HMMR-AS1介導(dǎo)EMT在宮頸癌順鉑耐藥中的作用*

舒琪 馬輝平 樊陽陽 楊雅榮

宮頸癌（cervical cancer，CC）是我國乃至全球最常見的婦科腫瘤之一[1-4]，在女性腫瘤發(fā)病率中居第二位，2018年全球新發(fā)乳腺癌病例約57萬例，死亡病例約31萬例[3]。我國每年約13萬新發(fā)病例，其中5.3萬人將會因為宮頸癌死亡[5]。宮頸癌是一個嚴(yán)重威害女性健康的惡性腫瘤，其高死亡率的主要原因之一即為化療耐藥。文獻(xiàn)報道HMMR-AS1（hyaluronan mediated motility receptor- antisense 1）定位于人類染色體5p34，全長1 269 bp，且其表達(dá)量在乳腺癌人群中與其互補(bǔ)基因HMMR成正相關(guān)，敲低HMMRAS1能夠下調(diào)HMMR的表達(dá)，進(jìn)而影響乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[6]，且能夠通過介導(dǎo)EMT在上皮性卵巢癌耐藥[7]，但是尚未見到其在宮頸癌中所起作用的報道。本研究通過系列細(xì)胞及分子生物學(xué)實驗驗證了HMMR-AS1介導(dǎo)EMT在宮頸癌耐藥中所起作用，現(xiàn)報道如下。

材料與方法

1 研究對象 本研究所用到的63例宮頸癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織標(biāo)本均為2010年1月～2014年12月收集于本院婦科，追蹤隨訪時間最短5個月，最長57個月，且均有追蹤隨訪資料。平均年齡（56.8±11.7）歲。患者相互之間不存在血緣關(guān)系，詳見表1。

2 細(xì)胞與試劑 宮頸癌細(xì)胞系Hela購買自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。所用培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基，含10%胎牛血清，培養(yǎng)環(huán)境為37℃，5% CO2，飽和濕度。細(xì)胞裂解液TRizol購買自Life Technologies公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購買于TAKARA公司。胎牛血清購買于逍鵬生物公司（Biological Industries，Israel）；8μm孔徑transwell小室購買于CORNING公司；HMMR-AS1過表達(dá)質(zhì)粒訂購于吉凱公司，轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購買于Invitrogen公司；引物訂購于上海生工。氟尿嘧啶及順鉑訂購于逍鵬生物公司。E-cadherin抗體、vimentin 抗體、GAPDH 均從ABCAM公司購買。LV201過表達(dá)載體及空白對照載體購買自復(fù)能基因公司。

3 qPCR 采用TRizol法提取腫瘤組織及對應(yīng)癌旁正常組織totalRNA，并使用TAKARA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser）反轉(zhuǎn)錄制備cDNA文庫；使用ABI 7500 PCR儀進(jìn)行實驗，qPCR Mix 選用SYBR Green PCR Master Mix，反應(yīng)體系根據(jù)其說明書配置，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行分析；使用ACTB作為內(nèi)參基因，基因相對表達(dá)量以癌組織表達(dá)量高于對應(yīng)癌旁正常組織為高表達(dá)，反之為低表達(dá)。

4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗 本研究擬通過慢病毒載體轉(zhuǎn)染升高HMMR-AS1在宮頸癌細(xì)胞中的表達(dá)水平和增強(qiáng)細(xì)胞遷移的能力，并且檢測其對常見化療藥物（例如：順鉑） 敏感性的影響。轉(zhuǎn)染所用試劑為Lipofectamine 3000（Invitrogen），操作步驟嚴(yán)格按照其說明書篩選穩(wěn)定高表達(dá)該lncRNA的細(xì)胞株用于后續(xù)檢測。

5 CCK-8實驗 取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期細(xì)胞用于此實驗。實驗中，取胰蛋白酶消化重懸后的細(xì)胞計數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種200個細(xì)胞，每組設(shè)置5個平行孔；接種5個96孔板用于不同時間點（0 h，24 h，48 h，72 h，96 h）加入CCK-8試劑后在450 nm波長下檢測其吸光度值，吸光度值愈高則表示孔內(nèi)細(xì)胞越多。

6 化療藥物敏感性實驗 取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，加入化療藥物后，檢測各組細(xì)胞的生長情況，通過HMMR-AS1表達(dá)水平的高低考察其對化療藥物敏感性差異的影響。實驗中，取胰蛋白酶消化重懸后的細(xì)胞計數(shù)，接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔接種2×104個細(xì)胞，每組設(shè)置5個平行孔；按對數(shù)濃度梯度設(shè)置化療藥物（5-FU、順鉑）的濃度梯度加藥，常規(guī)培養(yǎng)24小時后PBS清洗96孔培養(yǎng)板，加入含20%CCK-8試劑的培養(yǎng)基，2小時后在450 nm波長下檢測其吸光度值，吸光度值愈高則表示孔內(nèi)細(xì)胞越多。

