參七蟲草膠囊干預(yù)肺間質(zhì)纖維化大鼠模型PI3K/Akt信號通路實驗研究

董 梅，張念志，陳 煒，紀(jì) 娟，倪 興

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科，安徽 合肥 230061)

參七蟲草膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科在總結(jié)多年臨床實踐經(jīng)驗基礎(chǔ)上研制的院內(nèi)制劑，治療肺部疾病(如肺纖維化、慢性阻塞性肺疾病)具有顯著臨床療效[1]。為進(jìn)一步探討參七蟲草膠囊治療肺間質(zhì)纖維化的作用靶點(diǎn)，筆者觀察了其對肺間質(zhì)纖維化模型大鼠外周血及肺組織中磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine protein kinase B，Akt)含量的影響，為臨床應(yīng)用參七蟲草膠囊治療肺間質(zhì)纖維化提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 參七蟲草膠囊由安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，藥物組成為西洋參、三七和冬蟲夏草。

1.2 實驗動物和分組 40只清潔級SD大鼠，由江蘇省常州卡文思實驗動物有限公司[動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-0010]提供，體質(zhì)量為(200±25)g，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。動物飼養(yǎng)室為清潔級，室溫控制在(24±2)℃。

1.3 實驗藥物和試劑 潑尼松(產(chǎn)品批號：1701021)：西安利君制藥有限責(zé)任公司；參七蟲草膠囊(產(chǎn)品批號：20170016)：安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑中心；博萊霉素注射液(產(chǎn)品批號：322C022)：北京索萊寶；大鼠Akt試劑盒(產(chǎn)品批號：Q23013186)、PI3K試劑盒(產(chǎn)品批號：Q25013187)：武漢華美生物工程有限公司。

1.4 主要儀器 TGL-16C臺式離心機(jī)：安徽嘉文；AJC-0501-P純水儀：上海力康；TL-420D水浴鍋：常州奧華；DNP-9056BS-Ⅲ電熱恒溫箱：上海三發(fā)；EPOCH酶標(biāo)儀：深圳雷杜；WH-4微型旋渦混合器：海門市其林貝爾儀器制造公司。

2 方法

2.1 模型復(fù)制和給藥方法 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將其隨機(jī)分為4組：空白對照組、模型組、參七蟲草膠囊組、氫化潑尼松組，每組10只。采用博萊霉素氣道噴霧復(fù)制肺纖維化大鼠模型[2]，應(yīng)用10%水合氯醛，按照3.5 mL/kg劑量腹腔注射麻醉大鼠后，將光源直接照射于大鼠咽喉部黏膜，一手戴手套提起舌頭向外向上，暴露會厭，在舌根和會厭交界區(qū)，顯露出聲門，將霧化器的噴霧頭經(jīng)聲門裂輕輕插入氣管內(nèi)，予博萊霉素5 mg/kg霧化給藥復(fù)制模型。4組均于模型復(fù)制成功后第2天灌胃，空白對照組和模型組每日給予生理鹽水10 mL/kg灌胃，羥化潑尼松組每日給予羥化潑尼松6 mg/kg灌胃，參七蟲草膠囊組每日給予參七蟲草膠囊0.35 g/kg灌胃，療程均為28 d。

2.2 指標(biāo)觀察方法

2.2.1 肺組織觀察 按照3.5 mL/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠后，分離腹主動脈，即刻取血3.0 mL，離心(3 000～4 000 r/min)15 min，及時取上清，置4 ℃冰箱保存待檢，取左肺上葉肺組織，分為兩部分，其中一部分采用4%甲醛固定1 d后，石蠟包埋，按照4 μm厚度連續(xù)組織切片，行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色，光鏡下觀察肺組織病理圖片。另一部分肺組織，用9倍勻漿介質(zhì)研磨，然后將研磨液3 000～4 000 r/min，離心10 min，取上清制備成10%的組織勻漿，置于4 ℃冰箱保存待檢。

2.2.2 Akt和PI3K水平檢測 酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測治療前后大鼠肺組織中Akt和PI3K的水平。將大鼠抗Akt、PI3K單克隆抗體包被于酶標(biāo)板上，標(biāo)品和樣品中Akt、PI3K與單抗體結(jié)合，鏈霉素-辣根過氧化物酶受體與加入生物素的抗大鼠Akt、PI3K抗體結(jié)合，形成粘附在酶標(biāo)板上的免疫復(fù)合物，未結(jié)合的酶通過溫浴和洗滌方法除去，將底物A、B加入標(biāo)本中，顯示藍(lán)色，終止液酸被加入后，藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，樣品中Akt、PI3K的濃度與黃色的深淺呈正相關(guān)，肺組織中大鼠Akt、PI3K水平通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清及肺組織中Akt、PI3K水平比較 與空白對照組比較，模型組大鼠血清和肺組織中Akt及PI3K水平顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，參七蟲草膠囊組和氫化潑尼松組血清及肺組織中Akt及PI3K水平顯著降低(P<0.05)；參七蟲草膠囊組大鼠血清和肺組織中Akt、PI3K水平顯著低于氫化潑尼松組(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清及肺組織Akt、PI3K水平比較

