蘆丁和阿魏酸與酪蛋白的相互作用研究

雷 選，王旭蘋，程鏡蓉，劉學(xué)銘1，,*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 江西 南昌 330045；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣東 廣州 510610)

酪蛋白(casein，Cs)在牛乳中的含量最為豐富，約占總蛋白質(zhì)含量的70%～80%，含有人體所需的必需氨基酸，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值及促進(jìn)鈣鐵離子吸收等生理功能[1]。Cs來源廣泛、價(jià)格低廉、安全無毒且穩(wěn)定性好，通常用它來運(yùn)輸小分子活性物質(zhì)。蘆丁屬于黃酮類化合物，具有很高的藥用價(jià)值和營養(yǎng)價(jià)值，可作為食品加工中的添加劑和抗氧化劑。阿魏酸是肉桂酸的衍生物之一，廣泛應(yīng)用于食品加工、醫(yī)藥制造等領(lǐng)域。

蘆丁和阿魏酸等小分子活性物質(zhì)在機(jī)體發(fā)揮作用時，需要被運(yùn)送到細(xì)胞中，此過程會受到多糖、蛋白質(zhì)等生物大分子的影響。在乳品加工領(lǐng)域，功能性乳制品越來越受到重視，而酚類物質(zhì)與乳蛋白的相互作用對產(chǎn)品品質(zhì)和功能有重要影響。目前已有相關(guān)文獻(xiàn)對酚酸類物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用機(jī)制進(jìn)行了部分研究。Wang等[2]發(fā)現(xiàn)牛血清蛋白與橘皮苷作用方式為靜態(tài)淬滅，且兩者通過疏水作用結(jié)合。Zhang等[3]研究發(fā)現(xiàn)α-乳白蛋白和β-乳球蛋白與酚酸類物質(zhì)(綠原酸、咖啡酸、阿魏酸及香豆酸)作用后，α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的空間構(gòu)象會發(fā)生改變，穩(wěn)定性降低，有助于提高蛋白質(zhì)的消化率。蘆丁和阿魏酸與酪蛋白互作機(jī)制的研究較少，本研究采用多重光譜法和抗氧化活性測定來探討蘆丁和阿魏酸與酪蛋白的相互作用機(jī)制，有利于闡明蘆丁和阿魏酸的生物利用途徑，以期為富含酚類物質(zhì)的功能性乳制品的研發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白(純度≥95%)，上海瑞永生物技術(shù)有限公司；蘆丁、阿魏酸(純度≥98%)，成都普瑞法公司；氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀(均為分析純)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)(純度≥97%)，天津市大茂化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M200pro型酶標(biāo)儀，奧地利TECAN公司；UV- 1800型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；Cary Eclipse型分子熒光分光光度計(jì)，美國Varian公司；VERTEX33型傅里葉變換紅外光譜儀，德國Bruker公司；ST85B3- 1型真空冷凍干燥機(jī)，美國Milirock公司；JascoJ- 815型圓二色光譜儀，日本分光公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1溶液配制

用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液 (PBS，pH值7.4)將酪蛋白配制成1.5×10-4、6×10-5mol/L的儲備液，于4 ℃儲存；用無水甲醇將蘆丁和阿魏酸分別配制成1.2×10-3mol/L的儲備液，于-20 ℃冰箱中避光貯存，使用時進(jìn)行稀釋。

1.3.2熒光光譜測定

取1 mL酪蛋白溶液于10 mL的比色管中，加入不同體積的蘆丁和阿魏酸儲備液，定容至10 mL，使得體系中酪蛋白的終濃度為6×10-6mol/L，蘆丁和阿魏酸的終濃度為0、1.2×10-5、2.4×10-5、3.6×10-5、4.8×10-5、6.0×10-5mol/L。漩渦混勻，分別在303 K和314 K溫度下反應(yīng)1 h。在激發(fā)波長為280 nm、掃描波長為300～400 nm條件下，進(jìn)行熒光檢測。室溫條件下，固定Δλ=15 nm和60 nm進(jìn)行樣品的同步熒光掃描。

