提高黑米酒中花色苷含量的釀造方法研究

楊舒婷,楊 燁

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西 咸陽 712100 ; 2.陜西朱鹮黑米酒業(yè)有限公司，陜西 洋縣 723300)

1 引言

黑米是一種藥食兩用的大米，素有“黑珍珠”和“世界米中之王”的美譽(yù)，其釀造的黑米酒酒體為紫紅色，晶瑩剔透；口感清新淡雅，果香與米香相融合，是飲品中的佳品[1]，酒中含有16種氨基酸[2]、多種維生素及錳、鋅、銅等無機(jī)鹽，含有大米所缺乏的維生素C、葉綠素、花青素、胡蘿卜素及強(qiáng)心甙等特殊成分，尤其是含有抗氧化、消除自由基的花色苷等多酚類物質(zhì)。

已有研究表明[3]黑米中最具有營養(yǎng)價值的就是“花色苷”，它是花色素與糖以糖苷鍵結(jié)合成的一類化合物，并且花色苷化合物與 2-苯色原酮的黃酮基本骨架結(jié)構(gòu)相似，因此花色苷類化合物也被統(tǒng)稱為黃酮類化合物[4]?；ㄉ战?jīng)常被應(yīng)用于清除體內(nèi)自由基[5]、增殖葉黃素、抗腫瘤、抗癌[6]、抗炎[7]、抑制脂質(zhì)過氧化和血小板凝集[8]、預(yù)防糖尿病[9]、減肥、保護(hù)視力等，并且是一種天然、安全、無毒的色素，已被應(yīng)用于多種行業(yè)中。

傳統(tǒng)黑米酒釀造工藝流程[10]：精米→洗米→浸米→蒸飯→冷卻→拌曲→加酵母→糖化→發(fā)酵→壓榨→澄清→過濾→殺菌→灌裝→成品。張名位[11]等研究表明，黑米剝4 mm，所得米皮累計重量不到總量的15%，而花色苷占到總量的98%以上，在此過程中，精米這一加工步驟使集中在黑米表皮的花色苷被白白浪費(fèi)；洗米、浸米[12]、高溫蒸米和酶制劑的添加[13]等工藝，都會造成黑米花色苷的大量流失，大大降低了黑米酒的花色苷的含量。

在高如嵩[14]的研究中表明，陜西洋縣的黑米雖然脂肪含量相差不大，但脂肪酸的組成與普通黑米差別還是很大的，尤其是不飽和脂肪酸。因此，本文以洋縣黑米為原料，在繼承黑米黃酒傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝[12]的基礎(chǔ)上，通過提取和還原法、黑米整米提取法來生產(chǎn)黑米酒，解決了我國傳統(tǒng)黑米酒生產(chǎn)工藝中存在的黑米花色苷含量低的技術(shù)難題。

2 黑米酒釀造工藝優(yōu)化研究

為了提高黑米酒中的花色苷含量，本部分設(shè)計了提取與還原法、黑米整米提取法等關(guān)鍵工藝，以洋縣黑米(洋黑3#)為試驗材料，以黑米花色苷含量為影響因素的響應(yīng)值，在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法，來確定影響花色苷提取率的關(guān)鍵因素及其最佳組水平合，并進(jìn)一步優(yōu)化規(guī)?；a(chǎn)中黑米花色苷的提取工藝。

2.1 提取與還原法

2.1.1 實驗材料 ①黑米原料(品種為洋黑3#)，黑米潤糧、黑米蒸糧、黑米糖化醪、黑米發(fā)酵醪，由陜西朱鹮黑米酒業(yè)有限公司提供；②矢車菊素-3-葡萄糖苷與芍藥花素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自挪威 polyphenol AS 公司。

2.1.2 實驗設(shè)備 ①LC-15C 高效液相色譜儀，日本島津公司；②UV 2550型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；③數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2，江蘇省金壇市富華儀器有限公司。

2.1.3 實驗方法與結(jié)果 采用高效液相色譜法(HPLC)聯(lián)合紫外-可見分光光度計(UV-2550)對黑米酒釀造過程中各個階段的花色苷含量進(jìn)行檢測。從表1和圖1可以發(fā)現(xiàn)花色苷在原料中含量最高，隨著釀造流程的進(jìn)行，花色苷含量越來越少，特別在糖化和發(fā)酵期中下降最為突出，并且從大量花色苷研究中可得到較為相同的結(jié)論。

表1 黑米在釀造過程中花色苷含量變化 (mg·kg-1)

