RNA干擾維生素D受體基因表達(dá)對HK-2細(xì)胞中鈉/二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1表達(dá)的影響

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科（昆明650032）

泌尿系結(jié)石是泌尿外科最常見的疾病，當(dāng)泌尿系結(jié)石是潛在的代謝紊亂的癥狀時(shí)，復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高[1]。低枸櫞酸尿癥是泌尿系結(jié)石病因之一，枸櫞酸是尿液草酸鈣結(jié)晶生長的最重要也是最強(qiáng)抑制物，它能有效的抑制尿液中草酸鈣結(jié)晶的生長和聚集[2-3]。約有19%～63%的含鈣結(jié)石患者常常伴有低枸櫞酸尿癥[4]，因此低枸櫞酸尿是促進(jìn)草酸鈣結(jié)石形成的重要危險(xiǎn)因素之一[2，5-6]。

目前研究表明，枸櫞酸經(jīng)腎小球?yàn)V過后在近端腎小管被重吸收，而近端腎小管幾乎不分泌枸櫞酸，因此尿中枸櫞酸的濃度主要決定于近端腎小管的重吸收能力。近端腎小管上皮細(xì)胞存在一種能介導(dǎo)枸櫞酸重吸收的載體，即鈉/二羧酸協(xié)同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[Na（+）-dicarboxylate cotransporter，NaDC][7]。位于腎臟近端小管刷狀緣側(cè)的低親和力NaDC1是調(diào)控尿液枸櫞酸排泄的關(guān)鍵蛋白，有學(xué)者也提出維生素D受體（vitamin D receptor，VDR）在二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的蛋白激酶調(diào)節(jié)途徑中起到重要作用[8-10]，而NaDC1 正是一種二羧酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但VDR 基因表達(dá)改變后是否能調(diào)節(jié)NaDC1的表達(dá)或者活性從而產(chǎn)生了低枸櫞酸尿癥有待研究。故此本課題組假設(shè)VDR 通過與NaDC1的關(guān)聯(lián)，參與了尿枸櫞酸的調(diào)控。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)VDR和NaDC1 分別在人腎近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）核膜和胞膜表達(dá)，所以HK-2細(xì)胞是低枸櫞酸尿癥病因?qū)W體外研究的理想細(xì)胞[11]。本研究擬運(yùn)用RNA干擾技術(shù)減低HK-2細(xì)胞中VDR的表達(dá)，并通過分子生物學(xué)技術(shù)檢測NaDC1的表達(dá)變化，從細(xì)胞水平探討VDR 與NaDC1 在尿枸櫞酸調(diào)控中的關(guān)系，從而為揭示低枸櫞酸尿癥的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料HK-2細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所細(xì)胞庫，Lipofectamine 2000（美國Thermo Fisher 公司），DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)液與胎牛血清（美國Gibco 公司），RT-PCR 試劑盒（日本Takara 公司），RNAiso Plus 溶液（日本Takara 公司），VDR 單克隆抗體（美國CST 公司），NaDC1 多克隆抗體（英國abcam 公司），β-actin 單克隆抗體（美國CST 公司）。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GeneBank 提供的VDR 基因序列設(shè)計(jì)合成VDR的6 條siRNA，序列如下：siRNA-1：5′-GUGCCAUUGAGGUCAUCAUTT-3′；siRNA-2：5′-CCUGCUCAGAUCACUGUAUTT-3′；siRNA-3：5′-GCUUUCACUUCAAUGCUAUTT-3′；siRNA-4：5′-GCAGCGCAUCAUUGCCAUATT-3′；siRNA-5：5′-GGAGUUCAUUCUGACAGAUTT-3′；siRNA-6：5′-GCUCGAAGUGUUUGGCAAUTT-3′；negative control：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)在生物安全柜中嚴(yán)格無菌操作培養(yǎng)細(xì)胞。將凍存的HK-2細(xì)胞復(fù)蘇后，用槍頭轉(zhuǎn)移到放有5 mL 培養(yǎng)基（DMEM，含2 mmol/L L-glutamine和10%胎牛血清）的培養(yǎng)瓶中置于濕度培養(yǎng)箱于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)，之后每天于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞狀態(tài)，3～4 d 待HK-2細(xì)胞生長至80%～90%匯合時(shí)傳代1次。首先棄去培養(yǎng)液，用PBS 洗2次。然后加1 mL 胰酶于培養(yǎng)瓶中，倒轉(zhuǎn)放于37℃培養(yǎng)箱1～3 min 預(yù)熱，然后將培養(yǎng)瓶翻過來讓胰酶與細(xì)胞面接觸大約10～30 s，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，見細(xì)胞大部分變圓，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加少量完全培養(yǎng)基終止消化，分到新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.3 轉(zhuǎn)染及分組參照Lipofectamine 2000 說明書，將細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后細(xì)胞匯合度達(dá)50%～70%，棄舊培養(yǎng)基，更換1.5 mL 無血清的DMEM 培養(yǎng)基，準(zhǔn)備作為脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞板。將250 μL 無血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基加入到無菌的1.5 mL EP 管中，再加入5 μL Lipofectamine 2000，輕輕混勻，于室溫放置5 min。將250 μL 無血清的Opti-MEM 培養(yǎng)基加入到無菌的1.5 mL EP管中，再加入5 μL siRNA 溶液，混勻。將上述兩種EP 管中的溶液放一起混勻，室溫孵育20 min。將500 μL 混合液加入到上述六孔板細(xì)胞中，搖勻，放置37℃，5%CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。6 h 后換含10%FBS的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h。siRNA有效篩選實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）與siRNA干擾組（siRNA-1～siRNA-6）。篩選出有效siRNA 后檢測NaDC1的mRNA及蛋白表達(dá)水平實(shí)驗(yàn)分為陰性對照組（轉(zhuǎn)染陰性對照siRNA）與siRNA干擾組（siRNA-2～siRNA-4）。

