菌落的等效性模擬及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究

陳 玲，黃彥捷，周瑾艷，吳向壘，黃敏晗，許俊斌，羅旭東

(廣東省計(jì)量科學(xué)研究院 廣東省現(xiàn)代幾何與力學(xué)計(jì)量技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510405)

1 引 言

科研和檢測領(lǐng)域常用菌落計(jì)數(shù)器檢驗(yàn)食品、衛(wèi)生用品、臨床標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)量，需要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對其測量結(jié)果的一致性、準(zhǔn)確性及可比性進(jìn)行評價(jià)。然而菌落本身是不穩(wěn)定的，不方便攜帶，不適合用作菌落計(jì)數(shù)器計(jì)量校準(zhǔn)用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

菌落是指在固體培養(yǎng)基上生長，可以用肉眼識別的，由成千上萬相同的細(xì)菌組成的生長物。菌落的大小和形態(tài)和菌種息息相關(guān)。當(dāng)樣品被稀釋到一定程度并與培養(yǎng)基混合，在一定的培養(yǎng)條件下，每一個(gè)能夠生長繁殖的細(xì)菌細(xì)胞都能在培養(yǎng)基上形成可見的菌落[1]。菌落總數(shù)就是指在一定條件下每克(每毫升)樣品生長出的菌落總數(shù)。菌落總數(shù)測定可以用來判定食品被細(xì)菌污染的程度及衛(wèi)生質(zhì)量，反映了食品在生產(chǎn)過程中是否符合衛(wèi)生要求[2,3]。菌落數(shù)量、大小和形態(tài)標(biāo)志著食品衛(wèi)生質(zhì)量的優(yōu)劣[4，5]。

在日常檢驗(yàn)和科研領(lǐng)域，通常使用光學(xué)顯微鏡或是菌落計(jì)數(shù)器對菌落的大小、形態(tài)、邊緣、表面、質(zhì)地、顏色等性質(zhì)進(jìn)行分析[6,7]。其中菌落計(jì)數(shù)器廣泛用于食品、衛(wèi)生用品、臨床標(biāo)本中細(xì)菌數(shù)量的檢驗(yàn)。目前該儀器在各級衛(wèi)生防疫站、環(huán)境檢測站、食品衛(wèi)生監(jiān)督檢查所、化妝品和藥品檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室、醫(yī)院、大專院校及科研單位中被用于微生物菌落計(jì)數(shù)、抗生素抗菌性測試和菌種篩選等;然而在廣泛的應(yīng)用背景下，各儀器之間測量結(jié)果是否一致、可比，是否可以實(shí)現(xiàn)量值溯源就很大程度上影響到了儀器測量結(jié)果的有效性、可靠性和準(zhǔn)確性，因此亟需通過穩(wěn)定可溯源的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)對各類菌落計(jì)數(shù)器的計(jì)量校準(zhǔn)[8～12]。

但是由于真實(shí)菌落的體系復(fù)雜、穩(wěn)定性差，很難用來做標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行量值溯源傳遞和分析方法評價(jià)?，F(xiàn)有的評價(jià)方法往往不盡如人意。吳玉峰等[13]選取兩位長期從事微生物檢驗(yàn)工作的專業(yè)人員采用雙盲法對水樣中的菌落總數(shù)計(jì)數(shù)，取兩人計(jì)數(shù)值的平均數(shù)，與該儀器分析結(jié)果進(jìn)行對比驗(yàn)證;利用該方法，雖然每次可以通過平板計(jì)數(shù)法人工計(jì)數(shù)來驗(yàn)證菌落計(jì)數(shù)器測量的準(zhǔn)確性，但無法評價(jià)儀器精密度，且存在人為因素所產(chǎn)生的偏差。張春晨等[14]則采用枯黑芽孢制備菌片管，隨意抽取10%的樣品進(jìn)行檢測，制作質(zhì)控圖；但由于枯黑芽孢是生物活體，其菌落本身不穩(wěn)定，且不便攜帶，不適合做菌落計(jì)數(shù)器的質(zhì)控物。