注：黑米花色苷組成成分有矢車菊素、芍藥素、多燕草素等[15][16]

因此，為了更大程度保留黑米中花色苷的含量，課題組決定采用直接從原料中提取花色苷并重新還原至酒液的方法，即“提取與還原”法優(yōu)化加工工藝。 “提取”是利用黑米花色苷的水溶性，將黑米原料在一定條件下浸入乙醇溶劑之中從而將溶液中花色苷進(jìn)行分離提純?！斑€原”是將提純提煉的花色苷重新加入到米酒溶液中，從而還原出黑米原有的色澤、活性物質(zhì)和營養(yǎng)物質(zhì)。該方法直接從黑米原料中提取花色苷，最大程度地提取了黑米花色苷，再將其還原至釀造好的米酒原液中，最大程度地保留了黑米花色苷，可以極大地提高黑米酒中花色苷含量。

2.2 黑米整米提取法

2.2.1 實驗材料 ①黑米、黑米皮、脫皮米粒，品種為洋黑3#，由陜西朱鹮黑米酒業(yè)有限公司提供；②矢車菊素-3-葡萄糖苷與芍藥花素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自挪威 polyphenol AS 公司；③乙醇，分析純，西安化學(xué)試劑廠；鹽酸，分析純，西安化學(xué)試劑廠。

2.2.2 實驗設(shè)備 ①LC-15C 高效液相色譜儀，日本島津公司；②UV 2550型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；③數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2，江蘇省金壇市富華儀器有限公司；④低速臺式離心機(jī)，TDZ4-WS，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司等。

2.2.3 實驗方法與結(jié)果 ①樣品制備。分別將黑米、黑米皮、脫皮米粒篩除干凈，放入高速粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎，過 40 目篩得到待測樣品粉末，并加貼標(biāo)簽，常溫下放置待用。②花色苷的提取。稱取 2.0 g 樣品于 250 mL 錐形瓶中，分別加入無水乙醇及 1%的鹽酸溶液混合液(體積比均為 1∶10)。用保鮮膜封口后固定于超聲波振蕩器中提取(溫度為室溫 20℃，頻率為 100Hz)30min。冷卻至室溫，再進(jìn)行離心分離 10 min(轉(zhuǎn)速3 000 r·min-1)，取上清液。殘渣繼續(xù)用上述提取液提取，反復(fù) 2 次，合并上清液等到花色苷提取液。用 0.45 μm 濾膜過濾，待測。③花色苷含量分析。將黑米整米、黑米皮和黑米浸米水這三種方法進(jìn)行了對比。通過表2、圖2的數(shù)據(jù)，我們可以得出三種介質(zhì)中提取的花色苷含量是黑米皮>黑米整米>黑米浸米水。

表2 黑米不同部位花色苷的含量 (mg·kg-1)

2.2.4 分析與討論 通過實驗發(fā)現(xiàn)，顯然，黑米皮中提取的花色苷含量最高，其次是黑米整米中提取的花色苷。然而在實際生產(chǎn)中，黑米皮在剝離過程中會有一部分淀粉、脂肪存在，這些雜質(zhì)不易去除，易變質(zhì)，影響黑米多酚的提取純度、穩(wěn)定性及后期酒品的穩(wěn)定性。為了解決這一問題，我們采用了離心過濾、布袋過濾、微孔膜過濾去除雜質(zhì)，但效果都不太理想。因此，本文調(diào)整了方案，選擇黑米整米的方法進(jìn)行提取花色苷。黑米整米提取雖然沒有黑米皮提取率高，但由于有黑米皮的包裹，提取液中就沒有淀粉殘留，提取的純度大大的提高，不再產(chǎn)生沉淀，過濾也變得更加簡單，花色苷及后期酒液穩(wěn)定性較好。再將提取花色苷后的黑米原料采用研磨技法粉碎成米糊，破壞黑米皮層、釋放內(nèi)部淀粉，直接進(jìn)入下一步糖化發(fā)酵程序。

在實際的生產(chǎn)試制過程中，我們發(fā)現(xiàn)“黑米整米提取法”完美的將花色苷的提取與后期黑米酒發(fā)酵結(jié)合在一起?！昂诿渍滋崛》ā痹谔崛』ㄉ盏耐瑫r，又能凈化除雜，使花色苷提取率大大提高。同時，該工藝摒棄了“精米”工序，解決了黑米皮層包裹難題，做到了全米利用，極大地提高原料利用率。