7 Western blot實驗 取轉(zhuǎn)染后處于對數(shù)生長期細(xì)胞用于此實驗，采用Western blot進(jìn)行分析[8]。

8 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用實驗SPSS13.0軟件，采用配對t檢驗分析癌組織和對應(yīng)癌旁正常組織中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平的差異，采用卡方檢驗和獨立樣本t檢驗分析不同宮頸癌患者臨床特征及疾病進(jìn)展中l(wèi)ncRNA表達(dá)水平的差異，采用K-M法繪制生存曲線，用log-rank檢驗不同組患者生存時間之間的差異。采用獨立t檢驗分析細(xì)胞遷移和侵襲能力差異；采用重復(fù)測量的方差分析方法分析細(xì)胞增殖能力的差異（CCK-8實驗及化療藥物敏感性實驗）。所有檢驗均為雙側(cè)檢驗，α=0.05，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 HMMR-AS1在宮頸癌組織中高表達(dá) 本次研究采用qPCR檢測了所有63對宮頸癌-癌旁正常組織，癌組織中的表達(dá)量顯著高于對應(yīng)癌旁正常組織，平均達(dá)1.74倍（Mean±SD，0.013 2±0.021 6 vs. 0.007 6±0.010 3，P=0.03，P＜0.01），見圖1。

圖1 HMMR-AS1在宮頸癌中高表達(dá)

2 HMMR-AS1表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床特征之間的關(guān)系 分析HMMR-AS1表達(dá)水平與宮頸癌患者臨床特征之間的關(guān)系可見，HMMR-AS1高表達(dá)與宮頸癌患者腫瘤分期（P=0.031）、是否原位癌（P=0.004）、是否淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.047）、是否遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移（P=0.033）、是否化療（P=0.007）有關(guān)，見表1。

3 HMMR-AS1高表達(dá)與宮頸癌患者生存期縮短相關(guān) 本研究進(jìn)一步分析了HMMR-AS1表達(dá)量與宮頸癌患者生存隨訪資料之間的關(guān)系，將本研究患者分為HMMR-AS1高表達(dá)組和低表達(dá)組，使用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，使用Log-rank檢驗兩組間生存率的差異，結(jié)果顯示，HMMR-AS1低表達(dá)組中位生存時間為39個月，高表達(dá)組中位生存時間為26個月，組間總生存率（overall survival，OS）差異有統(tǒng)計學(xué)意義，HMMR-AS1高表達(dá)組OS明顯低于HMMR-AS1低表達(dá)組（χ2=7.31，P=0.006 9；見圖2）。

4 成功篩選穩(wěn)定高表達(dá)HMMR-AS1的Hela細(xì)胞系 本研究通過慢病毒感染成功篩選穩(wěn)定高表達(dá)HMMRAS1的Hela細(xì)胞系，通過熒光照片確認(rèn)轉(zhuǎn)染成功 （見圖3），并通過實時熒光定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)細(xì)胞系中HMMR-AS1的相對表達(dá)量顯著高于空白對照組 （P=0.000 2，見圖4）。

5 高表達(dá)HMMR-AS1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖 本研究通過MTT實驗驗證了高表達(dá)HMMR-AS1后對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響。通過重復(fù)測量的方差分析，結(jié)果顯示：當(dāng)細(xì)胞增殖48 h以后，高表達(dá)細(xì)胞系增殖速度明顯較對照細(xì)胞快。轉(zhuǎn)染后0 h，24 h，48 h，72 h，96 h在490 nm下的吸光度值（OD值），分別為高表達(dá)vs.對照（時間，P高表達(dá)vs.對照）：0.318±0.016 vs. 0.316±0.028（0 h，P＞0.05）;0.317±0.024 vs.0.315±0.015（24 h，P＞0.05）;0.486±0.016 vs.0.423±0.026（48 h，P=0.044）;0.627±0.051 vs.0.492±0.025（72 h，P=0.011）;0.827±0.046 vs.0.643±0.034（96 h，P=0.002）;見圖5。通過以上數(shù)據(jù)可見在細(xì)胞生長達(dá)到平臺期以前，HMMR-AS1能夠明顯促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖。

表1 HMMR-AS1表達(dá)水平與宮頸癌臨床特征之間的關(guān)系

圖2 HMMR-AS1縮短宮頸癌患者生存期

圖3 高表達(dá)組和對照組的熒光圖

6 高表達(dá)HMMR-AS1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞遷移 本研究通過Transwell遷移實驗驗證了高表達(dá)HMMR-AS1后對宮頸癌細(xì)胞遷移能力的影響。通過吉母薩染色后顯微鏡下拍照（200×）計數(shù)后分析發(fā)現(xiàn)：高表達(dá)組宮頸癌細(xì)胞遷移能力明顯較對照細(xì)胞增加：高表達(dá)vs.對照：78.4±6.2 vs. 54.2±9.6，P=0.000 65，見圖6。

