基于基因測序技術的“微生物實驗”探討

張廣毅

摘 要：宏基因組即環(huán)境微生物遺傳物質(zhì)的總稱，該技術通過測序并對比分析微生物菌落的DNA序列，以理解環(huán)境微生物的組成及其與環(huán)境的相互作用。宏基因組技術可以通過免培養(yǎng)的方式了解復雜生物系統(tǒng)中的微生物群落，克服了傳統(tǒng)實驗室培養(yǎng)方法的一些缺點。宏基因組中，基于標簽基因（16S rRNA基因）分析和基于全基因組分析是微生物實驗中最常用的兩種手段，本文重點對全基因組測序和標簽序列測序進行說明和對比。全宏基因組技術是全面了解微生物的分子進化、基因組成和基因調(diào)控等方面的重要微生物實驗工具，而標簽基因測序更適合于設置為本科教學實驗。

關鍵詞：宏基因組;微生物實驗;菌落

目前，多數(shù)本科微生物實驗教學主要包括典型微生物觀察、培養(yǎng)基配置、微生物培養(yǎng)與分離等，主要依靠顯微鏡對微生物個體形態(tài)觀察，而對環(huán)境中微生物菌落的結構、代謝功能等缺少了解，同時綜合性、設計性實驗較少，難以滿足一流本科的建設需求。隨著高通量測序技術的發(fā)展，宏基因組越來越廣泛地應用于微生物相關的科研、教學當中。另外，環(huán)境中絕大多數(shù)微生物無法通過傳統(tǒng)的培養(yǎng)分離獲得，因此，宏基因組學成為研究環(huán)境微生物的主流方法?；跇撕灮颍?6S rRNA）的分析和基于全基因組的分析是微生物實驗中最常用的兩種手段，論文介紹了各自特點并探討其作為本科微生物實驗的可能性。

宏基因組數(shù)據(jù)分析的主要任務是：對環(huán)境微生物群落物種組成結構進行鑒定，對環(huán)境微生物群落的功能進行分析，比較不同環(huán)境中微生物群落的差異。即對宏基因組樣本進行分析與比較，通過對宏基因組樣本數(shù)據(jù)的分析，可以獲得環(huán)境微生物樣本的分類學構成、各類微生物的相對豐度及復雜微生物群落的功能等信息，在此基礎上的比較可以進一步發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下微生物的差異，揭示微生物群落與環(huán)境之間的相互作用。

1 全基因組測序

微生物全基因組測序相對于標簽序列（典型的標簽序列為16S rRNA測序）的測序數(shù)據(jù)，其包含了群落中所有基因組數(shù)據(jù)，是整個基因組序列。通過整個基因序列的基因信息，在數(shù)據(jù)庫中對比分析微生物群落的種群結構與功能信息。

環(huán)境微生物所有基因組序列數(shù)據(jù)集合獲取的方法如下：首先將微生物基因從樣本中提取出來;隨后通過超聲等方法將基因序列打斷生成DNA片段，建立DNA片段文庫并進行測序;然后對DNA序列數(shù)據(jù)進行質(zhì)量評估和預處理，去除質(zhì)量較低的數(shù)據(jù)及噪聲影響;宏基因組還需對預處理后的數(shù)據(jù)進行拼裝，拼裝前的短序列稱為reads，拼接后的長序列稱為contig;最后通過數(shù)據(jù)庫檢測、對比、分析處理宏基因組序列。

微生物群落中，所有微生物的遺傳信息都來自于全基因組序列數(shù)據(jù)，通過宏基因組測序數(shù)據(jù)分析，可以比較全面的獲取環(huán)境微生物樣本的信息，如微生物菌落組成、各組成菌種的豐度以及微生物各基因的代謝功能信息。另外，全基因組序列數(shù)據(jù)從理論上是包括16S rRNA序列數(shù)據(jù)的。有實驗人員從獲取的宏基因組測序數(shù)據(jù)中讀取到了群落的16S rRNA數(shù)據(jù)，說明宏基因組測序數(shù)據(jù)廣度遠遠大于標簽序列數(shù)據(jù)信息。近年來，隨著高通量測序技術的高速發(fā)展以及測序技術的成本的下降，微生物實驗教學及科研人員可以更廣泛地獲得宏基因組測序數(shù)據(jù)。

2 標簽序列測序

標簽序列（tag sequence）也被稱為擴增子序列，在長期的進化過程中，有部分長度適中的DNA序列高度保守，同時又含有一定的可變區(qū)。核糖體RNA就具有上述特征，16S rRNA廣泛存在于原核微生物中，由于它們堿基長度合適（約1500 Kb），具有高度保守性，常用于系統(tǒng)發(fā)生學的研究，所以這一類的序列被統(tǒng)稱為標簽序列。

