瑞-姬氏復(fù)合染色法診斷肺孢子菌肺炎2例

姜美娟，梁 冰，王華強，王丹丹，劉金鳳

肺孢子菌是單細胞生物，是一種機會致病性病原體。以往曾被稱為卡氏肺囊蟲，現(xiàn)根據(jù)其超微結(jié)構(gòu)和核糖體RNA種系發(fā)育分析，將其歸屬為真菌類。2001年機會性原生生物國際研討會將感染人的肺孢子菌正式命名為伊氏肺孢子菌，以下簡稱肺孢子菌。肺孢子菌廣泛存在于自然界，長期寄生于人和其他哺乳動物的肺組織內(nèi)。在健康的宿主體內(nèi)，本菌多呈隱匿狀態(tài)，宿主多數(shù)為無癥狀隱性感染，無任何臨床癥狀。當(dāng)宿主免疫功能低下時，如長期使用免疫抑制劑、器官移植、腫瘤治療、艾滋病等，潛伏的菌體在肺內(nèi)大量繁殖擴散，使肺泡上皮細胞受損，導(dǎo)致間質(zhì)性漿細胞性肺炎，亦稱肺孢子菌肺炎（pneumocystis pneumonia，PCP）。肺孢子菌肺炎治療時機的把握至關(guān)重要，早發(fā)現(xiàn)、早治療，70%～77%患者可治愈。有報道，未及時治療者病死率高達100%［1］。筆者于2013年分別通過瑞-姬染液復(fù)合染色法明確診斷2例肺孢子菌肺炎?，F(xiàn)結(jié)合文獻報告如下。

1 臨床資料

病例1：患者，男，49歲。因“腎移植術(shù)后3個月、咳嗽1.5個月、發(fā)熱3周”于2013-03-17入院。患者3個月前因“慢性腎衰（尿毒癥期）”于筆者所在醫(yī)院行“同種異體腎移植術(shù)”。術(shù)后服用三聯(lián)免疫抑制劑治療，尿量在1800 ml/d左右，血肌酐在130μmol/L。入院前1.5個月無明顯誘因出現(xiàn)咳嗽癥狀，干咳，無咳痰、咯血及發(fā)熱，咳嗽癥狀漸加重，雙肺CT檢查提示雙肺少量炎癥，住院行抗炎對癥治療2周，咳嗽癥狀好轉(zhuǎn)出院，3周前無明顯誘因出現(xiàn)發(fā)熱，體溫最高38.5℃，復(fù)查雙肺CT提示肺部感染加重，查血培養(yǎng)、痰培養(yǎng)等未見異常，給予靜脈滴注頭孢曲松鈉、利奈唑胺、血必凈及美平抗感染治療；林可宏0.25 g，1次/d抗病毒治療；復(fù)方新諾明治療1周，復(fù)查CT檢測仍漸進性加重，于2013-03-25下午在CT定位下行左肺占位穿刺活檢術(shù)，檢驗科協(xié)助床旁取穿刺物標(biāo)本涂片，經(jīng)瑞-姬染液復(fù)合染色法鏡檢查到肺孢子菌，提示肺孢子菌感染，予以復(fù)方新諾明、米卡芬凈聯(lián)合治療，效果可，患者病情趨于穩(wěn)定。