7 高表達(dá)HMMR-AS1促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞侵襲 本研究通過Transwell侵襲實驗驗證了高表達(dá)HMMR-AS1后對宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響。通過吉母薩染色后顯微鏡下拍照（200×）計數(shù)后分析發(fā)現(xiàn)：高表達(dá)組宮頸癌細(xì)胞侵襲能力明顯較對照細(xì)胞增加：高表達(dá)vs. 對照：65.6±8.1 vs. 41.0±7.3，P=0.005 3，見圖7。

圖4 成功篩選HMMR-AS1過表達(dá)Hela細(xì)胞株

圖5 HMMR-AS1促進(jìn)細(xì)胞增殖（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖6 HMMR-AS1促進(jìn)細(xì)胞遷移（200×）

圖7 HMMR-AS1促進(jìn)細(xì)胞侵襲（200×）

8 Hela細(xì)胞系中EMT標(biāo)志物的表達(dá) 通過檢測高表達(dá)細(xì)胞系中上皮樣細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin和間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物 vimentin的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，經(jīng)高表達(dá)后，HMMR-AS1在高表達(dá)細(xì)胞系中的相對表達(dá)量是對照細(xì)胞系的14.23倍（P=0.002 3，見圖8A）。通過檢測細(xì)胞中EMT標(biāo)志物基因及其蛋白質(zhì)的表達(dá)量，結(jié)果顯示上皮樣細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin在高表達(dá)細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著低于對照細(xì)胞系（P=0.005 6，見圖8B），而間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物Vimentin在高表達(dá)細(xì)胞系中的表達(dá)量顯著高于對照細(xì)胞系（P=0.007 2，見圖8C），且在蛋白質(zhì)水平發(fā)現(xiàn)同樣趨勢（P=0.009 5，見圖8D）。

圖8 Hela細(xì)胞系中EMT標(biāo)志物的表達(dá)

9 高表達(dá)HMMR-AS1降低宮頸癌細(xì)胞對化療藥物的敏感性 通過改進(jìn)CCK-8實驗驗證了高表達(dá)HMMRAS1后宮頸癌細(xì)胞對常見化療藥物5-FU和順鉑敏感性的影響。實驗中，首先通過CCK-8實驗測得Hela對順鉑的IC50，高表達(dá)組對順鉑的IC50為52.21±6.22 μmol/L，對照組對順鉑的IC50為7.21±1.11 μmol/L（P=0.003 2）。順鉑處理后細(xì)胞的存活曲線見圖9。實驗結(jié)果均顯示：高表達(dá)組細(xì)胞對順鉑的敏感性降低，提示HMMR-AS1高表達(dá)能夠?qū)е聦m頸癌細(xì)胞對順鉑耐藥。

討 論

宮頸癌是一種嚴(yán)重危害女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病年齡各國報道各異，但發(fā)病年齡均呈年輕化的趨勢[5，9-11]。目前根據(jù)文獻(xiàn)報道宮頸癌預(yù)后較差的主要原因之一為耐藥性的出現(xiàn)[12]。有關(guān)耐藥機(jī)制的研究比較豐富[13]，其中研究較多的是上皮-間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）機(jī)制[7]，且證實EMT與腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移相關(guān)[14]。因此，闡明宮頸癌的耐藥機(jī)制對宮頸癌的診斷和治療至關(guān)重要。

近年來，非編碼RNA，特別是長鏈非編碼RNA（long non-coding RNAs，lncRNAs）受到越來越多研究者的關(guān)注[15-18]。lncRNAs的類型不同，其作用機(jī)制也有區(qū)別[19-22]。Chu等[23]研究發(fā)現(xiàn)HMMR-AS1在上皮性卵巢癌中高表達(dá)，且其高表達(dá)與上皮性卵巢癌的不良預(yù)后相關(guān)；Li等[24]研究發(fā)現(xiàn)敲低HMMR-AS1能抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。本研究發(fā)現(xiàn)HMMR-AS1在宮頸癌中高表達(dá)，且其高表達(dá)與宮頸癌患者的不良預(yù)后相關(guān)，高表達(dá)患者生存期較低；本研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HMMR-AS1能促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，且化療敏感性實驗表明高表達(dá)HMMR-AS1能降低宮頸癌細(xì)胞對順鉑和5-FU的敏感性；此外高表達(dá)HMMR-AS1能夠促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的EMT。本研究與王冉冉等[7]在上皮性卵巢癌中作用機(jī)制相似。在作用機(jī)制方面，本研究結(jié)果表明HMMRAS1可通過介導(dǎo)EMT調(diào)控Hela細(xì)胞化療敏感性，促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，進(jìn)而導(dǎo)致宮頸癌預(yù)后不良。目前HMMR-AS1介導(dǎo)EMT調(diào)控宮頸癌獲得耐藥性的機(jī)制尚未清晰，且HMMR-AS1通過調(diào)節(jié)上下游基因及其信號通路仍需進(jìn)一步探究。