外顯子組測(cè)序技術(shù)的原理及應(yīng)用概述

李法君

(山東省濰坊科技學(xué)院 262700)

隨著社會(huì)生活水平的提高，健康問(wèn)題越來(lái)越多地受到關(guān)注。傳統(tǒng)遺傳疾病的鑒定多采用染色體顯帶分析、核型分析和遺傳標(biāo)記等方法來(lái)尋找與疾病相關(guān)的DNA變異。這些方法雖然各有特點(diǎn)，但都存在效率低下、工作量大和分辨率低等問(wèn)題。21世紀(jì)初，隨著人類基因組計(jì)劃和國(guó)際人類基因組單體型圖計(jì)劃的相繼完成以及高通量生物芯片技術(shù)的快速發(fā)展,研究人員得以利用全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome-wide association study，GWAS)的方法來(lái)篩選復(fù)雜疾病的易感基因,并取得了舉世矚目的成就，掀起了人類基因組研究的第三次浪潮[1]。但GWAS技術(shù)也存在自身的局限性，如對(duì)稀有的變異和結(jié)構(gòu)變異不敏感，易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果等[2,3]。與此同時(shí)，研究人員還意識(shí)到對(duì)疾病及性狀表型起著關(guān)鍵作用的變異主要來(lái)源于編碼區(qū)，即外顯子的差異[4,5]，而前期的研究則多聚焦于非編碼區(qū)的變異，對(duì)外顯子變異的關(guān)注度較欠缺。由于全基因組測(cè)序費(fèi)用高昂，因此在研究可用的財(cái)力資源一定的條件下，外顯子組測(cè)序技術(shù)更適合探索高深度測(cè)序數(shù)據(jù)的大批量樣本研究?；谏鲜鲈?，眾多研究者開(kāi)始優(yōu)先關(guān)注編碼區(qū)的信息，從而加速了外顯子組測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)。

外顯子是蛋白質(zhì)的編碼區(qū)，是真核生物基因組的一部分，含有合成蛋白質(zhì)所需的遺傳信息，基因組中的全部外顯子稱為外顯子組。如人類基因組大約有1.8×105個(gè)外顯子，總長(zhǎng)30Mb，盡管只占人類基因組的1%，但存在與個(gè)體表型相關(guān)的大量功能變異。研究表明，人類85%以上的致病基因都是由外顯子堿基突變?cè)斐傻腫4]。2009年8月，外顯子組測(cè)序技術(shù)第一次成功應(yīng)用于疾病致病基因的鑒定，Ng等[6]對(duì)4名無(wú)親緣關(guān)系的弗里曼謝爾登綜合征患者[已知該病的致病基因?yàn)榧∏虻鞍字劓?基因(MYH3)]及8名對(duì)照組的DNA樣本進(jìn)行外顯子組測(cè)序，通過(guò)對(duì)12個(gè)樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，準(zhǔn)確找出了位于MYH3中的致病突變，這也預(yù)示了其作為遺傳學(xué)研究的重要工具，具有廣闊的應(yīng)用前景。

1 外顯子組測(cè)序技術(shù)的原理

外顯子組測(cè)序主要包括外顯子序列的捕獲富集、DNA測(cè)序和數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析三個(gè)主要步驟。

1.1 外顯子組的捕獲富集 目前,主要通過(guò)羅氏(NimbleGen)[7]和安捷倫(Agilent)[8]兩種捕獲芯片對(duì)外顯子序列進(jìn)行富集。其基本原理是：首先將基因組DNA隨機(jī)打斷成200～300bp左右的片段，隨后進(jìn)行DNA片段平末端修復(fù)，5′端加磷酸基團(tuán)，3′端加PloyA尾，通過(guò)TA連接將接頭序列加到片段兩端，經(jīng)過(guò)一輪PCR擴(kuò)增后成為完整的片段文庫(kù)；然后將這些DNA片段與捕獲芯片進(jìn)行雜交，從而得到富集的目標(biāo)片段；隨機(jī)把目的片段連接成長(zhǎng)鏈DNA片段，然后再次隨機(jī)打斷并在其兩端連接上測(cè)序接頭，然后用與接頭相匹配的序列為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)合格后的外顯子組文庫(kù)即可上機(jī)測(cè)序。

1.2 DNA測(cè)序 外顯子組的測(cè)序以二代測(cè)序技術(shù)為主，其中大部分報(bào)道的外顯子組測(cè)序技術(shù)確定的致病基因使用的平臺(tái)是Illumina測(cè)序儀。其測(cè)序的基本原理是邊合成邊測(cè)序，用不同顏色的熒光標(biāo)記四種不同的dNTP，當(dāng)DNA聚合酶合成互補(bǔ)鏈時(shí)，每添加一種dNTP就會(huì)釋放出不同的熒光，根據(jù)捕捉的熒光信號(hào)并經(jīng)過(guò)特定的計(jì)算機(jī)軟件處理，從而獲得待測(cè)DNA的序列信息。隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，第三代測(cè)序技術(shù)也用在外顯子組的測(cè)序方面。第三代單分子測(cè)序儀不需要擴(kuò)增建立DNA文庫(kù)，而是邊合成邊測(cè)序?qū)㈦S機(jī)打斷后的片段3′末端加上PolyA，通過(guò)合成互補(bǔ)鏈技術(shù)對(duì)數(shù)百萬(wàn)個(gè)DNA片段進(jìn)行測(cè)序。第三代測(cè)序儀測(cè)序通量高，測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)，可達(dá)到10 kb，更加有利于基因組的拼接，但其錯(cuò)誤率也相對(duì)較高，需要進(jìn)行高覆蓋度測(cè)序以確保較高的測(cè)序精度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 雖然外顯子組測(cè)序得到的數(shù)據(jù)較全基因組測(cè)序要少許多，但仍會(huì)產(chǎn)生大量的數(shù)據(jù)。在如此龐大的數(shù)據(jù)中發(fā)掘出有意義的信號(hào)依然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。數(shù)據(jù)分析主要包括常規(guī)的圖像信息數(shù)據(jù)分析和生物信息學(xué)分析。圖像信息數(shù)據(jù)分析主要包括圖像的去噪音、銳化、定位和偏移校正、依據(jù)光強(qiáng)度獲得堿基等；生物信息學(xué)分析的目的是挖掘變異位點(diǎn),包括單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)和短的插入/缺失片段(short insertion/deletions，Indels)。首先是通過(guò)質(zhì)控排除測(cè)序過(guò)程中產(chǎn)生的低質(zhì)量Reads,然后將高質(zhì)量的Reads與參考基因組進(jìn)行比對(duì),統(tǒng)計(jì)SNP和Indels,并對(duì)這些變異位點(diǎn)進(jìn)行注釋、篩選并最終驗(yàn)證目的致病基因。

