液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中9種甜味劑

童蘭艷，代政華，肖昭競(jìng)，張麗妮，鄒 孝，余文琴

(重慶市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院重慶市食品安全工程技術(shù)研究中心/國(guó)家農(nóng)副加工及調(diào)味品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心， 重慶 401123)

高甜味、低熱量的甜味劑被廣泛應(yīng)用于食品中，且大部分甜味劑主要通過(guò)人工合成獲取，如阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精鈉、甜蜜素、安賽蜜、阿力甜、紐甜等[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)人造甜味劑的長(zhǎng)期大量攝入可能會(huì)導(dǎo)致高血糖、葡萄糖耐受不良、肥胖等代謝系統(tǒng)性疾病，易怒、抑郁、記憶衰退、阿爾茲海默癥等神經(jīng)系統(tǒng)異常[2-4]，甚至具有遺傳毒性和致癌性[5-7]。

世界各國(guó)對(duì)甜味劑的使用情況規(guī)定不同，如甜蜜素在美國(guó)屬于禁用食品添加劑，但歐盟和中國(guó)允許使用。愛(ài)德萬(wàn)甜為新型甜味劑，2017年10月20日, 國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委發(fā)布第8號(hào)公告《關(guān)于愛(ài)德萬(wàn)甜等6種食品添加劑新品種、食品添加劑環(huán)己基氨基磺酸鈉 (又名甜蜜素) 等6種食品添加劑擴(kuò)大用量和使用范圍的公告》正式批準(zhǔn)愛(ài)德萬(wàn)甜作為食品添加劑。目前常用的食品中甜味劑的檢測(cè)方法是液相色譜法[8-9]和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[10-12]。液相色譜法檢測(cè)存在靈敏度、分別率不夠高、多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)分離效果不夠好等問(wèn)題，液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是同時(shí)測(cè)定多種甜味劑的較佳選擇[13]。安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷、愛(ài)德萬(wàn)甜和紐甜在食品中的使用限量見(jiàn)表1，這9種甜味劑在食品中被同時(shí)檢測(cè)的報(bào)道較少[14-15]。

本研究建立了采用高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中9種甜味劑(安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷、愛(ài)德萬(wàn)甜和紐甜)的快速測(cè)定方法，在滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品中9種甜味劑檢測(cè)要求前提下，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法相比，本方法操作簡(jiǎn)單、快速、高效，提高了樣品的檢測(cè)分析效率。另外，用本方法對(duì)5種市售食品(酒、雪糕、果凍、酸奶和糖果)中的甜味劑進(jìn)行了快速檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)部分市售食品存在違規(guī)添加和濫用甜味劑的現(xiàn)象，相關(guān)部門(mén)需要對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行關(guān)注。

表1 9種甜味劑的甜度及限量[6-7]

每日允許攝入量為聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專家委員會(huì)評(píng)估而定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Quintix 224- 1CN型電子天平，德國(guó)Sartorius公司；安捷倫1290型液相色譜- 三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)AB公司；SB- 1500DT型超聲儀，中國(guó)寧波新芝生物科技股份有限公司； VORTEX3型圓周振蕩器，德國(guó)IKA公司。

乙腈，色譜純，美國(guó)Tedia公司；甲酸、乙酸銨，色譜純，中國(guó)成都市科隆化學(xué)品有限公司；安賽蜜純度≥99.5%，甜蜜素純度≥99.9%，阿斯巴甜純度≥99.2%，三氯蔗糖純度≥99.7%，愛(ài)德萬(wàn)甜純度≥99.0%，紐甜純度≥99.0%，德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；糖精鈉1 000 mg/L，中國(guó)計(jì)量院；阿力甜純度≥99%，甜菊糖苷純度≥99%，加拿大TRC公司。

酒、雪糕、果凍、酸奶和糖果均為市售。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

分別取安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、三氯蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用超純水溶解并定容，得到密度1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；取量甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用甲醇溶解并定容，得到密度1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別稱取愛(ài)德萬(wàn)甜、紐甜標(biāo)準(zhǔn)品于容量瓶中，用V(甲醇)∶V(水)=1∶1溶解并定容，得到密度1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

1.2.2標(biāo)準(zhǔn)工作溶液

分別移取安賽蜜、甜蜜素、阿力甜、愛(ài)德萬(wàn)甜和紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液0.10 mL于10 mL容量瓶，用超純水定容，制成10 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取糖精鈉、三氯蔗糖、阿斯巴甜和甜菊糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL于10 mL容量瓶中，用超純水定容，制成20 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。取適量的2種混合標(biāo)準(zhǔn)溶液配制安賽蜜、甜蜜素、阿力甜、愛(ài)德萬(wàn)甜和紐甜密度為0.010、0.020、0.050、0.100、0.200、0.500、0.800、1.000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，糖精鈉、三氯蔗糖、阿斯巴甜和甜菊糖苷密度為0.020、0.040、0.100、0.200、0.400、1.000、1.600、2.000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3 樣品處理

1.3.1白酒樣品

白酒，取樣品1 g(精確至0.000 1 g)用水浴鍋加熱除盡乙醇，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度，混勻，過(guò)0.22 μm濾膜后供HPLC- MS/MS分析。

1.3.2雪糕、果凍、酸奶、糖果樣品

準(zhǔn)確稱取1 g(精確至0.000 1 g)至15 mL離心管中，加10 mLV(甲醇)∶V(水)=1∶1溶液渦旋混勻，超聲30 min后，10 000 r/min離心10 min，取上清液過(guò)0.22 μm濾膜后供HPLC- MS/MS分析。