熒光淬滅是一種降低熒光分子量子產(chǎn)率的方法，主要分為靜態(tài)淬滅、動態(tài)淬滅及靜態(tài)和動態(tài)淬滅兩者共存三種類型[4]。淬滅類型可通過Stern-Volmer來判斷[5]，見式(1)：

(1)

式(1)中，F(xiàn)、F0為有、無淬滅劑時，酪蛋白的熒光強(qiáng)度；Ksv為Stern-Volmer淬滅常數(shù)，L·mol-1；[Q]、Cq為淬滅劑濃度，μmol/L；Kq為雙分子淬滅常數(shù)，L·(mol·s)-1；τ0為無淬滅劑時生物分子的壽命，一般約為10-8s。

對于靜態(tài)淬滅，結(jié)合常數(shù)Ks和結(jié)合位點(diǎn)n可以通過雙倒數(shù)Stern-Volmer方程計(jì)算[6]，見式(2)：

(2)

1.3.3紫外-可見光譜測定

用10 mmol/L PBS (pH值7.4)將1.5×10-4mol/L酪蛋白儲備液稀釋成1.5×10-5mol/L的蛋白質(zhì)溶液，取1 mL蛋白質(zhì)溶液于10 mL的比色管中，再加入不同體積的蘆丁和阿魏酸溶液，定容至10 mL，使體系中酪蛋白終濃度為1.5×10-6mol/L，蘆丁和阿魏酸終濃度為0、6×10-6、1.2×10-5、1.8×10-5、2.4×10-5、3.0×10-5mol/L，漩渦震蕩，室溫靜置反應(yīng)1 h。于250～450 nm處測定溶液的紫外吸收光譜。

1.3.4紅外光譜測定

將凍干后的酪蛋白、蘆丁- 酪蛋白及阿魏酸- 酪蛋白復(fù)合物分別與KBr混合后，在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜的測定。

1.3.5圓二色譜測定

分別移取300 μL的酪蛋白、蘆丁- 酪蛋白及阿魏酸- 酪蛋白溶液于光程為1 mm的比色皿中，在波長為190～260 nm，持續(xù)通氮?dú)獾臈l件下，進(jìn)行樣品的圓二圖譜掃描。

1.3.6抗氧化活性測定

參考齊國雨等[7]方法 。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8.0、CDNN和Prodata軟件處理數(shù)據(jù)，SPSS V20.0軟件進(jìn)行單因素差異性及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜分析

2.1.1內(nèi)源熒光淬滅分析

蛋白質(zhì)能產(chǎn)生內(nèi)源熒光的原因主要是蛋白質(zhì)中的色氨酸、酪氨酸及苯丙氨酸所含有的共軛雙鍵或苯環(huán)結(jié)構(gòu)可在特定的激發(fā)波長下產(chǎn)生熒光[8]。圖1反映了蘆丁和阿魏酸對酪蛋白內(nèi)源熒光淬滅的影響，在激發(fā)波長為280 nm條件下，酪蛋白的最大發(fā)射波長為338 nm，蘆丁和阿魏酸溶液均不產(chǎn)生熒光，因此本研究中不考慮“內(nèi)濾光效應(yīng)”的干擾。

圖1 蘆丁、阿魏酸對酪蛋白內(nèi)源熒光淬滅的影響Fig.1 Effects of rutin and ferulic acid on intrinsic fluorescence quenching of casein