實驗室條件下，絕大多數(shù)微生物無法培養(yǎng)。為了能夠突破傳統(tǒng)的實驗室培養(yǎng)微生物的限制且獲取環(huán)境中比較完成的微生物數(shù)據(jù)，直接從環(huán)境中獲取微生物的基因就變得很重要。其簡要過程如下：首先采集微生物樣品并提取其中所有DNA序列，然后以高可變區(qū)堿基序列為模板設計引物，對樣品DNA進行PCR擴增，對擴增后的16S rRNA基因序列進行測序;對獲取的原始數(shù)據(jù)需進行二次處理，去除測序準確度低以及部分二聚體序列;最后，通過以上步驟得到的基因序列數(shù)據(jù)即可用于后續(xù)的數(shù)據(jù)庫對比分析。

將16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)輸入至已建立的16S rRNA序列數(shù)據(jù)庫進行比對分析，即可獲取數(shù)據(jù)庫中己知的微生物物種信息。16S rRNA基因序列分析時通常通過序列間的差異性，即遠近關系，通過聚類等切分為不同的操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs），將劃分后的數(shù)據(jù)輸入至Greengene、RDP和SILVA等己知的序列數(shù)據(jù)庫，即可得到OTU的分類學信息，通過一定的算法即可獲取環(huán)境中微生物菌群的物種結構目錄。不同的相似性比例標準閾值（通常為97%），可以獲取不同精度的分類單元。標簽序列技術的局限性在于：16S rRNA數(shù)據(jù)易于估計低稀有物種的種類，但對物種豐度數(shù)據(jù)的判斷不是十分準確，因為各種因素影響擴增過程，擴增后數(shù)據(jù)存在偏差;另一問題是，此類數(shù)據(jù)通常只能估計微生物菌落結構，缺少其他基因如代謝功能等數(shù)據(jù)。

3 兩種方法的比較

通過16S rRNA基因序列，能夠了解到環(huán)境中到底有哪些微生物存在，以及它們各自在群落中的數(shù)量比例;基于這種微生物群落結構的信息，進而就能夠?qū)ξ⑸镏g以及微生物與環(huán)境的關系進行分析說明。

基于標簽序列（16S rRNA）的宏基因組測序數(shù)據(jù)的樣本比較方法較為簡單且成本較低，但是，16S rRNA基因序列僅僅代表生物體當中許多基因的一種，其所提供的基因信息僅僅是很小一部分，有很多局限性，如此類數(shù)據(jù)集以OTU頻率為主要特征，僅能提供微生物群落中的種群結構和豐度信息，對于宏基因組樣本基因功能差異的分析就顯得力不從心，無法獲得環(huán)境微生物當中所關心的功能信息。

隨著高通量測序技術的不斷發(fā)展，全宏基因組數(shù)據(jù)的獲得難度及成本不斷降低。與單一基因序列16S rRNA數(shù)據(jù)相比，全宏基因組數(shù)據(jù)即提取出微生物群落中菌群的全部遺傳信息，這無疑是一種更全面地表征環(huán)境微生物樣本的方法。對比分析全宏基因組數(shù)據(jù)不僅可以獲取微生物群落的結構組成信息（物種的組成和豐度等），而且可以獲得較全面的代謝功能信息。例如，微生物蛋白質(zhì)編碼基因，生物代謝反應功能酶的表達，乃至更詳盡的代謝反應網(wǎng)絡。由于全宏基因組數(shù)據(jù)包含了微生物中的所有遺傳信息，故可以通過一定的手段，從高質(zhì)量的全宏基因組數(shù)據(jù)提取出特定的核酸序列，如16S rRNA數(shù)據(jù)，通過這種途徑可以較好地避免擴增偏差。目前，實際的宏基因組學研究中往往同時使用16S rRNA基因測序和宏基因組測序數(shù)據(jù)。

4 結論

宏基因組分析包括標簽基因（16S rRNA）分析和全基因組分析。相比于單一的16S rRNA數(shù)據(jù)，全宏基因組數(shù)據(jù)包括了群落中菌群的全部遺傳信息，能更好地表征環(huán)境微生物樣本，但是目前成本較高、數(shù)據(jù)量大、分析復雜，適用于科學研究。雖然16S rRNA數(shù)據(jù)單一，但能夠培養(yǎng)鍛煉學生熟悉主流的微生物分子生物學技術，使學生接觸現(xiàn)代的微生物技術發(fā)展及表征手段，加深微生物理論課堂中“遺傳與變異”相關章節(jié)的理解與掌握。

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