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與氫化潑尼松組比較，△P<0.05

3.2 4組大鼠肺泡上皮細(xì)胞及間質(zhì)的組織形態(tài)學(xué)變化比較 光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，空白對照組大鼠肺泡壁上皮細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量正常，肺泡間隔形態(tài)正常，纖細(xì)均勻；模型組大鼠肺泡壁上皮細(xì)胞形態(tài)雜亂不規(guī)則，數(shù)量減少，肺泡間隔增厚，間距增大，間質(zhì)增生；氫化潑尼松組及參七蟲草膠囊組大鼠肺泡壁上皮細(xì)胞形態(tài)雜亂，數(shù)量較模型組有所增多，肺泡間隔較模型組減小，間質(zhì)減少。見圖1。

注：A.空白對照組；B.模型組；C.氫化潑尼松組；D.參七蟲草膠囊組

圖1 4組大鼠肺泡上皮細(xì)胞及間質(zhì)的組織形態(tài)學(xué)變化比較(HE染色，10×20倍)

4 討論

特發(fā)性肺間質(zhì)纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)近年來發(fā)病率日漸增高,發(fā)病人群以中老年人常見[3]，主要累及肺間質(zhì)、肺泡和(或)細(xì)支氣管等部位，是一種病因不明的慢性炎癥性間質(zhì)性肺疾病，由于臨床療效不佳，相關(guān)研究逐漸增多。

在肺間質(zhì)纖維化病理過程中，肺成纖維細(xì)胞(lung fibroblast，LF)和肺肌成纖維細(xì)胞抗凋亡能力增強(qiáng)，這兩類細(xì)胞的持續(xù)存在導(dǎo)致肺間質(zhì)纖維化發(fā)展[4]。結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)、轉(zhuǎn)移生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)、胰島素樣生長因子-1等諸多細(xì)胞因子可通過激活PI3K/Akt信號途徑使LF具有抗凋亡的能力[5]，研究證明，當(dāng)受到細(xì)胞凋亡的刺激，細(xì)胞內(nèi)活化的PI3K及Akt信號能保護(hù)細(xì)胞免于凋亡。

廣譜抑制劑LY294002可抑制PI3K/Akt等多種信號通路，可完全阻斷TGF-β誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的人LF纖維化的發(fā)生[6]。PI3K/Akt信號激活后，導(dǎo)致TGF-β1下游Smad3蛋白的轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)一步增強(qiáng)，繼而成纖維細(xì)胞表達(dá)Ⅰ型膠原蛋白過程持續(xù)活化。LF表面的血管緊張素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)受體由TGF-β1介導(dǎo)的Smad、P38MAPK、JNK、PI3K/Akt等通路信號所活化，AngⅡ與其受體結(jié)合后促進(jìn)LF分泌細(xì)胞外基質(zhì)。由此可見，PI3K/Akt信號與TGF-β1因子協(xié)同作用而參與肺纖維化病程，提示PI3K/Akt信號在IPF的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。

肺纖維化在病機(jī)方面多表現(xiàn)為本虛標(biāo)實：標(biāo)實表現(xiàn)為肺纖維化有瘀血阻絡(luò)；本虛表現(xiàn)在早期為上焦肺虛，病程遷延日久則累及下焦腎臟，耗傷氣陰，后期則肺腎氣陰兩虛[7]。參七蟲草膠囊是安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，由西洋參、三七、冬蟲夏草三味名貴中草藥組成。西洋參具有補(bǔ)肺益氣養(yǎng)陰功效，作為君藥；臣藥冬蟲夏草具補(bǔ)益肺腎之精作用；三七活血散瘀，為佐藥。三藥合用，具有益肺補(bǔ)腎、養(yǎng)陰益氣、活血散瘀之功效，祛邪而不損傷正氣，補(bǔ)虛而不留邪毒。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn)，標(biāo)本同治，臨床療效顯著。

課題組前期研究結(jié)果表明，在博萊霉素誘導(dǎo)肺纖維化大鼠模型實驗中，參七蟲草膠囊抑制肺纖維化早期肺泡的炎癥反應(yīng)與其降低肺組織基質(zhì)金屬蛋白酶9及基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑-1表達(dá)密切相關(guān)[8]。與氫化潑尼松比較，參七蟲草膠囊能顯著抑制肺纖維化患者骨橋蛋白表達(dá)[9]。降低白細(xì)胞介素4(interleukin-4,IL-4)，升高γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)，糾正IFN-γ/IL-4失衡[10]。參七蟲草膠囊降低肺纖維化大鼠肺組織上皮細(xì)胞鈣黏素(E-cadherin，E-cad)，升高α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)以及波形蛋白，從而抑制肺泡上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化[11]。筆者在既往研究的基礎(chǔ)上，研究參七蟲草膠囊對肺纖維化模型大鼠外周血及肺組織中PI3K/Akt信號通路的影響，為參七蟲草膠囊臨床防治肺纖維化提供實驗依據(jù)。

本實驗結(jié)果顯示，肺纖維化模型組大鼠血清及肺組織PI3K、Akt水平均明顯升高，而參七蟲草膠囊可顯著改善血清及肺組織PI3K、Akt水平，表明其延緩肺間質(zhì)纖維化的機(jī)制可能是通過抑制PI3K/Akt信號通路的激活，減輕肺纖維化炎癥反應(yīng)而實現(xiàn)的。