根據(jù)菌落計(jì)數(shù)器的應(yīng)用，結(jié)合菌落的培養(yǎng)生長特性，借鑒計(jì)算機(jī)圖像法設(shè)計(jì)[15]，采用功能等效的模擬菌落作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，就可以實(shí)現(xiàn)菌落計(jì)數(shù)器的精確校準(zhǔn)、分析方法的有效評價(jià)以及分析質(zhì)量的精密控制。本文報(bào)道的模擬菌落標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(bacterial colony by plane)包括了用于校準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器示值誤差和示值重復(fù)性的模擬菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和一種用于校準(zhǔn)菌落計(jì)數(shù)器鑒別力的模擬菌落大小的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有4種，分別為36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU(CFU是colony-forming units的縮寫，菌落形成單位，指單位體積中的細(xì)菌群落總數(shù))。模擬菌落大小的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用影像測量儀進(jìn)行了準(zhǔn)確定值，擴(kuò)展不確定度為0.024 mm。

本文系統(tǒng)地介紹了標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原材料的選擇、特性量值的測量方法、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法、均勻性檢驗(yàn)、穩(wěn)定性考察以及定值過程[16];對模擬菌落標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了12個(gè)月的考察，證明該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是穩(wěn)定的。該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值準(zhǔn)確，均勻性、穩(wěn)定性良好，使用方便，已通過國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)評審，編號為GBW(E)130586～GBW(E)130590，有望作為量值傳遞的標(biāo)準(zhǔn)在生物、食品分析評價(jià)領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 儀器

Prismo Navigator 795 HTG影像測量機(jī)。影像測量機(jī)在使用前，首先用3等3級量塊和物鏡測微尺對所使用的儀器進(jìn)行檢定，確認(rèn)儀器處在正常的工作狀態(tài)，并保證儀器測量的溯源性。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

2.2.1 圖案設(shè)計(jì)

采用AutoCAD設(shè)計(jì)，根據(jù)實(shí)際使用情況，設(shè)計(jì)相應(yīng)的菌落模擬圖形。將模擬菌落最終成像在直徑為9 cm的膜片上。實(shí)際制作時(shí)，每批標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，每個(gè)圖形都成像500片，即每種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制作500份。

2.2.2 結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

使用高分辨率光繪機(jī)在感光膠片上根據(jù)模擬菌落圖形進(jìn)行曝光制作。采用高透光聚碳酸酯(PC)材料印刷銀鹽，構(gòu)成模擬菌落標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的膜片。膜片包括保護(hù)層、影像層、粘結(jié)層、片基、防光暈層和防靜電層(結(jié)構(gòu)如圖1所示)。

其中保護(hù)層含有紫外線吸收劑，為明膠薄膜，用于防止影像層所承載信息受光照而褪色以及保護(hù)影像層免于劃傷；影像層表面設(shè)有多個(gè)不透明斑點(diǎn)，不透明斑點(diǎn)采用銀鹽印刷技術(shù)固著于影像層表面，以斑點(diǎn)模擬菌落；影像層與片基通過粘結(jié)層相互粘連；片基為高透光透明的聚碳酸酯材料，作為校準(zhǔn)裝置的載體基材；防光暈層由吸光物質(zhì)、粘合劑組成，能吸收產(chǎn)生光暈的有害光線；防靜電層中含有防靜電劑以避免靜電聚集。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品定值

共選取2種特征量值對菌落進(jìn)行生物等效性模擬，分別為菌落總數(shù)及菌落大小。

2.3.1 模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

采用人工識別計(jì)數(shù)的方法，計(jì)數(shù)結(jié)果即為標(biāo)準(zhǔn)值。為消除測量時(shí)的個(gè)人差異，由實(shí)驗(yàn)室6名實(shí)驗(yàn)人員對3個(gè)膜片樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值為定值結(jié)果。計(jì)數(shù)時(shí)，將小的菌落放在視線的左上方;同時(shí)，為避免設(shè)計(jì)值的主導(dǎo)，應(yīng)使實(shí)驗(yàn)人員保持對設(shè)計(jì)值的未知狀態(tài)。

