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    紅細胞無效輸注判定檢測技術研究新進展*

    2020-04-20 11:22:00袁君王偉李娜欒建鳳
    臨床輸血與檢驗 2020年2期
    關鍵詞:補體血型亞型

    袁君 王偉 李娜 欒建鳳

    輸血是臨床重要的搶救手段和治療方式,隨著分離技術的發(fā)展,成分輸血已經在臨床普及開來,紅細胞懸液作為最為重要、用量最大的血液成分,無效輸注的情況也占有很大比例,既浪費了寶貴的血液資源,又影響了患者的治療[1]。所以,我們必須要根據患者的病情制定合理的用血計劃,特別要關注輸血后的效果。目前,評價紅細胞輸注效果的標準主要是根據血紅蛋白Hb上升情況和溶血產物增加來制定的,血紅蛋白未增加到預期值、溶血產物大量增加均視為紅細胞輸注無效。為了確保患者的輸注效果,明確輸注無效的原因尤為重要,紅細胞輸注無效的原因主要包括免疫和非免疫因素,非免疫因素包括紅細胞質量、手術外傷、藥物毒理、輻射化療等,免疫因素主要包括:紅細胞代謝產物、特殊血型物質、特殊抗體及其他體內免疫復合物,且由這些免疫因素引起紅細胞輸注無效更加難以判定。因此本文旨在為臨床處理紅細胞輸注無效的現(xiàn)象并形成判定紅細胞輸注無效的實驗規(guī)范提供理論參考和依據。

    1 無效輸血的定義及輸血效果評價標準

    1.1 無效輸血的定義:按八省市無效輸血協(xié)作組的試行標準,具體為輸全血或紅細胞制劑后24 h內,復查Hb值,若排除繼續(xù)失血、輸液稀釋等情況,該值升高未達到預期值者則判斷為無效輸注[2]。

    1.2 輸血效果評價標準

    1.2.1 血紅蛋白(Hb) 升高預期值判定:由血紅蛋白(Hb)是否達到預期值來直接判斷輸血效果。一名體重為55~65 kg、 Hb 110~130 g/L的供血者,400 mL全血中Hb應為44~52 g,同等體重的受血者每輸注2單位紅細胞,外周血血紅蛋白至少升高10 g/L[1,3]。

    其中:①輸入量以全血為標準,各種紅細胞制劑折算為對應原料全血量;②兒童按0.09 L/kg計算;③90%為檢驗誤差。

    1.2.2 游離血紅蛋白及膽紅素的測定:通過判定是否存在溶血產物而間接判定輸血效果的方法。當血管內發(fā)生溶血時,紅細胞被破壞,其中的血紅蛋白釋放到血液中,血漿游離血紅蛋白會明顯升高,嚴重者可見血紅蛋白尿。血紅蛋白進一步被單核吞噬系統(tǒng)吞噬處理,分解為游離膽紅素、直接膽紅素、總膽紅素,故游離血紅蛋白和膽紅素可間接反映紅細胞輸注無效的程度,其中游離膽紅素最先升高[4]。

    2 紅細胞無效輸注的判定試驗 紅細胞輸注無效是一種由于免疫因素或非免疫因素引起紅細胞破壞過多,可造成機體發(fā)生溶血反應,使得溶血產物增加、血紅蛋白無法升高到預期值的現(xiàn)象,因此,溶血成為判斷紅細胞輸注無效發(fā)生的主要特征。實驗室判定試驗根據造成溶血的原因可歸為三類,一是檢測紅細胞代謝產物,如含鐵血黃素、膽紅素、觸珠蛋白等;二是檢測特殊血型,如ABO亞型抗體、非ABO亞型抗體篩查等;三是相關免疫物質如特殊抗體等。

    2.1 紅細胞代謝產物測定試驗

    2.1.1 含鐵血黃素檢測試驗:血管內溶血時,逸出的紅細胞被巨噬細胞吞噬并降解,產物Fe3+可與蛋白質結合成為粗大的棕黃色鐵蛋白顆粒,即含鐵血黃素。組織內出血時游離血紅蛋白經腎臟排出,并被腎小管上皮重吸收,而當大量紅細胞被破壞時,腎小管上皮細胞無法完全清除游離血紅蛋白,含鐵血黃素即隨尿液排出[5]。含鐵血黃素是一種含鐵質的棕色色素,利用HE染色法染色后鏡下觀察呈棕黃色具有折光型的粗大顆粒,而利用普魯士藍染色法即酸性條件下,亞鐵氰化鉀溶液使Fe3+從蛋白質中分離出來,與亞鐵氰化鉀反應,生成藍色化合物[6]。正常人呈陰性,有分散或成堆藍色閃光顆粒(直徑1~3 μm)即為陽性,提示為血管內溶血。