2 外顯子組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用

2.1 單基因疾病的檢測(cè) 單基因病又稱為孟德?tīng)栠z傳病,是指由于單個(gè)基因突變而導(dǎo)致的疾病,常以孟德?tīng)栠z傳模式存在于家系中。理論上，外顯子組測(cè)序可發(fā)現(xiàn)同一基因座上外顯子區(qū)域的所有突變，因而能快速直接地鑒定致病基因。Liu等[9]利用連鎖分析將兩個(gè)家族發(fā)作性疼痛病家系的致病基因定位在染色體3p22.3-p21.32上，然后再利用外顯子組測(cè)序技術(shù)，在兩個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)SCN11A基因(電壓門控鈉離子通道α亞基的編碼基因之一)的兩個(gè)錯(cuò)義突變，最后結(jié)合家系內(nèi)共分離分析以及SCN11A基因功能研究，確定SCN11A為家族發(fā)作性疼痛一個(gè)新的致病基因。此外，研究人員利用外顯子組測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了NCST基因(γ分泌酶的成分基因之一)的突變可導(dǎo)致逆向性痤瘡的發(fā)生[10]。該成果對(duì)NCSTN基因突變的檢測(cè)和逆向性痤瘡的診斷、治療具有十分重要的意義。

2.2 癌癥等復(fù)雜疾病的檢測(cè) 近來(lái)，外顯子組測(cè)序在癌癥的研究方面取得了眾多科研成果。Jones等[11]對(duì)8個(gè)患者的腫瘤組織和正常細(xì)胞進(jìn)行了對(duì)比測(cè)序分析，鑒定出了4個(gè)基因突變至少在2例腫瘤組織中發(fā)生，其中ARID1A基因(ATP依賴染色質(zhì)重塑復(fù)合物的亞基之一)是新發(fā)現(xiàn)的致癌基因，而PPP2R1A基因(蛋白磷酸酶2A支架亞基基因)則是新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因。Brastianos等[12]利用外顯子組測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在92%的顱咽管瘤患者中發(fā)現(xiàn)CTNNB1基因(鈣粘相關(guān)蛋白β亞基1基因)具有突變,表明CTNNB1與顱咽管瘤的發(fā)生密切相關(guān)。

2.3 動(dòng)植物研究中的應(yīng)用 外顯子組測(cè)序技術(shù)除了廣泛應(yīng)用在人類疾病研究領(lǐng)域之外，在動(dòng)植物相關(guān)基因的研究中獲得了大量的研究成果。Robert等[13]對(duì)96頭豬的外顯子組進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)了幾十萬(wàn)個(gè)核苷酸變異，根據(jù)檢測(cè)到的核苷酸變化并結(jié)合產(chǎn)仔率，推測(cè)大量關(guān)鍵基因的突變可能是造成一些新生胚胎死亡的原因。Bolon等[14]對(duì)大約12萬(wàn)粒大豆種子進(jìn)行了快中子輻射處理，并結(jié)合外顯子組測(cè)序技術(shù)，對(duì)與表型有關(guān)的候選基因進(jìn)行分析，成功發(fā)現(xiàn)控制脂肪酸去飽和酶基因的丟失，該項(xiàng)工作的開(kāi)展為后續(xù)功能遺傳學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

3 展望

外顯子組測(cè)序是介于全基因組關(guān)聯(lián)分析與全基因組測(cè)序之間的基因分析策略，能較系統(tǒng)地發(fā)現(xiàn)基因組中蛋白編碼區(qū)的主要遺傳變異。與全基因組測(cè)序相比，外顯子組測(cè)序技術(shù)具有高效、省時(shí)、省力和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)，已在疾病研究中取得了重大突破。但外顯子組測(cè)序也存在自己的不足：對(duì)非編碼區(qū)變異的研究具有局限性，還不能覆蓋所有編碼區(qū)的致病變異；在目標(biāo)區(qū)域的捕獲時(shí)存在捕獲不全、捕獲偏差等現(xiàn)象；研究常見(jiàn)疾病的少見(jiàn)基因突變時(shí)需要的樣本量比較大。盡管如此，外顯子組測(cè)序技術(shù)依然是目前最高效、最經(jīng)濟(jì)、最省時(shí)的研究基因疾病的方法。隨著芯片技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，相信外顯子組測(cè)序可以更廣泛地應(yīng)用于相關(guān)疾病的診斷之中。

(基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目，No.ZR2016CM12；山東省高等學(xué)?？萍加?jì)劃項(xiàng)目,No.J17KB112，No.J16LE59；濰坊科技學(xué)院博士基金，No.2017BS03)