2.3.2 模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

隨機(jī)抽取10個(gè)膜片樣品，每個(gè)樣品采用影像測量機(jī)直接進(jìn)行測量，每個(gè)樣品測量3次，剔除異常值后，取10個(gè)樣品測量結(jié)果的平均值為最終定值結(jié)果。

2.4 均勻性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性是衡量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)性能的一個(gè)重要指標(biāo)，也是標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值能準(zhǔn)確傳遞的物質(zhì)基礎(chǔ)。隨機(jī)抽取一定數(shù)量的樣品，采用精密度高的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定;采用方差分析法來統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)樣品的均勻性;該方法是通過組間方差和組內(nèi)方差的比較來判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)性差異，如果二者的比小于統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)的臨界值，則認(rèn)為樣品是均勻的。

2.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性是指被定值的特性量隨時(shí)間變化的情況，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性受物理、化學(xué)和保存條件等因素的影響。需要用精密度高的分析方法對其進(jìn)行長時(shí)間的定期考察來確定相對的穩(wěn)定期限。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范，本著前緊后疏的原則，對模擬菌落標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了考察。每次隨機(jī)抽取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品上進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù)或是取6個(gè)大小一致的菌落，在不同的時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行比對測量,各量值測量3次取其平均值進(jìn)行穩(wěn)定性分析。

3 模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

通過等效性模擬菌落標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的兩個(gè)重要參數(shù)為菌落總數(shù)和菌落大小，運(yùn)用菌落計(jì)數(shù)器可以實(shí)現(xiàn)菌落數(shù)量的統(tǒng)計(jì)以及菌落大小的觀測。

3.1 圖形設(shè)計(jì)

依據(jù)GB 4789.2—2016《食品微生物菌落總數(shù)的測定》，一般選取30～300 CFU之間的平板進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)[17]，設(shè)計(jì)了模擬菌落總數(shù)分別為36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU的4種菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其圖案如圖2所示。其中，模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)值為36 CFU和120 CFU的2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)被設(shè)計(jì)為均勻大小，代表菌落均勻分布，大小基本一致，約為3.180 mm?？紤]到實(shí)際檢測中會碰到菌落大小不一并出現(xiàn)粘連的情況，因而設(shè)計(jì)的模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)值為180 CFU和290 CFU的2種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其菌落大小不一，分布不均勻，且模擬了典型的粘連情況。其中180 CFU標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的菌落直徑范圍為0.482～4.189 mm，290 CFU標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的菌落直徑范圍為0.407～3.193 mm。

圖2 模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)俯視圖Fig.2 Top view of the simulated bacterial colony counts reference materials

3.2 菌落總數(shù)的定值

由于設(shè)計(jì)的模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有良好的保護(hù)層，加工過程中也不會對模擬菌落個(gè)數(shù)產(chǎn)生影響,因而利用膜片設(shè)計(jì)的菌落總數(shù)均和每次實(shí)驗(yàn)人員計(jì)數(shù)結(jié)果相一致，均為設(shè)計(jì)值，分別為36 CFU、120 CFU、180 CFU和290 CFU。

3.3 均勻性及穩(wěn)定性檢驗(yàn)

當(dāng)分別從每種已經(jīng)編上號碼的菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中按照頭尾、中間編號隨機(jī)抽取15個(gè)樣品，目測識別計(jì)數(shù)時(shí)，模擬菌落總數(shù)計(jì)數(shù)也為設(shè)計(jì)值，說明該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性良好。