2.3 黑米花色苷提取條件的優(yōu)化

2.3.1 實驗材料 ①黑米，品種為洋黑3#，由陜西省水稻研究所提供；②矢車菊素-3-葡萄糖苷與芍藥花素-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，購自挪威 polyphenol AS 公司；③乙醇，分析純，西安化學(xué)試劑廠；鹽酸，分析純，西安化學(xué)試劑廠。

2.3.2 實驗設(shè)備 ①UV 2550型紫外-可見分光光度計，日本島津公司；②數(shù)顯恒溫水浴鍋，HH-2，江蘇省金壇市富華儀器有限公司；③低速臺式離心機(jī)，TDZ4-WS，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司等。

2.3.3 實驗方法與結(jié)果 主要有:

(1)單因素實驗。以黑米為實驗材料，以不同濃度梯度酸性乙醇為提取溶劑，以黑米提取液花色苷含量為評價指標(biāo)，分別考察不同的提取溫度、時間、乙醇濃度、鹽酸濃度、液料比和提取次數(shù)，對花色苷取液含量的影響。以花色苷量高低為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定影響花色苷提取各因素中具有顯著影響的因子，為下一步響應(yīng)面實驗設(shè)計做準(zhǔn)備。從影響黑米花色苷提取效果的 6個單因素實驗可以發(fā)現(xiàn)，顯著影響黑米中花色苷提取效果的是PH值、乙醇濃度和提取溫度這3個因素。單因素實驗結(jié)果如圖3-5。

(2)響應(yīng)面實驗[17～18]。根據(jù)單因素實驗的結(jié)果，選擇顯著影響花色苷提取效果的pH值、乙醇濃度、提取溫度這3個因素與黑米花色苷得率進(jìn)行響應(yīng)面實驗。準(zhǔn)確稱取經(jīng)預(yù)處理的黑米10.000 g，放入200 mL燒杯中，每組3個重復(fù)，在其他條件相同的情況下，采用不同的乙醇濃度、PH值、提取溫度進(jìn)行提取，每次提取50 min，以黑米花色苷得率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面實驗法逐個考察各提取條件對提取效果的影響。

①響應(yīng)面實驗的水平設(shè)計。 采用Design Expert 8.0.6軟件中的Box-Benhnken模型，以黑米花色苷得率Y為響應(yīng)值，在提取時間50min條件下，選取乙醇濃度(A)、PH值(B)及提取溫度(C)進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析實驗，實驗方案見表3。

②響應(yīng)面實驗的結(jié)果。

③響應(yīng)面數(shù)學(xué)模型的建立及檢驗。

利用Design Expert8.0.6程序，對表4數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，以黑米花色苷的提取得率(Y)為響應(yīng)值，乙醇濃度(A)、pH值(B)和提取溫度(C)為自變量，得回歸方程如下，并經(jīng)可信度分析表明該方程可靠性較高。

Y=-87.14664+1.91197A+5.48756B+0.45899C+8.55000E-004AB-4.15000E-004AC-9.43333E-003BC-0.013222A2-0.72245B2-2.68244E-003C2。

利用Design Expert8.0.6程序做方差分析，結(jié)果見表5。表5表明，模型的P<0.0001，說明模型顯著；A(乙醇濃度)、B(PH值)、C(提取溫度)及所有二次項對Y值的影響高度顯著，矢擬項(Lack of Fit)的P=0.887>0.05，表明方程對實驗擬合度較好。

表5 回歸方程方差分析結(jié)果

注：**表示相關(guān)系數(shù)在0.01的顯著性水平下顯著

④響應(yīng)面圖形分析。

圖6-圖8是根據(jù)回歸方程繪制的Y = f(A，B，C)響應(yīng)面和等高線分析圖。響應(yīng)面分析圖是指在其他因素水平固定的條件下，響應(yīng)值與試驗中的兩個因素所構(gòu)成的三維曲面圖。響應(yīng)面可以直接反映出各因子對響應(yīng)值的影響大?。坏雀呔€圖可以直接看出最優(yōu)條件下各因子的取值。

從圖6、圖7可以看出，在pH值、溫度固定條件下，花色苷得率隨乙醇濃度的升高而增加但并非持續(xù)增大，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到68%時出現(xiàn)拐點，花色苷得率開始下降。同樣，圖7、圖8 說明在pH值、乙醇濃度固定條件下，溫度顯著影響花色苷得率，拐點出現(xiàn)在810 C。圖6、圖8說明在乙醇濃度和溫度固定的條件下， pH值也顯著影響黑米中花色苷得率，拐點出現(xiàn)在pH值為3.5時。