    2.1.2 血漿結合珠蛋白試驗:結合珠蛋白又稱觸珠蛋白,是血清α2球蛋白中的一種酸性糖蛋白,與游離血紅蛋白形成Hp-Hb復合物,將Hb運送至肝臟代謝,以避免Hb對腎臟的損傷。當游離血紅蛋白產生過多時,結合珠蛋白被利用過多,使得血漿中的含量減少,是血管內溶血的敏感性指標。觸珠蛋白的量可通過流式細胞術和雙抗體夾心法酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測[7]。紅細胞大量破壞時,Hp濃度降低,提示機體發(fā)生溶血反應。

    2.1.3 血紅蛋白尿:血紅蛋白在紅細胞中起到攜氧的作用,正常尿液中是沒有血紅蛋白的,但是當發(fā)生血管內溶血時,血漿中血紅蛋白濃度增高超過了結合珠蛋白的結合能力,使得血漿游離血紅蛋白增多,超過腎臟濾過和重吸收能力后即發(fā)生血紅蛋白尿[8,9]。顯微鏡鏡檢是直接對尿液沉渣進行紅細胞計數(shù)。干化學法利用過氧化氫使血紅蛋白中的血紅素氧化呈色,通過尿液分析儀分析檢測[10]。免疫膠體金法利用單克隆和多克隆抗體特異的與人血紅蛋白發(fā)生顯色反應,具有較高的靈敏度且特異性高,結果穩(wěn)定,陽性率高[11]。鏡檢陽性、尿液分析儀血紅蛋白值升高或膠體金法陽性即提示溶血。

    2.1.4 膽紅素測定:紅細胞死亡或破壞后,膽紅素被釋放經肝臟代謝經腸道排出。而當紅細胞破壞過多時,肝臟無法完全清除膽紅素使血液中膽紅素含量增高[12,13]。重氮法是利用膽紅素可在加速劑的作用下與重氮苯磺酸發(fā)生顯色反應,加入終止劑后使反應物變?yōu)樗{色,利用分光光度計讀取并計算數(shù)值[14]。膽紅素氧化酶法是指在不同pH環(huán)境中,膽紅素氧化酶可將膽紅素氧化成膽綠素繼續(xù)被氧化成淡紫色物質,分光光度計進行檢測。經皮膽紅素測定法是利用皮下組織中膽紅素和血紅蛋白對光波吸收的原理經皮膚檢測[15,16];高效液相色譜法可利用膽紅素各組分保留時間及吸收光譜不同對膽紅素各種成分進行測定。質譜分析法則是結合分子質量、分子結構和解離電荷特性來分析并完成檢測,質譜法檢測準確、特異,但是還不能夠檢測出膽紅素的Bd(δ-膽紅素)成分[17]。膽紅素值升高即為有溶血現(xiàn)象發(fā)生。

    2.2 特殊血型測定

    2.2.1 ABO亞型抗體:ABO亞型主要表現(xiàn)為抗原的減弱或者存在ABO不規(guī)則抗體,在血型血清學檢測中容易漏檢造成血型的誤定,使患者發(fā)生紅細胞輸注無效以及嚴重的輸血反應。血清學方法是利用抗原抗體特異性反應產生肉眼可見的凝集現(xiàn)象[18],方法簡便、快速,但是由于靈敏度低、操作的標準化程度低等,僅僅憑借血清學方法可能無法準確的判斷血型。分子生物學檢測技術是利用突變的核苷酸序列來判定血型,該技術可以彌補血清學的不足之處,但是基因鑒定ABO血型多是以單核苷酸多態(tài)性為基礎的,而同一種亞型對應多種基因型,單一位點的核苷酸多態(tài)性無法反應整個ABO基因所攜帶的信息,這就要求核苷酸多態(tài)性位點必須與ABO的基因型具有較高的相關性,另外,A、B抗原的表達依賴于其共同的前體物質H,H抗原的表達依賴于FUT1基因,當FUT1基因異常時,H抗原減弱或者缺失,導致無法正常表達A、B抗原[19]。所以,利用基因全序列檢測結合血清學檢測的方法才能確定血型是否誤定,抗原是否漏檢[20]。血清學方法出現(xiàn)凝集反應或基因檢測出相應的核苷酸序列即為存在特殊血型抗體,從而造成溶血反應。