1.4 儀器條件

1.4.1HPLC條件

色譜柱為：AQ- C18(100 mm×2.1 mm×3 μm)，柱溫為35 ℃，進(jìn)樣量5 μL，流動(dòng)相A為c(乙酸銨)20 mmol/L的水溶液，流動(dòng)相B為φ(甲酸)0.1%的乙腈溶液，流速0.35 mL/min。洗脫梯度程序見(jiàn)表2。

表2 洗脫程序

1.4.2質(zhì)譜條件

電噴霧離子源；離子源溫度：500 ℃；電噴霧電壓：-4 500 V；檢測(cè)模式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)；霧化器壓力：50psi(344.74 kPa)；氣簾氣壓力：25 psi(172.37 kPa)；輔助氣壓力：50 psi(344.74 kPa)；碰撞氣：6 mL/min。9種甜味劑的質(zhì)譜檢測(cè)條件見(jiàn)表3。

表3 9種甜味劑質(zhì)譜檢測(cè)條件

2 結(jié)果與討論

2.1 分析條件優(yōu)化

在條件優(yōu)化過(guò)程中選用AQ- C18(100 mm×2.1 mm×3 μm)色譜柱對(duì)9種甜味劑進(jìn)行分離。考察了φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸銨)0.005 mol/L的水溶液、φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸銨)10 mmol/L的水溶液和φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸銨)20 mmol/L的水溶液流動(dòng)相體系，發(fā)現(xiàn)φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸銨)20 mmol/L的水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，9種甜味劑的峰形對(duì)稱且尖銳，且目標(biāo)化合物的響應(yīng)值較高，最終選用φ(甲酸)0.1%的乙腈-c(乙酸銨)0.02 mol/L的水溶液作為流動(dòng)相。以適量濃度甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，通過(guò)對(duì)離子源模式、碰撞能量等條件進(jìn)行優(yōu)化，確定目標(biāo)物質(zhì)的離子對(duì)，結(jié)果見(jiàn)表3。9種標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖見(jiàn)圖1。

1.安賽蜜，2.糖精鈉，3.甜蜜素，4.阿斯巴甜，5.三氯蔗糖，6.阿力甜，7.甜菊糖苷，8.愛(ài)德萬(wàn)甜，9.紐甜。圖1 9種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)溶液總離子流圖Fig.1 Total ions chromatogram of 9 sweeteners

2.2 線性關(guān)系和方法檢出限

在優(yōu)化條件下測(cè)試不同濃度的9種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以信噪比S/N≥3和S/N≥10計(jì)算出9種甜味劑的方法檢出限和定量限，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，9種甜味劑的檢出限為0.020～0.055 mg/kg，定量限為0.06～0.15 mg/kg。

2.3 食品中9種甜味劑的測(cè)定

對(duì)重慶市售的白酒、雪糕、果凍、酸奶和糖果各6個(gè)樣品進(jìn)行了前處理，結(jié)果表明樣品中均未檢出愛(ài)德萬(wàn)甜，說(shuō)明目前愛(ài)德萬(wàn)甜還未在食品中廣泛應(yīng)用。但是在檢測(cè)樣品中有一個(gè)白酒樣品的甜蜜素超標(biāo)，含量為0.72 mg/kg、一個(gè)白酒樣品的三氯蔗糖超標(biāo)，含量為1.04 mg/kg；一個(gè)白酒樣品的安賽蜜，含量為38.2 mg/kg，在GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定蒸餾酒中不允許添加任何甜味劑；一個(gè)酸奶樣品檢出安賽蜜，含量為4.30 g/kg，超過(guò)GB 2760—2014中限量0.35 g/kg；一個(gè)果凍樣品中檢出阿力甜0.37 g/kg，超過(guò)GB 2760—2014中限量為0.1 g/kg，以上有說(shuō)明食品市場(chǎng)存在違規(guī)添加和濫用甜味劑的現(xiàn)象，相關(guān)部門(mén)需要對(duì)相關(guān)現(xiàn)象進(jìn)行關(guān)注。

表4 9種甜味劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

表5 食品中9種甜味劑的回收率

n=6。

2.4 回收率和精密度測(cè)定

分別稱取白酒、雪糕、果凍、酸奶和糖果陰性樣品，每種樣品中添加低、中、高3個(gè)濃度水平的甜味劑，每個(gè)水平下進(jìn)行6次平行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表5。結(jié)果表明，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、紐甜、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷和愛(ài)德萬(wàn)甜在酒、雪糕、果凍、酸奶和糖果中加標(biāo)回收率為90.6%～111.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于為6.0%。

3 結(jié) 論

本研究建立高效液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定食品中9種甜味劑(安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、三氯蔗糖、阿力甜、甜菊糖苷、愛(ài)德萬(wàn)甜和紐甜)的快速測(cè)定方法，應(yīng)用本方法對(duì)食品中9種甜味劑進(jìn)行檢測(cè)，整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單、快速、高效，在滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)對(duì)食品(白酒、飲料、果凍、酸奶、糖果)中9種甜味劑檢測(cè)要求前提下，與國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法相比，大大提高了樣品的檢測(cè)分析效率。應(yīng)用本方法對(duì)5種食品中9種甜味劑進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)食品市場(chǎng)存在違規(guī)添加和濫用甜味劑的現(xiàn)象，相關(guān)部門(mén)需要對(duì)相關(guān)現(xiàn)象進(jìn)行關(guān)注。實(shí)驗(yàn)證實(shí)建立食品中甜味劑的痕量檢測(cè)提供了可靠而準(zhǔn)確的技術(shù)手段，對(duì)規(guī)范食品添加劑在食品中的使用行為具有重要意義，同時(shí)為食品安全監(jiān)管、高效檢測(cè)指明高效率、高通量發(fā)展方向。