當(dāng)每次隨機(jī)抽取3個(gè)樣品，在不同的時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行比對測量，發(fā)現(xiàn)在長達(dá)12個(gè)月的觀察時(shí)間內(nèi)，模擬菌落總數(shù)計(jì)數(shù)均為設(shè)計(jì)值，說明該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性良好。

3.4 不確定度分析及最終定值

根據(jù)JJG 1006—94《一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范》的規(guī)定[18]，標(biāo)準(zhǔn)值的總不確定度由3部分組成: 第1部分為定值的標(biāo)準(zhǔn)不確定度分量ud，第2部分是不均勻產(chǎn)生的不確定度分量uj，和第3部分不穩(wěn)定產(chǎn)生的不確定度分量uw。

根據(jù)模擬菌落總數(shù)的定值數(shù)據(jù)，不同實(shí)驗(yàn)人員得到的定值數(shù)據(jù)是一致的。均勻性和穩(wěn)定性考察結(jié)果表明，2種實(shí)驗(yàn)條件下引入的不確定度分量可以忽略不計(jì)。但在使用過程中，可能由于使用磨損導(dǎo)致標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中直徑較小的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)識別不清，導(dǎo)致總數(shù)減少; 或者標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的拉劃損壞導(dǎo)致上機(jī)識別計(jì)數(shù)時(shí)菌落總數(shù)增加。

以總數(shù)為180 CFU的模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)為例，磨損可能導(dǎo)致最小的1個(gè)菌落計(jì)數(shù)時(shí)模糊，故由此引入的不確定度為：

因此，模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對擴(kuò)展不確定度為：

Urel=0.55%×2=1.1%

4種模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的最終定值結(jié)果為：

36 CFU:Urel=1%,k=2；

120 CFU:Urel=2%,k=2；

180 CFU:Urel=2%,k=2；

290 CFU:Urel=2%,k=2。

3.5 實(shí)際應(yīng)用

該系列模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已獲得國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)認(rèn)證，編號為GBW(E)130586～GBW(E)130589，并且已經(jīng)應(yīng)用到了檢測和科研領(lǐng)域菌落計(jì)數(shù)器的實(shí)際校準(zhǔn)當(dāng)中。圖3是利用模擬菌落總數(shù)為180 CFU的菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對某品牌菌落計(jì)數(shù)器校準(zhǔn)時(shí)的成像結(jié)果，儀器可以識別所有模擬菌落，實(shí)現(xiàn)對計(jì)數(shù)結(jié)果的準(zhǔn)確評估。

圖3 模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于儀器校準(zhǔn)結(jié)果Fig.3 The result of calibration using the simulated bacterial colony counts reference materials

4 模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

4.1 圖形設(shè)計(jì)

根據(jù)市面上常見的菌落計(jì)數(shù)儀示值分辨力一般不大于0.4 mm，即可以識別最小菌落的直徑不超過0.4 mm，設(shè)計(jì)了圖案如圖4所示的模擬菌落大小的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，模擬菌落總數(shù)為120 CFU，圖案中包含了0.1～5.0mm直徑范圍的模擬菌落，也涉及到了常見的2個(gè)或多個(gè)菌落的粘連情況模擬。利用影像測量儀進(jìn)行了精確直徑定值，特性值如表1所示。需要說明的是圖4中菌落的位置與表1中的數(shù)值一一對應(yīng)，表1中以從上端開始的各行中的左數(shù)位號表示，如3-1表示第3行中左數(shù)第1個(gè)模擬菌落，4-6表示第4行中左數(shù)第6個(gè)模擬菌落。

圖4 模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)俯視圖Fig.4 Top view of the simulated bacterial colony sizes reference materials

4.2 菌落大小的定值

由于設(shè)計(jì)的模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有良好的保護(hù)層，加工過程中也不會對模擬菌落大小產(chǎn)生影響,因而菌落大小尺寸均接近設(shè)計(jì)值，共含有120種不同直徑的菌落，具體結(jié)果見表1。