由圖1可知，加入蘆丁和阿魏酸會使酪蛋白的內(nèi)源熒光發(fā)生淬滅現(xiàn)象。隨著蘆丁和阿魏酸濃度的增加，酪蛋白的熒光強(qiáng)度不斷被淬滅，且酪蛋白位于338 nm的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生了明顯的移位現(xiàn)象。添加不同濃度的蘆丁使酪蛋白的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生了藍(lán)移現(xiàn)象，由338 nm處藍(lán)移至332 nm處，說明酪蛋白中色氨酸殘基附近結(jié)合腔的極性降低，表面疏水性增強(qiáng)，親水性降低，蛋白質(zhì)分子聚集。而添加不同濃度的阿魏酸使酪蛋白的最大熒光發(fā)射波長發(fā)生了紅移現(xiàn)象，由338 nm紅移至348 nm處，表明酪蛋白中酪氨酸和色氨酸殘基附近的微環(huán)境發(fā)生了變化，疏水性降低，親水性增加，肽鏈結(jié)構(gòu)伸展，而這些均與酪蛋白的空間構(gòu)象變化密切相關(guān)[9]。由激發(fā)波長280 nm的數(shù)據(jù)可知，蘆丁和阿魏酸對酪蛋白內(nèi)源熒光的淬滅率分別為83.25%和67.73%，同濃度的蘆丁和阿魏酸對酪蛋白的淬滅速率不同，這可能與反應(yīng)的進(jìn)程有關(guān)，蘆丁與酪蛋白的反應(yīng)程度明顯高于阿魏酸和酪蛋白的反應(yīng)程度[10]。

2.1.2熒光淬滅機(jī)制分析

圖2為溫度303 K和314 K時，蘆丁和阿魏酸與酪蛋白相互作用的Stern-Volmer曲線。根據(jù)Stern-Volmer方程的斜率計(jì)算對應(yīng)溫度下的Ksv和Kq，結(jié)果如表1。對于動態(tài)淬滅，隨著溫度升高，淬滅常數(shù)也隨之增大，即Stern-Volmer曲線方程的斜率增大，靜態(tài)淬滅則與之相反[11]。由圖2和表1可知，蘆丁和阿魏酸淬滅酪蛋白的曲線斜率隨溫度的升高而下降，且蘆丁和阿魏酸淬滅酪蛋白的Kq均大于最大動態(tài)淬滅常數(shù)，表明蘆丁和阿魏酸淬滅酪蛋白的方式為靜態(tài)淬滅，且蘆丁、阿魏酸與酪蛋白形成了新的復(fù)合物[12]。根據(jù)Stern-Volmer方程獲得的靜態(tài)淬滅常數(shù)在一定程度上可用來表征靜態(tài)淬滅的相對強(qiáng)弱，由表1可知蘆丁對酪蛋白的淬滅作用大于阿魏酸，導(dǎo)致該結(jié)果的原因可能與它們的結(jié)構(gòu)不同有關(guān)，需要進(jìn)一步探討。

圖2 蘆丁、阿魏酸淬滅酪蛋白的Stern-Volmer曲線Fig.2 Stern-Volmer curves of casein quenching by rutin and ferulic acid

表1 蘆丁、阿魏酸與酪蛋白的Stern-Volmer曲線的相關(guān)參數(shù)

結(jié)合常數(shù)Ks為通過lg(F0-F)/F對lgQ作圖得到的截距(如圖3)，計(jì)算結(jié)果如表2。

由表2可知，蘆丁及阿魏酸與酪蛋白在303 K和314 K下的結(jié)合位點(diǎn)約為1，表明在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)蘆丁和阿魏酸與酪蛋白至少有一個單獨(dú)的結(jié)合位點(diǎn)，可能形成了1∶1的復(fù)合物。且蘆丁和阿魏酸與酪蛋白的結(jié)合常數(shù)的數(shù)量級均大于等于104，說明蘆丁和阿魏酸對酪蛋白有較強(qiáng)的結(jié)合能力，有助于蘆丁和阿魏酸等酚酸類物質(zhì)對酪蛋白的靶向性及定位，降低酪蛋白的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，會減少其附著于胃腸黏膜的概率，同時也能提高酚酸類物質(zhì)的壽命，使其不易被氧化，有助于將其運(yùn)送至機(jī)體內(nèi)后釋放，提高酚酸類物質(zhì)的生物利用度[13]。

圖3 蘆丁、阿魏酸淬滅酪蛋白的雙對數(shù)曲線Fig.3 Double logarithmic curves of casein quenching by rutin and ferulic acid

表2 蘆丁、阿魏酸與酪蛋白的雙對數(shù)曲線的相關(guān)參數(shù)

