶液，分別加入2×10-4mol·L-1DPPH-乙醇溶液2 mL，搖勻，暗反應30 min；測定517 nm處吸光度(A1)。以等體積蒸餾水代替多糖溶液，同法操作，測定其吸光度(A0)；以等體積無水乙醇代替DPPH-乙醇溶液，同法操作，測定其吸光度(A2)；VC為陽性對照。按式(2)計算DPPH自由基清除率[15]：

(2)

1.2.5.2 對羥基自由基清除能力的測定

取若干具塞試管,依次加入9.0 mmol·L-1FeSO41 mL、9.0 mmol·L-1水楊酸-乙醇溶液1 mL、不同濃度(10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、40 μg·mL-1、80 μg·mL-1、160 μg·mL-1)的管花肉蓯蓉多糖溶液1 mL、3%H2O2溶液1 mL，37 ℃下加熱60 min,測定 510 nm處吸光度(A1)。以等體積蒸餾水代替多糖溶液， 同法操作，測定其吸光度(A0)；以等體積蒸餾水代替3%H2O2溶液，同法操作，測定其吸光度 (A2)；VC為陽性對照。平行測定3次， 取平均值。按式(2)計算羥基自由基清除率[16]。

1.2.5.3 對銅離子還原能力的測定

取若干具塞試管，分別加入0.5 mL不同濃度(5 μg·mL-1、10 μg·mL-1、20 μg·mL-1、30 μg·mL-1、40 μg·mL-1)的管花肉蓯蓉多糖溶液、1 mL新亞銅試劑(7.5 mmol·L-1)和1 mL CuSO4溶液(0.01 mol·L-1)，搖勻，再加入3.75 mL醋酸銨緩沖溶液，混勻，靜置30 min，測定450 nm 處吸光度，平行測定3次，取平均值(A)，最大吸光度為Amax[17]。以等體積蒸餾水代替多糖溶液作為空白對照，測定其吸光度(A0)；VC為陽性對照。按式(3)計算銅離子還原率：

(3)

2 結果與討論

2.1 標準曲線與回歸方程

以葡萄糖濃度(c)為橫坐標、吸光度(A)為縱坐標繪制標準曲線，如圖1所示。

擬合得回歸方程：A=39.603c-0.0771，R2=0.9998。表明，葡萄糖濃度在0.005～0.025 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關系。

2.2 管花肉蓯蓉多糖提取工藝單因素實驗結果

2.2.1 料液比對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響

固定提取溫度為70 ℃、提取時間為2.0 h，分別在料液比為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50的條件下提取脫脂管花肉蓯蓉藥渣中的多糖，考察料液比對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響，結果見圖2。

圖1 葡萄糖標準曲線

圖2 料液比對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響

從圖2可知，隨著料液比的減小，即溶劑用量的增加，管花肉蓯蓉多糖提取率逐漸升高。這是因為，隨著溶劑用量的增加，固體藥渣和水兩相中的多糖濃度差增大，有利于多糖從藥渣中溶出進入水中，導致多糖提取量不斷增加。考慮到濃縮時間，選擇1∶30～1∶50為正交實驗料液比水平。

2.2.2 提取時間對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響

固定料液比為1∶40、提取溫度為70 ℃，分別提取1.5 h、2.0 h、2.5 h、3.0 h、3.5 h，考察提取時間對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響，結果見圖3。

從圖3可知，隨著提取時間的延長，管花肉蓯蓉多糖提取率呈先升高后降低的趨勢，在2.5 h時達到最高。這可能是因為，隨著提取時間的延長，多糖溶出更充分，多糖提取率相應升高；但提取時間過長，多糖結構可能被破壞，提取率明顯下降。為保證多糖結構完整和生物活性，選擇2.0～3.0 h為正交實驗提取時間水平。

2.2.3 提取溫度對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響

固定料液比為1∶40、提取時間為2.0 h，分別在70 ℃、75 ℃、80 ℃、85 ℃、90 ℃下提取脫脂管花肉蓯蓉藥渣中的多糖，考察提取溫度對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響，結果見圖4。

圖3 提取時間對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響

圖4 提取溫度對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響

從圖4可知，隨著提取溫度的升高，管花肉蓯蓉多糖提取率先升高后降低，在提取溫度為85 ℃時，多糖提取率達到最高。這是因為，當提取溫度超過85 ℃后，多糖結構可能被破壞，提取率呈下降趨勢。為保證多糖結構完整，選擇80～90 ℃為正交實驗提取溫度水平。