    2.2.2 非ABO血型抗體:不規(guī)則抗體是指抗-A、抗-B以外的血型抗體,分為IgG和IgM類。這些抗體會影響血型鑒定、交叉配血、紅細胞輸注效果,甚至會引起嚴重的輸血反應。目前,檢測方法包括鹽水法、酶介質法、抗人球蛋白法、凝聚胺法以及微柱凝膠法等[21]。鹽水法只能檢測出IgM類不規(guī)則抗體,而IgG類由于分子量較小無法肉眼觀察;酶介質法對Rh,Kidd系統(tǒng)抗原較敏感,但會破壞MNSs系統(tǒng),易造成此系統(tǒng)不規(guī)則抗體漏檢,且酶不穩(wěn)定,容易失活,此法不適合大規(guī)模獻血員的篩查;抗人球蛋白法敏感性高、特異性強且凝集反應明顯,但操作過于繁瑣;凝聚胺法對Rh系統(tǒng)不規(guī)則抗體的檢出具有很高的靈敏度,但是對于其他系統(tǒng)的檢測敏感性差,低濃度抗體易漏檢;微柱凝膠法操作簡便、重復性好、準確度高,但需要孵育箱和離心機[22]。

    2.3 相關免疫物質檢測

    2.3.1 調節(jié)性T細胞和T淋巴細胞亞群:有研究表明異體輸血主要抑制T細胞免疫活性,并指出具有抑制T細胞免疫活性的調節(jié)性T細胞亞群CD4+CD25+Treg在免疫細胞功能及自身免疫耐受和移植中都發(fā)揮著重要的作用,紅細胞輸注無效患者輸血后檢查外周血CD3+T細胞和CD3+CD4+T細胞明顯增加,而CD4+CD25+Treg較輸血前明顯下降,這說明紅細胞輸注無效患者輸血后出現(xiàn)免疫系統(tǒng)過度活化現(xiàn)象,加之調節(jié)性T細胞減少,不能有效抑制這種活化現(xiàn)象,使紅細胞加速破壞[23]。ELISA法利用酶標記抗原或抗體,與相應的抗體或抗原發(fā)生特異性反應,加入底物后被酶催化發(fā)生顯色反應,可根據顏色深淺對檢測物質定量。流式細胞技術將熒光染料結合于單克隆抗體上并與相應的抗原發(fā)生特異性反應后在激光照射后,抗原抗體復合物就會發(fā)出不同光譜的繼發(fā)熒光,熒光量轉化為電信號,即為抗原量,該技術檢測時間短、敏感度高,較低量也能夠檢出,但是價格較高[4]。CD4+CD25+Treg明顯下降,提示輸血后患者免疫系統(tǒng)過度活化,紅細胞破壞增加。

    2.3.2 IgG亞型檢測:IgG是血清中最主要的抗體類型,約占血清總免疫球蛋白的75%-80%,發(fā)揮著重要的免疫學效應。人類IgG分為IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四種亞型,分別占血清中的60%-70%,15%-20%,5%-10%,<5%,不同的亞型對相對應的Fc受體的親和力不同。巨噬細胞通過FcRII和FcRIII識別致敏紅細胞,IgG1、IgG3對FcRIII結合能力較強,且IgG3更強,故IgG1和IgG3更易引起紅細胞破裂。檢測IgG1、IgG3含量ELISA法利用包被有抗人IgG亞型的單克隆抗體固相微孔板來捕捉血清中相應的IgG亞型,再用辣根過氧化物酶標記的單克隆抗人IgG抗體檢測結合于微孔板上的IgG亞型,加入底物后讀取OD值,利用標準曲線計算IgG亞型含量,但操作復雜,相關試劑較昂貴。微柱凝膠法將抗原抗體特異性反應與分子篩技術相結合,當受檢者紅細胞與相應的IgG亞型單抗發(fā)生反應經離心后,無法通過凝膠間隙而被留在凝膠上部或者分散在中間,此法靈敏度高,操作簡便,反應時間短,實用性強[24]。ELISA法測定IgG1、IgG3含量或者微柱凝膠法根據凝集強弱判斷IgG1、IgG3含量升高即存在此類亞型,使得機體發(fā)生溶血反應。

    2.3.3 總溶血補體(CH50)水平:補體是一種存在于人和動物血清中的具有酶活性的蛋白質,在機體受到刺激后可被激活,影響其免疫調節(jié)功能。經典方法是利用致敏的綿羊紅細胞在檢測者的血清中將補體激活,使綿羊紅細胞溶血,溶血程度與補體數(shù)量和功能相關,當50%溶血狀態(tài)時,溶血對補體活性變化最敏感,即用50%的溶血程度反應補體活性,經典溶血法是一種能夠準確、敏感的反應補體功能的實驗,但是要求致敏的綿羊紅細胞必須是新鮮的,且耗時長。目前臨床最常用脂質體免疫法檢測補體活性,脂質體包裹有葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和對氨基苯酚,在血清中補體被激活后,脂質體被破壞釋放出G-6-PDH,該物質可與底物發(fā)生顯色反應,利用酶標檢測儀在340 nm處讀取吸光度根據標準曲線計算補體活性,脂質體免疫檢測法以其操作簡便,快速,不需致敏綿羊紅細胞,影響因素小,可自動化分析的特點已經逐步運用于臨床[25]。發(fā)生溶血反應即過度激活補體系統(tǒng),補體成分消耗過多,血清中補體活性下降。