2.1.3熱力學(xué)參數(shù)和作用力分析

生物大分子與小分子配體間相互作用的驅(qū)動力，可以根據(jù)熱力學(xué)參數(shù)熵變值ΔS和焓變值ΔH來進(jìn)行表征[14]：(1)若ΔS>0且ΔH>0，則為疏水作用；(2)若ΔS>0且ΔH<0，則為氫鍵和疏水作用；(3)若ΔS<0且ΔH>0，則為靜電引力；(4)若ΔS<0且ΔH<0，則為氫鍵和范德華力。蘆丁和阿魏酸與酪蛋白反應(yīng)的ΔG<0，表明蘆丁和阿魏酸與酪蛋白的反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的，見表3。蘆丁與酪蛋白反應(yīng)的ΔH>0，而阿魏酸與酪蛋白反應(yīng)的ΔH<0，說明酪蛋白與蘆丁的結(jié)合為吸熱反應(yīng)，而與阿魏酸的結(jié)合為放熱反應(yīng)；升溫有利于酪蛋白與蘆丁反應(yīng)的進(jìn)行，卻不利于酪蛋白與阿魏酸反應(yīng)的進(jìn)行；這和酪蛋白與蘆丁作用的Ksv隨溫度升高而增大及與阿魏酸作用的Ksv隨溫度升高而減小是一致的。由蘆丁與酪蛋白反應(yīng)的ΔH>0和ΔS>0可知，蘆丁與酪蛋白間的作用力為疏水作用；阿魏酸與酪蛋白反應(yīng)的ΔH<0和ΔS>0，表明阿魏酸與酪蛋白間的作用力為氫鍵和疏水作用。而ΔS>0是因?yàn)樘J丁和阿魏酸與酪蛋白在溶劑中反應(yīng)時，它們的親水性部分極易被溶劑中的水分子包圍，形成水合狀態(tài)，進(jìn)一步反應(yīng)時，其表面的非極性基團(tuán)將處于非極性區(qū)域的水分子排開，進(jìn)而使被排開的水分子與羥基等親水性基團(tuán)的水合作用增強(qiáng)，最終導(dǎo)致體系的運(yùn)動狀態(tài)由有序性逐漸趨于相對無序性[15]。

表3 蘆丁、阿魏酸與酪蛋白相互作用的熱力學(xué)參數(shù)

2.2 紫外- 可見光譜分析

酪蛋白在278 nm處具有最大吸收峰(如圖4)，這可能是由于酪蛋白分子中的芳香族氨基酸所含有的共軛雙鍵具有吸收峰。添加蘆丁和阿魏酸會使酪蛋白最大吸收峰的峰高和峰位置發(fā)生明顯的變化，這說明蘆丁和阿魏酸與酪蛋白發(fā)生了相互作用。隨著蘆丁和阿魏酸濃度的增加，酪蛋白最大吸收峰的峰值有規(guī)律的增加。蘆丁的加入使酪蛋白的最大吸收峰所處的波長由278 nm藍(lán)移至276.2 nm，表明蘆丁與酪蛋白結(jié)合后誘導(dǎo)肽鏈伸展，使酪蛋白分子內(nèi)部色氨酸和酪氨酸殘基中的芳香雜環(huán)疏水性基團(tuán)暴露出來，進(jìn)而改變酪蛋白的構(gòu)象，有利于酪蛋白中色氨酸和酪氨酸殘基中芳香雜環(huán)的π-π*躍遷[16]；而阿魏酸的加入則使酪蛋白的最大吸收峰所處的波長由278 nm紅移至283 nm，表明阿魏酸的加入可能會使酪蛋白中芳香族氨基酸殘基所處的微環(huán)境發(fā)生改變，最終引起酪蛋白的構(gòu)象改變[17]。此外，紫外吸收光譜法也可用來判斷小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)作用的淬滅類型：對于靜態(tài)淬滅，小分子物質(zhì)會使蛋白質(zhì)的紫外吸收光譜發(fā)生紅移或藍(lán)移現(xiàn)象；而動態(tài)淬滅，則通常不會造成紅移或藍(lán)移現(xiàn)象[18]。因此，蘆丁和阿魏酸與酪蛋白作用的紫外吸收光譜再次證明了它們之間相互作用的淬滅機(jī)制為靜態(tài)淬滅。

