稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)活菌的方法簡(jiǎn)介

龔軍輝 王 晶

(河北省保定市第一中學(xué) 071000)

1 問題的提出

“微生物數(shù)量的測(cè)定”是2017年高考考綱中新增加的內(nèi)容，同時(shí)也是教學(xué)的重難點(diǎn)。稀釋涂布平板法是對(duì)微生物計(jì)數(shù)的常用方法，用來統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目。當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落來源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌。通過統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約有多少活菌。但對(duì)菌落計(jì)數(shù)的結(jié)果處理往往成為學(xué)生的易錯(cuò)點(diǎn)。

經(jīng)典例題：在從土壤中分離產(chǎn)脲酶細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)中，將10g土壤樣液梯度稀釋，在3個(gè)培養(yǎng)基平板上均接種稀釋倍數(shù)為105的土壤樣液0.1mL，培養(yǎng)一段時(shí)間后，平板上長(zhǎng)出的細(xì)菌菌落數(shù)分別為42、200、256。則1g土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)量為________個(gè)。

很多學(xué)生得出的答案為：1.66×108。同時(shí)，學(xué)生對(duì)于42這個(gè)數(shù)據(jù)如何處理存在疑問：是否需要舍棄？如果需要舍棄，標(biāo)準(zhǔn)是什么？

2 菌落計(jì)數(shù)的基本原則

2.1 教材中的相關(guān)表述 在人教版高中生物學(xué)選修1《生物技術(shù)實(shí)踐》中，對(duì)于稀釋涂布平板法計(jì)數(shù)菌落有如此的表述：為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30～300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。但是，若想當(dāng)然地認(rèn)為42、200、256三個(gè)數(shù)據(jù)均處于30～300范圍之內(nèi)，然后直接求平均值，再乘以稀釋倍數(shù)，就會(huì)得出1.66×108的錯(cuò)誤結(jié)果。這也是很多學(xué)生產(chǎn)生錯(cuò)誤的原因。

事實(shí)上，教材中的相關(guān)表述只是在說明可計(jì)數(shù)的菌落數(shù)量的適宜范圍。某一稀釋度下的3個(gè)平板中菌落數(shù)并不能簡(jiǎn)單地直接求平均值，還應(yīng)該關(guān)注稀釋度的設(shè)置以及計(jì)數(shù)結(jié)果的允許差。

2.2 稀釋度的設(shè)置及計(jì)數(shù)原則 為了確保有效活菌數(shù)的準(zhǔn)確測(cè)定，在采用平板計(jì)數(shù)檢測(cè)中，必須設(shè)3個(gè)稀釋度且成梯度，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)重復(fù)[1]。測(cè)定土壤中細(xì)菌的數(shù)量，一般選用104、105和106倍的稀釋液進(jìn)行平板培養(yǎng)；測(cè)定放線菌的數(shù)量，一般選用103、104和105倍稀釋；測(cè)定真菌的數(shù)量，一般選用102、103和104倍稀釋。

如果平板中菌落的數(shù)量太少，必然會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)誤差太大；反之，如果平板中菌落數(shù)量過多，會(huì)造成計(jì)數(shù)上的困難。因此，國(guó)際上通用的菌落計(jì)數(shù)的基本原則，是以平板上出現(xiàn)30～300個(gè)菌落數(shù)的稀釋平板為計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。同時(shí)要求，同一個(gè)稀釋度重復(fù)3次的平板上菌落數(shù)標(biāo)準(zhǔn)差值應(yīng)小于允許差值[2]。也就是說，在平板計(jì)數(shù)檢測(cè)中，如果同一稀釋度下的3次重復(fù)菌落數(shù)雖然均處于30～300個(gè)范圍之內(nèi)，但數(shù)據(jù)相差較大，就需要舍棄。

2.3 同一稀釋度下3個(gè)重復(fù)的允許差值 標(biāo)準(zhǔn)差的計(jì)算公式如下：

平板菌落數(shù)的允許差值如表1[3]。

表1 平板菌落數(shù)允許差值

由表1可知，如果平板上3次重復(fù)的菌落平均數(shù)較小，其允許的誤差就??；反之，如果菌落平均數(shù)較大，則其允許的誤差就大一些。若選一個(gè)適宜稀釋度計(jì)數(shù)，則3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差值應(yīng)小于規(guī)定的允許差值。若3個(gè)重復(fù)的標(biāo)準(zhǔn)差值大于規(guī)定的允許差值，則無法正確計(jì)數(shù)，必須重新測(cè)定。

2.4 對(duì)例題的進(jìn)一步分析 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)差公式，對(duì)上述例題計(jì)算如下：

參照表1中菌落數(shù)的允許差值可以看出，平板菌落平均數(shù)166處于101～300之內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)所允許差值為±≤50。但經(jīng)計(jì)算得知，該稀釋度下3個(gè)平板菌落數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)差值±111已遠(yuǎn)超允許差值。因此，本次的計(jì)數(shù)結(jié)果不符合要求，無法正確計(jì)數(shù)，需要重做。

3 拓展

為更好地理解和熟練掌握微生物平板菌落計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)處理方法，提供3組示例(表2)以供參考和借鑒。

表2 平板菌落計(jì)數(shù)的數(shù)據(jù)處理示例