在均勻性、穩(wěn)定性及不確定度分析時(shí)，為簡明起見，將以模擬菌落的1個(gè)代表性尺寸的分析為例來說明。

4.3 均勻性檢驗(yàn)

從已編號的500份標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中按照頭尾、中間編號隨機(jī)抽取15個(gè)樣品，以大小為2.681 mm(6-2位置)的模擬菌落為代表;用影像測量機(jī)進(jìn)行定值測量，每個(gè)菌落測量3次，取平均值作為均勻性評價(jià)的測量結(jié)果。測定結(jié)果如表2所示。

表1 模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性量值及標(biāo)準(zhǔn)偏差Tab.1 The value and standard deviation of the reference materials stimulated bacterial colony sizes mm

表2 模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)Tab.2 The homogeneity of the simulated bacterial colony sizes reference materials mm

95%的置信概率下采用方差分析考察樣品的均勻性[19,20]，計(jì)算結(jié)果表3所示。表中：SS為標(biāo)準(zhǔn)方差；df為自由度；MS為平均方差；F為F值；Sig.F為F的臨界值。由表3中數(shù)據(jù)可得：

Sig.F=Fα(14,30)=2.04,α=0.05

(1)

F

表3模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性結(jié)果方差分析
Tab.3The Homogeneity and variance analysis results of the simulated bacterial colony sizes reference materials

差異源SSdfMSFSig.F組間2.91×10-4142.08×10-51.512.04組內(nèi)4.14×10-4301.38×10-5總計(jì)7.05×10-444

均勻性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差SH可由式(2)和式(3)求得。

=2.333×10-6

(2)

(3)

4.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

每次隨機(jī)抽取3個(gè)樣品，每個(gè)樣品上取6個(gè)大小一致的菌落，在不同的時(shí)間間隔內(nèi)進(jìn)行比對測量，仍舊以大小為2.681 mm(6-2位置)的模擬菌落為代表，測量3次取平均值進(jìn)行穩(wěn)定性分析，具體數(shù)據(jù)如表4所示。因沒有一種物理/化學(xué)模型能夠真實(shí)地描述該候選標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性變化機(jī)理，故采用直線作為經(jīng)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

將表4中數(shù)據(jù)，以x代表時(shí)間，以y代表菌落直徑，擬合成一條直線，利用評估最后的回歸方差來判斷樣品的穩(wěn)定性。

表4 模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)Tab.4 The stability of the simulated bacterial colony sizes reference materials mm

由分析數(shù)據(jù)得到線性模型的斜率為：

(4)

則線性方程的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

(5)

S=4.59×10-3，則斜率的不確定度：

(6)

在自由度為n-2和p=0.95(95%置信水平)時(shí)，查表得t因子等于2.75

t0.95,n-2·S(b1)=2.75×4.75×10-4

=1.31×10-3

(7)

經(jīng)計(jì)算可得|b1|

4.5 不確定度分析

模擬菌落大小的不確定度來源包括定值引入的不確定度、均勻性引入的不確定度、穩(wěn)定性引入的不確定度以及溫度變化引入的不確定度。

4.5.1 定值引入的不確定度

定值采用影像測量儀，故模擬菌落直徑定值不確定度來源包括影像測量儀測量引入的不確定度和儀器測量重復(fù)性引入的不確定度。

影像測量儀的測量不確定度：一是平臺移動(dòng)的示值誤差引入的不確定度，二是鏡頭誤差引入的不確定度。平臺移動(dòng)誤差根據(jù)儀器的校準(zhǔn)為±1 μm，引入的不確定度為

鏡頭誤差引入的不確定度包含尺寸測量誤差即長度測量誤差引入的不確定度和圓度測量誤差即鏡頭的畸變引入的測量不確定度。

尺寸測量誤差根據(jù)校準(zhǔn)證書為±1.5 μm，由此引入的不確定度為：

合成上述不確定度分量，由影像測量儀測量引入的不確定度為：

=0.001 4 mm

(8)