圖4 蘆丁、阿魏酸對酪蛋白紫外- 可見吸收光譜的影響Fig.4 Effects of rutin and ferulic acid on UV-absorption spectrum of casein

2.3 同步熒光分析

同步熒光光譜法可以通過展現(xiàn)小分子物質(zhì)對蛋白質(zhì)微環(huán)境的影響，反映小分子物質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用對蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變。Δλ=15 nm反映了發(fā)色基團(tuán)酪氨酸的熒光信息，Δλ=60 nm反映了發(fā)色基團(tuán)色氨酸的熒光信息[19]。圖5(a)和(b)分別為加入蘆丁和阿魏酸后，酪蛋白中酪氨酸的光譜信息，反映了其酪氨酸殘基附近的微環(huán)境變化情況；(c)和(d)為加入蘆丁和阿魏酸后，酪蛋白中色氨酸的光譜信息，反映了酪蛋白中色氨酸殘基附近的微環(huán)境變化情況。由圖5可知，隨著蘆丁和阿魏酸濃度的增加，酪蛋白中色氨酸和酪氨酸的熒光強(qiáng)度有規(guī)律的下降，表明蘆丁和阿魏酸與酪蛋白的結(jié)合對酪蛋白中色氨酸和酪氨酸這兩個發(fā)色基團(tuán)均產(chǎn)生了影響。蘆丁與酪蛋白結(jié)合后，色氨酸和酪氨酸的熒光強(qiáng)度分別下降了77.31%和85.34%，而阿魏酸與酪蛋白結(jié)合后，則色氨酸和酪氨酸的熒光強(qiáng)度分別下降了85.05%和69.64%，表明蘆丁對酪蛋白中酪氨酸殘基附近的微環(huán)境變化的影響大，而阿魏酸對酪蛋白中色氨酸殘基附近的微環(huán)境變化的影響大，這可能是阿魏酸和蘆丁的分子結(jié)構(gòu)不同造成的。

2.4 紅外光譜分析

圖5 蘆丁、阿魏酸與酪蛋白相互作用的同步熒光光譜Fig.5 Synchronous fluorescence spectra of casein interacted with rutin and ferulic acid

圖6 蘆丁、阿魏酸與酪蛋白相互作用的紅外光譜Fig.6 Fourier transform infrared spectra of casein interacted with rutin and ferulic acid

紅外吸收光譜可進(jìn)一步研究蛋白質(zhì)構(gòu)象的變化，吸收光譜中的酰胺Ⅰ帶及酰胺Ⅱ帶和多肽鏈、碳骨架中的C-N伸縮振動的峰移位，可以證明多酚類物質(zhì)與蛋白質(zhì)發(fā)生了相互作用[20]。圖6為蘆丁和阿魏酸與酪蛋白相互作用的傅里葉紅外光譜。由圖6可知，加入蘆丁和阿魏酸后，酪蛋白紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶由1 673.19 cm-1分別藍(lán)移至1 658.46 cm-1和1 661.97 cm-1，酰胺Ⅱ帶略有紅移現(xiàn)象，表明蘆丁和阿魏酸引起了酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)改變。蘆丁上的某些氧原子和羥基基團(tuán)與酪蛋白的羰基及碳氮基團(tuán)通過疏水作用結(jié)合形成穩(wěn)定復(fù)合物；而阿魏酸則通過氫鍵和疏水作用與酪蛋白形成穩(wěn)定復(fù)合物，引起酪蛋白肽鏈重排，并最終導(dǎo)致其二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[21]。這也可以通過吸收譜中酰胺A帶(3 300～3 400 cm-1)的改變來輔證。加入蘆丁和阿魏酸后，酪蛋白的酰胺A帶由3 304.41 cm-1分別紅移至3 313.97 cm-1、3 314.43 cm-1。He等[22]發(fā)現(xiàn)β-乳球蛋白與錦葵素-3-O-葡萄糖苷相互作用后，其紅外光譜中的酰胺Ⅰ帶發(fā)生紅移，酰胺Ⅱ帶略有藍(lán)移。而劉勤勤等[23]研究茶多酚與大豆蛋白作用，發(fā)現(xiàn)大豆蛋白的酰胺Ⅰ帶和Ⅱ帶均發(fā)生藍(lán)移現(xiàn)象。上述研究結(jié)果均與本研究結(jié)果不一致，這可能是由于酚酸與蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及種類不同造成的。