病例 2：患者，女，26歲。因“干咳、反復(fù)低熱、陣發(fā)性呼吸困難”于2013-04-03入院?；颊呒韧邢到y(tǒng)性紅斑狼瘡、狼瘡性腎炎病史，表現(xiàn)為多系統(tǒng)受累，腎臟表現(xiàn)為慢性腎功能不全，以蛋白尿、紅斑為首發(fā)及主要表現(xiàn)，伴抗核抗體陽性、尿蛋白2＋、抗Sm抗體陽性。已行血液透析治療4個月?；颊呷朐呵?2 d無明顯誘因出現(xiàn)干咳、反復(fù)發(fā)熱，無痰，無畏寒，發(fā)熱與透析無明顯相關(guān)，無咽痛、流涕，伴陣發(fā)性呼吸困難，發(fā)熱及呼吸困難多可自行緩解。CT提示雙肺間質(zhì)性改變伴感染性可能性，行經(jīng)驗性應(yīng)用頭孢哌酮鈉/他唑巴坦鈉2 g，2次/d抗感染治療，肺間質(zhì)病變無明顯好轉(zhuǎn)。2013-04-11行肺泡灌洗，灌洗液同樣經(jīng)瑞-姬染液復(fù)合染色法染色后查見肺孢子菌，明確診斷為“肺孢子菌肺炎”首日給予復(fù)方新諾明 1.44 g，4 次/d，后續(xù) 1.44 g，3 次/d，并減量免疫抑制劑等治療，但患者仍反復(fù)發(fā)熱、惡心、嘔吐，2013-04-16復(fù)查胸部CT明顯加重，停用嗎替麥考酚酯膠囊，繼續(xù)復(fù)方新諾明1.44 g，3次/d，加用卡泊芬凈70 mg首日、后續(xù)50 mg，1次/d治療，并行甲潑尼龍80 mg，靜脈滴注2次/d及免疫球蛋白10 g靜脈滴注，1次/d治療，患者體溫恢復(fù)正常。

2 結(jié)果

兩例均為免疫低下患者，臨床均表現(xiàn)為干咳、發(fā)熱，隨著病情發(fā)展出現(xiàn)進行性呼吸困難，查體發(fā)病初期無特異性體征改變，后期雙肺可聞及濕性啰音。 實驗室檢查血常規(guī)中白細胞計數(shù)基本正?；蚵愿撸獨夥治霾±?有明顯低氧血癥，4月4日動脈血氧分壓32 mmHg，病例2于病程早期即明確診斷，4月14日動脈血氧分壓72 mmHg。胸部CT基本表現(xiàn)為兩肺廣泛滲出，多發(fā)斑片狀磨玻璃密度增高影。影像學(xué)檢查有時與其他真菌、巨細胞病毒等感染難以鑒別［2］，值得注意。

此2例患者都是通過瑞-姬染液復(fù)合染色法分別于肺活檢組織及肺泡灌洗液中找到了肺孢子菌包囊，從而給臨床提供了明確診斷依據(jù)。見圖1、2。

病例2于4月17日查血清1，3-β-D葡聚糖水平<10 pg/mL，5月12日、5月27日及6月25日檢查血清1，3-β-D葡聚糖水平均>1000 pg/ml。

甲氧芐氨嘧啶一磺胺甲惡唑（TMP-SMZ）是目前治療PCP的首選藥物，也可作為足療程結(jié)束后的維持治療和預(yù)防復(fù)發(fā)用藥。此外兩例患者均聯(lián)合應(yīng)用了棘白菌素類抗真菌藥物。

