吡格列酮保護(hù)糖尿病大鼠腎缺血再灌注損傷的實驗研究

鄒叢 胡紅林 涂云明 陳同長 王煒超

1南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（南昌330003）；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科（南昌330006）

腎臟疾病可以因多種因素引起，如缺血再灌注損傷（ischemia-reperfusion injury，IRI）、糖尿病[1]。然而，腎IRI是急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）的主要病因之一，也是糖尿病的常見并發(fā)癥[2]。糖尿病是腎功能正?；颊呤中g(shù)后AKI的獨立預(yù)測因素，而且，臨床研究顯示高血糖與AKI 高發(fā)生率明顯相關(guān)[3]。術(shù)中高血糖可以導(dǎo)致過量產(chǎn)生細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激，尤其可以在腎臟中產(chǎn)生，進(jìn)而引起腎損傷[4]。因此，需要進(jìn)一步的實驗研究來預(yù)防或保護(hù)這種腎疾病的發(fā)生。腎IRI的各種治療方法中減輕腎細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是保護(hù)腎損傷的重要環(huán)節(jié)[5-6]。筆者以前的研究表明，治療2型糖尿病的過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ）激活劑吡格列酮可以通過抗凋亡和抗氧化應(yīng)激保護(hù)非糖尿病小鼠腎IRI[7-8]。TAWFIK[9]報道吡格列酮可以通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激和炎癥而減輕糖尿病大鼠急性IRI 誘導(dǎo)的腎損傷。本研究旨在探討吡格列酮通過抗凋亡作用保護(hù)糖尿病大鼠腎IRI。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性SD 大鼠（6～8 周齡，200～250 g，SPF級）購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗科學(xué)部。本實驗所有操作均遵循南昌大學(xué)動物實驗倫理委員會操作流程。

1.2 實驗試劑吡格列酮購自江蘇恒瑞制藥公司，STZ 購自美國Sigma 公司，兔抗鼠bcl-2、bax、caspase-3、caspase-8和β-actin 抗體購自美國Abcam公司，TUNEL 檢測試劑盒購自武漢博士德生物科技公司。

1.3 2型糖尿病大鼠建立2型糖尿病大鼠模型通過腹腔注射單劑量STZ（50 mg/kg）建立，注射STZ 一周后，大鼠禁食8 h，從尾靜脈采血檢測血糖，空腹血糖＞250 mg/dL 考慮建模成功[10]，則進(jìn)行下一步實驗。

1.4 實驗設(shè)計采用隨機(jī)對照設(shè)計原則，將大鼠隨機(jī)分成如下6組：（1）IRI組（n= 8）：正常SD 大鼠行腎IRI 手術(shù)；（2）DM+IRI組（n= 8）：糖尿病大鼠行腎IRI；（3）吡格列酮+IRI（n= 8）：正常SD 大鼠術(shù)前一周接受鼻飼吡格列酮（每日10 mg/kg），然后再經(jīng)歷腎IRI；（4）吡格列酮+DM+IRI（n= 8）：糖尿病SD 大鼠術(shù)前一周接受鼻飼吡格列酮（每日10 mg/kg），然后再經(jīng)歷腎IRI；（5）假手術(shù)組（n=8）：正常SD 大鼠假手術(shù)；（6）DM+假手術(shù)組（n=8）：糖尿病大鼠假手術(shù)。

1.5 大鼠腎IRI模型建立 大鼠手術(shù)前禁食8～12 h，采用2%水合氯醛（2 mL/100 g）腹腔注射麻醉，具體手術(shù)過程如下：腹部正中行1.5～2 cm 切口，逐層分離進(jìn)入腹腔，將腸道推向一側(cè)，暴露腎蒂，用無損傷血管夾夾閉雙側(cè)腎蒂45 min，然后移除血管夾恢復(fù)腎臟血流，關(guān)閉切口。術(shù)中應(yīng)用生理鹽水使動物保持充分水化，術(shù)后動物給與充足飼料和水。假手術(shù)組動物雙側(cè)腎蒂不夾閉，其余操作相同。

1.6 腎功能檢測術(shù)后24 h 從大鼠內(nèi)眥靜脈叢取血標(biāo)本0.5 mL，并4 500 r/min 離心10 min，提取血清檢測肌酐和尿素氮水平。