重復(fù)測量10次大小為2.681 mm的模擬菌落尺寸，測量值分別為：2.6759 mm，2.6813 mm，2.6864 mm，2.6843 mm，2.6817 mm，2.6784 mm，2.6773 mm，2.6718 mm，2.6738 mm，2.6809 mm。10次測量值的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.004946mm，則示值重復(fù)性引入的不確定度為：

定值引入的不確定度為：

=3.13×10-3mm

(9)

4.5.2 均勻性產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)不確定度

根據(jù)均勻性檢驗(yàn)部分的計(jì)算結(jié)果看，不均勻性所產(chǎn)生的標(biāo)準(zhǔn)偏差需要合成到定值最終不確定度中。故樣品間不均勻的標(biāo)準(zhǔn)偏差：

uj=SH=1.53×10-3mm

(10)

4.5.3 穩(wěn)定性引入的不確定度

采用評估穩(wěn)定性的回歸方差分析表來進(jìn)行估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度。有效期t為 12個(gè)月的長期穩(wěn)定性的不確定度貢獻(xiàn)為：

uw=S(b1)·t=0.000 475×12 mm

=5.70×10-3mm

(11)

4.5.4 溫度變化引入的不確定度

塑料的膨脹系數(shù)為1.8×10-4mm/K，存放或運(yùn)輸環(huán)境溫度變化為±20 ℃，因此溫度變化引入的不確定度分別為：uT=2.681×1.8×10-4×20 mm=9.65×10-3mm。

4.5.5 合成不確定度

=[(3.13×10-3)2+(1.53×10-3)2+

(5.70×10-3)2+(9.65×10-3)2]1/2mm

=1.17×10-2mm

(12)

取k=2，按不確定度計(jì)算中的最大值，則擴(kuò)展不確定度為:U=1.17×10-2×2 mm≈0.024 mm。其余119個(gè)模擬菌落的不確定度也包含上述4種不確定度分量，計(jì)算過程就不在本文中敘述。該模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已獲得國家二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)認(rèn)證，編號為GBW(E)130590，具體參數(shù)可查詢相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書。

4.6 實(shí)際應(yīng)用

該模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)也已經(jīng)應(yīng)用到了檢測、科研領(lǐng)域菌落計(jì)數(shù)器的實(shí)際校準(zhǔn)當(dāng)中。圖5是利用該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對某品牌菌落計(jì)數(shù)器校準(zhǔn)時(shí)的成像結(jié)果，利用儀器對不同大小的模擬菌落均可進(jìn)行識別分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)了對儀器示值誤差和示值分辨力的準(zhǔn)確評估。

圖5 模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于儀器校準(zhǔn)結(jié)果Fig.5 The result of calibration using the simulated bacterial colony sizes reference materials

5 結(jié) 論

基于對菌落等效性模擬的思路，采用AutoCAD設(shè)計(jì)模擬菌落的圖像，并成像在直徑為9 cm處理的高透光聚碳酸酯(PC)膜片上，添加防靜電、光暈和刮劃傷保護(hù)層，制備了一系列模擬菌落標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并進(jìn)行了均勻性、穩(wěn)定性考察及不確定評估。

(1)對模擬菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用人工計(jì)數(shù)的方法得到標(biāo)準(zhǔn)值，不同的人員可以得到穩(wěn)定一致的總數(shù)值，穩(wěn)定性和均勻性良好。

(2)對模擬菌落大小標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，采用影像測量儀測量定值，進(jìn)行了均勻性和穩(wěn)定性考察，并準(zhǔn)確分析了每一個(gè)模擬菌落的直徑不確定度。

對該系列模擬菌落標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行了開發(fā)，目前，該系列模擬標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)已經(jīng)得到實(shí)際應(yīng)用，并獲得滿意結(jié)果。該系列標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于菌落計(jì)數(shù)器的校準(zhǔn)、分析方法評價(jià)等方面，有望在食品安全、生物監(jiān)測領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。