下圖1、2：姜美娟，梁 冰，王華強，等.瑞-姬氏復(fù)合染色法診斷肺孢子菌肺炎2例（正文348～350頁）

圖1 病例1肺組織印片

圖2 病例2肺泡灌洗液

3 討論

目前，臨床上確診肺孢子菌肺炎仍以檢測其病原體，即肺孢子菌包囊或滋養(yǎng)體為依據(jù)，而標(biāo)本的采集和染色方法的選擇決定其檢出率。

3.1 標(biāo)本采集 標(biāo)本采集常用方法有：（1）超聲霧化導(dǎo)痰?？捎?%高滲鹽水霧化后誘導(dǎo)咳痰，適用于危重癥及有傳染性疾病患者。痰液是檢測肺孢子菌最易獲得的標(biāo)本，而且沒有損傷，但由于滋養(yǎng)體表面的特殊結(jié)構(gòu)使菌體固著于肺泡壁，不易隨痰咳出，因此痰液檢出率較低。（2）纖維支氣管鏡檢查。主要是支氣管肺泡灌洗（BAL），其陽性率比較高，宜盡早實施。研究顯示感染早期支氣管肺泡灌洗的陽性率較高，病程中后期肺孢子菌的檢出率明顯降低，總檢出率不足70%，因此早期支氣管鏡檢為首選診療手段［3］。（3）經(jīng)皮肺穿刺活檢術(shù)。要求患者身體耐受性較好，主要用于病理學(xué)標(biāo)本取材。在病原體檢測方面因肺組織活檢術(shù)檢出率最高，可建議臨床同時多項目申請，必要時檢查人員陪同術(shù)中床旁采集。

3.2 染色方法選擇 筆者采用的瑞-姬氏染液由A液和B液組成，A液主要成分為瑞氏染料和姬姆薩染料，B液為磷酸鹽緩沖液。染色步驟先滴加A液，使其覆蓋整個標(biāo)本，約1~2 min后再滴加等量B液，用洗耳球輕輕吹打混勻，靜置3～5 min，用流水從玻片一端輕輕沖洗多余染料，自然干燥后油鏡觀察。

采用瑞-姬染液復(fù)合染色法染色后肺孢子菌的包囊呈圓形或橢圓形，囊壁薄，呈淡藍色，內(nèi)含4~8個囊內(nèi)小體 ，囊內(nèi)小體呈塊狀或新月形，具有紫紅色的細胞核和藍色的細胞質(zhì)，各部分結(jié)構(gòu)色彩鮮明，易于觀察分辨；肺孢子菌的滋養(yǎng)體形狀不規(guī)則，散在分布或聚集成群 ，滋養(yǎng)體的細胞核被染成紫紅色，細胞質(zhì)被染成藍色。

傳統(tǒng)的肺孢子菌標(biāo)本染色方法有姬氏染色法、六亞甲基四胺銀染色法、甲苯胺藍染色法等。但上述方法或操作復(fù)雜、或費時過長、或背景不清晰對比不強、或不能顯示囊內(nèi)小體。近年也報道過改良的快速銀染色［4］，但此法要求條件較高，不易操作。瑞-姬染液復(fù)合染液中酸性染料曙紅和堿性染料亞甲藍對菌體內(nèi)不同的成分親和力不一樣，因此染色效果較好，各部分結(jié)構(gòu)清晰、對比鮮明，囊內(nèi)小體及滋養(yǎng)體均易識別。標(biāo)本易于觀察，值得在PCP的診斷中推廣應(yīng)用。

3.3 其他輔助檢查 血清1，3-β-D葡聚糖 （G試驗）水平可用于輔助診斷肺孢子菌肺炎，靈敏度92%，特異性 86%［5］。 但由于 1，3-β-D 葡聚糖普遍存在于多數(shù)真菌細胞壁中，連續(xù)監(jiān)測結(jié)果均為陰性可排除診斷，因此具有較高的陰性預(yù)測價值。

此外，乳酸脫氫酶（LDH）對于肺孢子菌肺炎的早期診斷具有較高的靈敏度，尤其見于AIDS患者［6］。其升高主要為各種炎性因子的刺激導(dǎo)致組織細胞大量釋放入血所致，因此其他原因引起的肺損傷LDH也可升高，同樣使診斷缺乏特異性。

因此對于免疫低下人群發(fā)生肺部感染時，要考慮肺孢子菌肺炎的可能，盡可能早期反復(fù)多次采集下呼吸道標(biāo)本進行病原學(xué)檢測，實驗室人員在進行瑞-姬染液復(fù)合染液進行涂片檢查的同時，應(yīng)結(jié)合患者的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)特征以及其他實驗室檢查結(jié)果等多方面資料來綜合判斷。另外目前個別實驗室開展的免疫組化法［7］和 PCR 檢測技術(shù)［8］，由于敏感性和特異性較高，可以對傳統(tǒng)染色方法做很好的補充，多項技術(shù)聯(lián)合更有助于PCP的早期診斷。