1.7 腎臟組織病理學(xué)評估各組大鼠術(shù)后24 h 處死并取出腎臟，腎臟沿長軸切開，固定于10%福爾馬林溶液中，石蠟包埋。切成4 μm組織玻片，行常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色。在光學(xué)顯微鏡下觀察腎小管壞死情況。每張玻片隨機(jī)選取皮髓交界處20個視野，按RABB 等[11]方法進(jìn)行半定量評分，評估腎小管壞死程度，評分越高代表損傷越嚴(yán)重。

1.8 TUNEL檢測 脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的末端標(biāo)記法（TUNEL 法）檢測DNA 鏈破裂情況。將制作后的玻片在二甲苯中去除石蠟，經(jīng)梯度乙醇溶液再水化后，按TUNEL 試劑盒說明書操作染色，隨機(jī)選取皮髓交界處20個視野（200×），定量觀察TUNEL 陽性細(xì)胞數(shù)。

1.9 WesternBlot檢測 各組大鼠術(shù)后24 h 處理并取出腎臟，腎臟在冰塊上制作成細(xì)胞勻漿并離心。采用考馬斯亮蘭法（Bradford 法）檢測蛋白濃度。應(yīng)用常規(guī)Western Blot 法檢測各組大鼠腎組織中caspase-3、caspase-8、bcl-2和bax 蛋白的表達(dá)，并將最終條帶進(jìn)行定量分析。內(nèi)參照為β-actin。1.10 統(tǒng)計學(xué)方法 所有資料應(yīng)用GraphPad Prism 5.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 吡格列酮降低血清肌酐和尿素氮與假手術(shù)組相比，腎IRI組大鼠血清肌酐和尿素氮明顯升高（P＜0.01），然而，應(yīng)用吡格列酮明顯抑制了其升高，與IRI組和DM+IRI組相比，吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組血清肌酐和尿素氮均明顯降低（P＜0.05）。然而，吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組之間血清肌酐和尿素氮差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05，圖1）。

圖1 吡格列酮保護(hù)腎IRI 后腎功能Fig.1 Pioglitazone protected renal function after renal IRI

2.2 吡格列酮降低腎細(xì)胞凋亡與假手術(shù)組相比，IRI組和DM+IRI組腎細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.01），而IRI組和DM+IRI組之間腎細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與IRI組和DM+IRI組相比，吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組腎細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果表明：吡格列酮在正常大鼠和糖尿病大鼠均能抑制腎細(xì)胞的凋亡（圖2）。

圖2 吡格列酮降低腎IRI后腎細(xì)胞凋亡Fig.2 Pioglitazone reduced renal cell apoptosis after renal IRI

2.3 吡格列酮降低腎小管損傷假手術(shù)組腎臟顯示正常的腎組織學(xué)形態(tài)（圖3），而IRI組和DM+IRI組腎臟顯示不同程度的缺血性腎損傷，包括廣泛的腎小管結(jié)構(gòu)變性、膨脹、水腫、空泡形成以及壞死（圖3A）。與假手術(shù)組相比，IRI組和DM+IRI組腎小管損傷病理評分明顯升高（P＜0.01），而IRI組和DM+IRI組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與IRI組和DM+IRI組相比，吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組腎小管損傷病理評分明顯降低（P＜0.05，圖3B）。

2.4 吡格列酮升高腎組織中bcl-2蛋白表達(dá)和降低bax 蛋白的表達(dá)與假手術(shù)組相比，IRI組和DM+IRI組腎組織中bcl-2 蛋白表達(dá)明顯降低，bax蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01）。然而吡格列酮+IRI組和吡格列酮+DM+IRI組腎組織中bcl-2 蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.01），bax 蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01，圖4）。

2.5 吡格列酮降低腎組織中caspase-3和caspase-8蛋白剪切片段的表達(dá)Caspase-3和caspase-8是caspase 依賴性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶。為了探討吡格列酮在腎IRI 中的作用，本研究檢測了腎IRI后腎組織中caspase-3和caspase-8 蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：所有組腎臟中，pro-caspase-3和procaspase-8蛋白的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。然而，與假手術(shù)組相比，IRI組和DM+IRI組腎組織中caspase-3 蛋白剪切片段P17和caspase-8 蛋白剪切片段P18 表達(dá)明顯升高（P＜0.01），但是應(yīng)用吡格列酮治療可以明顯抑制其升高（P＜0.01，圖5）。