⑤實驗結(jié)論。

由Design Expert8.0.6程序分析得到的花色苷提取的最佳工藝條件為：乙醇濃度66.94%，pH3.5，提取溫度81℃。此時，黑米中花色苷的理論得率達(dá)到了6.857%，為實驗期間的最大值。

2.4 規(guī)?；a(chǎn)中黑米花色苷提取工藝的優(yōu)化

實驗室響應(yīng)面法試驗，給出了黑米花色苷提取的最佳工藝條件。但是在企業(yè)規(guī)模化實際生產(chǎn)中，原料本身的特質(zhì)、原料與溶劑的料液比、料液比、萃取溫度、萃取時間、萃取次數(shù)、酒精濃度、攪拌和溶液流動、pH值等都會影響到提取率與提取質(zhì)量。

為了考慮到實際生產(chǎn)的便利性，項目組經(jīng)過多次試驗，最終以乙醇濃度65%，pH3.2為最佳；考慮到溫度提高會導(dǎo)致雜質(zhì)的溶出量及能耗的增加，最終提取溫度以78℃最佳；提取到的花色苷實際平均得率為6.558%，與理論值相差0.299%。最優(yōu)工藝方案如下：

(1)獲取食用酒精：收集黑米酒發(fā)酵副產(chǎn)物酒糟、貯酒過程中倒罐分離的酒腳和經(jīng)蒸餾后回收得到的蒸餾酒，獲得食用酒精(調(diào)制至濃度65度)，做萃取溶劑。

(2)提?。喊凑蘸诿缀褪秤镁凭?濃度65度)1∶2～1∶3的比例浸漬清洗后的黑米，并加熱物料至600C -800C，恒溫提取黑米多酚，收集黑米多酚提取液；

(3)過濾：用膜過濾技術(shù)過濾，并對過濾后的黑米多酚提取液真空濃縮，回收蒸餾酒，得到黑米多酚濃縮液；

(4)冷凍：濃縮液經(jīng)48 h的冷凍除雜，感官呈現(xiàn)紫紅色液體；

(5)還原：取色后的黑米釀成成品酒，將黑米多酚濃縮液均勻加入并封罐存貯。

3 新老工藝下黑米酒花色苷含量測試

花色苷有兩個最大吸收波長范圍，一個在可見光區(qū)，最大吸收波長為 500～550 nm，另一個在紫外光區(qū)，最大吸收波長為 270～280 nm。根據(jù)花色苷在不同 PH 值條件下有最大吸收波長的特點，當(dāng)pH1.0時，520 nm處有最大吸收峰；而當(dāng)pH值為4.5時，花色苷轉(zhuǎn)變?yōu)闊o色查爾酮形式，在520 nm處無吸收，采用pH 試差法測示計算黑米酒中花色苷含量[19]，測試結(jié)果如表8所示。

表6 pH試差法測定黑米多酚吸光度值

注：A=(A520-A700)PH1.0-(A520-A700)PH4.5

據(jù)表6數(shù)據(jù)計算得出原有工藝釀造的黑米酒花色苷含量 1.50 mg·L-1；新工藝下花色苷含量5.7 mg·L-1。新工藝下花色苷百分比含量是有工藝花色苷含量的3.8倍。對比分析可知，新工藝增加了黑米酒中花色苷的含量。

4 結(jié)果與討論

在傳統(tǒng)的黑米酒釀造工藝的基礎(chǔ)上，本項目提出了“提取和還原法”和“黑米整米提取法”以提高黑米酒中花色苷含量。

首先，為了有效解決了原工藝中黑米酒天然色素?fù)p失、花色苷等活性物質(zhì)流失嚴(yán)重的技術(shù)難點，本項目采用運(yùn)用提取和還原法、對黑米花色苷提純并還原至酒液中，更好地保留了黑米中的營養(yǎng)物質(zhì)和活性物質(zhì)。其次，擯棄了原有工藝中的“精米”工序，運(yùn)用了“黑米整米提取技術(shù)”，有效地完成了黑米花色苷的提取，最大程度地保留了黑米中特有的花色苷等多酚類活性物質(zhì)。最后，摒棄了為控制酒體氧化而添加抗氧化劑、為改善色香味而添加人工色素的傳統(tǒng)工藝。酒的顏色來自黑米本身的天然花色苷色素，不僅優(yōu)化了品質(zhì)，還做到了有機(jī)環(huán)保，綠色健康。