    2.3.4 HLA抗體:HLA抗原廣泛存在于有核紅細胞表面,當輸注全血、紅細胞懸液、血小板等血液成分時都有可能發(fā)生HLA不合導致的非溶血性輸血反應,造成輸血效果不佳的情況,并且HLA抗體的產生與輸血次數(shù)相關,有研究表明反復輸血的患者產生HLA的頻率可達到50%。補體依賴細胞毒實驗即待檢血清中的抗-HLA能夠與淋巴細胞上的HLA抗原相結合,進一步激活補體級聯(lián)反應使淋巴細胞死亡,通過染色觀察細胞的死亡情況以確定相應抗原或抗體。ELISA法是樣本血清與包被抗原反應后與帶有酶標記的二抗反應,在顯色劑的作用下發(fā)生顏色反應,顏色與待檢物質呈正比,根據標準曲線得到相應數(shù)值。流式細胞術是將HLA抗原包被在不同磁珠表面,待檢血清中若有與此抗原結合的特異性抗-HLA,則抗原抗體復合物繼續(xù)與熒光標記的二抗反應用流式細胞儀檢測。基因分型技術近年來也發(fā)展迅速,通過HLA核苷酸序列測定法、液相芯片技術等來實現(xiàn)[26]。ELISA陽性、流式檢測到相應細胞群或基因檢測到相關序列即提示有溶血反應發(fā)生。

    3 紅細胞輸注無效檢測新技術

    3.1 熒光探針法檢測NO水平:NO是一種不穩(wěn)定的生物自由基,除了能夠保持紅細胞變形性、減少紅細胞凋亡以外,在血液循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的生理作用,包括松弛血管平滑肌,擴張微小血管;神經遞質作用和介導細胞免疫反應三大作用[27]。當紅細胞破壞過多,血漿內游離血紅蛋白含量增加,使得機體內NO減少,從而降低血管內皮中的NO利用率,造成內皮功能障礙,血小板及凝血因子活化等現(xiàn)象的發(fā)生。NO目前選擇用NO熒光探針法檢測其熒光強度[28]。NO表達量減少可提示發(fā)生溶血。

    3.2 單核細胞單層實驗:在國外已作為臨床診斷新生兒溶血病的一個常規(guī)輔助診療手段,此法是通過體外單核細胞吞噬抗體致敏后的紅細胞的情況來檢測病人血漿中是否存在使紅細胞破壞的抗體,并且可預估該抗體在體內引起溶血程度的強弱。模擬體內致敏紅細胞免疫過程的MMA實驗更準確的反映了體內紅細胞被破壞的程度,且能夠預測和分析體內的溶血情況,但是操作較復雜[29]。油鏡下觀察200~600個單核細胞,計數(shù)發(fā)生吞噬和粘附的單核細胞,計算其占單核細胞總數(shù)的百分比PI值和陽性對照的PI值,當樣品的PI值和陽性對照的PI值之比≥5%時提示可能發(fā)生溶血反應,而≤5%時則說明發(fā)生溶血反應的可能性較小。

    4 結語 紅細胞的輸注無效應與紅細胞輸注的不良反應引起人們同樣的關注,而了解引起輸注無效的原因更是解決發(fā)生此現(xiàn)象的重中之重。無效輸注的標準早已制定,但是相關原因的判定試驗卻未曾報道,對紅細胞代謝產物、特殊血型、相關免疫物質三個方面的檢測判定試驗進行總結,并提出能夠反映輸注無效的新指標,希望能夠形成一套無效輸注的鑒定方法,并據此找出此現(xiàn)象發(fā)生的原因,幫助患者提高輸注效果。本文綜述了幾個用于判定無效輸注的直接或間接相關指標,而如何用于評估無效輸注現(xiàn)象目前并未達成共識,因此仍需要大樣本的臨床研究來進一步證實上述指標對無效輸注判定的準確性和有效性,再次篩選、優(yōu)選出更客觀的判定指標。近年來,隨著紅細胞儲存損傷、紅細胞免疫等研究的不斷深入,加上臨床患者復雜的病理生理狀態(tài),如何針對不同病人選擇相應的實驗或指標進行無效輸注的判定,如何針對無效輸注的原因進行臨床干預并制定精準輸血治療方案,這將是我們繼續(xù)研究和探討的方向,以期為臨床提供處理紅細胞無效輸注合理的、規(guī)范的流程,并指導臨床合理、科學和安全用血。

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