3 討論

筆者以前的研究表明，治療2型糖尿病的PPAR-γ激活劑吡格列酮可以通過抑制腎細(xì)胞凋亡和改善抗氧化活性而保護(hù)正常小鼠的腎IRI[7-8]。在本研究中，進(jìn)一步闡明吡格列酮通過抑制細(xì)胞凋亡減輕糖尿病大鼠腎IRI，發(fā)現(xiàn)吡格列酮可以改善糖尿病大鼠腎IRI 后腎組織病理學(xué)和生化等指標(biāo)。

腎IRI是臨床腎移植、腎部分切除術(shù)和其他腎臟外科手術(shù)時常見的病理過程，也是糖尿病常見的并發(fā)癥。大量的文獻(xiàn)研究了腎IRI的相關(guān)機(jī)制，包括細(xì)胞凋亡、氧自由基損傷、內(nèi)皮損傷、鈣超載和細(xì)胞能量代謝紊亂等，其中，細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是主要的因素之一[12-13]。

圖3 腎IRI 后24 h 各組大鼠腎臟組織形態(tài)學(xué)評估Fig.3 Renal histomorphology was evaluated in rats 24 hours after renal IRI

圖4 腎IRI 后24 h 各組大鼠腎組織bcl-2和bax 蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of bcl-2 and bax proteins in renal tissue of rats 24 hours after renal IRI

吡格列酮通過抗炎和抗纖維化效應(yīng)在腎小球腎炎、腎小球硬化癥和糖尿病腎病中發(fā)揮治療作用[14-15]，吡格列酮可以在很低的水平激活PPAR-γ，導(dǎo)致PPAR-γ 與相應(yīng)受體結(jié)合，同時招募協(xié)同因子，最后調(diào)控協(xié)同因子的轉(zhuǎn)錄。研究[16]表明，吡格列酮通過抑制胰島素抵抗或氧化應(yīng)激改善糖尿病腎病。也有研究顯示吡格列酮通過抑制細(xì)胞凋亡和抗炎抗氧化作用保護(hù)IRI[17-19]。本研究通過雙側(cè)腎動脈阻斷45 min 建立腎IRI 糖尿病大鼠模型，吡格列酮治療組動物的血清肌酐和尿素氮明顯降低，表明吡格列酮可以改善糖尿病大鼠腎IRI 后的腎功能。

圖5 腎IRI 后24 h 各組大鼠腎組織caspase-3和caspase-8 蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of caspase-3 and caspase-8 proteins in renal tissue of rats 24 hours after renal IRI

本研究中，探討腎IRI 過程中腎細(xì)胞的凋亡，發(fā)現(xiàn)吡格列酮抑制糖尿病大鼠腎IRI 腎小管細(xì)胞凋亡與筆者以前在正常小鼠中研究結(jié)果一致[7]。后又應(yīng)用TUNEL 技術(shù)檢測了吡格列酮在糖尿病大鼠腎IRI 后腎細(xì)胞凋亡的影響，表明吡格列酮可以明顯降低腎細(xì)胞凋亡率。而且，吡格列酮的細(xì)胞保護(hù)作用也涉及bcl-2和caspase 家族基因的表達(dá)，吡格列酮誘導(dǎo)bcl-2的表達(dá)，并與bax 蛋白相互作用而拮抗它們的死亡促進(jìn)活性，吡格列酮在糖尿病大鼠腎組織中抑制caspase-3和caspase-8 剪切片段表達(dá)。

2型糖尿病可以導(dǎo)致器官功能障礙和增加器官對損傷的敏感性[20]。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病合并腎缺血比單獨糖尿病更容易加重腎功能障礙，更加明顯的腎小球損害[20-21]。這些結(jié)果強(qiáng)調(diào)了MELIN 等[22]提出的猜測即糖尿病聯(lián)合腎缺血在糖尿病腎病的形成中起了重要的作用。在本研究首次證實吡格列酮可以通過抑制腎細(xì)胞的凋亡而保護(hù)糖尿病大鼠腎缺血損傷，為今后糖尿病腎IRI的防治提供了理論依據(jù)和治療靶標(biāo)。

吡格列酮作為PPAR-γ激動劑，可以調(diào)控著與脂質(zhì)代謝、葡萄糖穩(wěn)態(tài)和炎癥相關(guān)的多種基因[23]，因此，吡格列酮對糖尿病腎IRI的保護(hù)作用的具體機(jī)制，不僅僅局限于抑制腎細(xì)胞的凋亡，其過程可能涉及一些其他的復(fù)雜機(jī)制，在今后的研究中，將進(jìn)一步的探索與證實。而且，本文只進(jìn)行了體內(nèi)動物實驗的研究，有待于在體外實驗中進(jìn)一步的研究。