2.5 圓二色譜分析

通過Prodata和CDNN軟件處理圓二圖譜并計(jì)算酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化，結(jié)果如表4。 由表4可知，加入蘆丁和阿魏酸后，酪蛋白中的α-螺旋含量由12.9%分別上升至16.7%和16.0%，β-轉(zhuǎn)角含量由32.7%分別減少至26.5%和26.0%，無規(guī)卷曲、平行和反平行的含量均略有變化，這說明蘆丁和阿魏酸與酪蛋白發(fā)生了相互作用，且在其相互作用的過程中蘆丁和阿魏酸能夠穩(wěn)定酪蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)，同時可使酪蛋白變得略微疏松(即無規(guī)卷曲由33.5%分別上升至35.5%和36.5%)。Kanakis等[24]研究兒茶素與β-乳球蛋白相互作用，結(jié)果表明加入兒茶素后，β-乳球蛋白中的α-螺旋、平行及反平行折疊含量增加，無規(guī)卷曲含量降低，β-乳球蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，這與本研究結(jié)果是一致的。

表4 酪蛋白與蘆丁、阿魏酸復(fù)合物二級結(jié)構(gòu)組成

2.6 抗氧化活性分析

酪蛋白、蘆丁、蘆丁- 酪蛋白、阿魏酸和阿魏酸- 酪蛋白的DPPH自由基清除率分別為19.29%、56.49%、57.17%、42.26%和44.67%，見圖7。圖7可以看出，蘆丁、阿魏酸與酪蛋白結(jié)合后，其自由基清除率均略微增加(P>0.05)，但是小于酪蛋白分別與蘆丁及阿魏酸的理論值之和，這可能與蘆丁和阿魏酸結(jié)構(gòu)中的酚羥基能夠與酪蛋白形成氫鍵有關(guān)。蘆丁和阿魏酸中的酚羥基是使蘆丁和阿魏酸具有抗氧化作用的重要基團(tuán),其中，蘆丁的抗氧化作用主要源自其A環(huán)上的5-OH和7-OH及B環(huán)上的3′-OH和4′-OH；而阿魏酸的抗氧化作用則源自其苯環(huán)上的4-OH[25]。因此，蘆丁和阿魏酸中的酚羥基因形成氫鍵，導(dǎo)致酚羥基基團(tuán)被屏蔽，從而引起蘆丁和阿魏酸對自由基清除率的下降。

不同小寫字母表示差異顯著(P圖7 酪蛋白對蘆丁和阿魏酸抗氧化活性的影響Fig.7 Effects of casein on antioxidant activity of rutin and ferulic acid

3 結(jié) 論

蘆丁和阿魏酸對酪蛋白的淬滅機(jī)制均為靜態(tài)淬滅，蘆丁與酪蛋白間通過疏水作用形成復(fù)合物，而阿魏酸與酪蛋白間則通過疏水作用和氫鍵形成復(fù)合物。紫外和同步熒光光譜表明蘆丁與酪蛋白的結(jié)合位點(diǎn)更接近于酪氨酸，而阿魏酸與酪蛋白的結(jié)合位點(diǎn)則更接近于色氨酸。傅里葉紅外光譜和圓二色譜表明蘆丁和阿魏酸的加入會改變酪蛋白二級結(jié)構(gòu)?？寡趸钚越Y(jié)果表明蘆丁和阿魏酸與酪蛋白間存在抗氧化活性屏蔽現(xiàn)象。此結(jié)果對于推測乳制品中酚酸類物質(zhì)在食品加工、貯存及消化吸收過程中通過與酪蛋白作用來保護(hù)抗氧化基團(tuán)的機(jī)理具有一定的指導(dǎo)意義。