2.3 管花肉蓯蓉多糖提取工藝正交實驗結果

正交實驗的因素與水平見表 1，結果與分析見表2，方差分析見表3。

表1 正交實驗的因素與水平

Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiments

水平因素A.提取溫度/℃B.料液比/(g∶mL)C.提取時間/h1801∶302.02851∶402.53901∶503.0

表2 正交實驗的結果與分析

Tab.2 Result and analysis of orthogonal experiments

實驗號ABC 提取率/%11 1 1 4.1421 2 2 3.3131 3 3 3.9742 1 2 3.1752 2 3 3.6762 3 1 4.1873 1 3 4.4183 2 1 4.9793 3 2 5.68K111.43 11.74 13.30K211.0311.9612.17K315.07 13.8312.06R1.34 0.70 0.42

表3 方差分析

Tab.3 Variance analysis of orthogonal experiments

方差來源離差平方和自由度均方F值F臨界值顯著性提取溫度3.302.001.656.6019.000無料液比0.882.000.441.7619.000無提取時間0.322.000.160.6419.000無誤差0.52.000.25

從表2、3可知，各因素對管花肉蓯蓉多糖提取率的影響大小依次為A>B>C，即提取溫度>料液比>提取時間，與直觀分析結果一致[18]；最優(yōu)提取條件為A3B3C1，即提取溫度90 ℃、料液比1∶50、提取時間2.0 h。

在最優(yōu)提取條件下，測得管花肉蓯蓉多糖得率為8.91%，多糖含量為64.6%，即提取率為5.76%。與文獻報道的黃梨渣多糖提取率(6.3%)相近[19]，說明管花肉蓯蓉藥渣中多糖含量較高，且管花肉蓯蓉功效成分含量較肉蓯蓉高，多糖也被認為是功效成分之一[20]，有進一步研究價值。

2.4 管花肉蓯蓉多糖的體外抗氧化活性

2.4.1 對DPPH自由基的清除能力(圖5)

從圖5可知，在20～100 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，管花肉蓯蓉多糖對DPPH自由基的清除能力和濃度呈正相關，清除率表現(xiàn)為劑量依賴性。當多糖濃度為100 μg·mL-1時，其對DPPH自由基的清除率為29.4%；而相同濃度的VC對DPPH自由基的清除率達到95.8%。表明，管花肉蓯蓉多糖對DPPH自由基的清除能力遠不如VC。

圖5 管花肉蓯蓉多糖對DPPH自由基的清除能力

2.4.2 對羥基自由基的清除能力(圖6)

圖6 管花肉蓯蓉多糖對羥基自由基的清除能力

從圖6可知，在10～160 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)，管花肉蓯蓉多糖對羥基自由基的清除率具有劑量依賴性。當多糖濃度為160 μg·mL-1時，其對羥基自由基的清除率為18.9%；而相同濃度的VC對羥基自由基的清除率達到98.6%。表明，管花肉蓯蓉多糖對羥基自由基的清除能力遠不如VC。

2.4.3 對銅離子的還原能力(圖7)

圖7 管花肉蓯蓉多糖對銅離子的還原能力

從圖7可知，當濃度為40 μg·mL-1時，管花肉蓯蓉多糖對銅離子的還原率為43.7%，VC對銅離子的還原率為81.3%;40 μg·mL-1管花肉蓯蓉多糖對銅離子的還原能力相當于27 μg·mL-1VC 對銅離子的還原能力。

綜上，管花肉蓯蓉多糖對DPPH自由基和羥基自由基都具有清除能力，但清除能力遠低于VC；管花肉蓯蓉多糖對銅離子具有較強的還原能力，其對銅離子的還原能力略低于VC，這可能是因為，多糖分子中含有大量的羥基[20]，能夠作為電子供體參與氧化還原反應，將高價金屬離子還原成低價。

3 結論

在單因素實驗的基礎上，通過正交實驗優(yōu)化了管花肉蓯蓉藥渣中多糖的提取工藝，確定最優(yōu)提取工藝為：提取溫度90 ℃、料液比1∶50(g∶mL)、提取時間2.0 h，在此條件下，管花肉蓯蓉多糖提取率為5.76%。管花肉蓯蓉多糖對DPPH自由基和羥基自由基都具有清除能力，對銅離子具有較強的還原能力。