1.2.4 細(xì)胞總RNA提取收集轉(zhuǎn)染48 h的HK-2細(xì)胞，向收集的細(xì)胞中加入1 mL RNAiso Plus 溶液，混勻，室溫孵育10 min，充分裂解細(xì)胞。收集細(xì)胞裂解液入1.5 mL 離心管中，加入200 μL 氯仿，振蕩，室溫靜置5 min，13 000 r/min，4℃離心15 min。吸取離心好的上清，并轉(zhuǎn)移至新的離心管中，加入等體積異丙醇500 μL。充分混勻，冰上放置30 min。13 000 r/min，4℃離心10 min。小心棄上清，可見管底有白色沉淀，加入1 mL 預(yù)冷的75%乙醇。7 500 r/min，4℃離心5 min。棄上清，倒立離心管于吸水紙上，超凈工作臺中晾干后，加入20 μL DEPC 水溶解沉淀，即為總RNA 樣品。

1.2.5 RT-PCR 及qPCR 檢測取總RNA 樣品，運(yùn)用RT-PCR 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 后用特異引物擴(kuò)增內(nèi)參和目的條帶，并進(jìn)行對比。將mRNA 表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化至GAPDH 水平表達(dá)。在mRNA的表達(dá)的變化可以根據(jù)計(jì)算2-ΔΔCT方法（CT，循環(huán)閾值），與ΔCT=CTtargetgene-CTGAPDH和ΔΔCT=ΔCT實(shí)驗(yàn)-ΔCT空白。分別記錄內(nèi)參基因GAPDH、VDR及NaDC1 mRNA的表達(dá)水平，重復(fù)3次檢測取平均值，以內(nèi)參基因GAPDH表達(dá)量為參照，對各mRNA 表達(dá)量作描述。引物序列見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western Blot檢測收集處理后的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，提取蛋白質(zhì)。調(diào)整蛋白濃度一致，加等量的3×上樣緩沖液，配制12%的聚丙烯酰胺分離膠，每孔上樣50 μg 蛋白，電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉2 h 后，加入相應(yīng)的一抗（anti-VDR，1∶1 000；anti-NaDC1，1∶1 000）4℃孵育過夜，以β-actin 作內(nèi)參（1∶5 000）。洗滌3次，加入相應(yīng)二抗（兔抗）37℃孵育2 h，洗膜8次，用ECL 發(fā)光法檢測目的條帶的表達(dá)。以內(nèi)參蛋白β-actin 表達(dá)量為參照，對各蛋白表達(dá)量作描述。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，VDR及NaDC1的mRNA和蛋白表達(dá)量差異即計(jì)量資料之間采用單因素方差分析檢驗(yàn)總體平均數(shù)間是否存在差異，采用Tukey 檢驗(yàn)確定哪兩個(gè)資料間存在差異，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 篩選出有效的siRNA在細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，通過RT-PCR 檢測干擾HK-2細(xì)胞后VDR的mRNA 水平，以內(nèi)參基因GAPDH 表達(dá)量均值為參照值1.0，siRNA-1 至siRNA-6 六組中VDR的mRNA 相對表達(dá)水平分別為（0.77±0.09）、（0.11±0.08）、（0.07±0.01）、（0.03±0.02）、（0.76±0.13）及（0.87±0.07）。結(jié)果7組mRNA 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=69.50，P＜0.05），其中發(fā)現(xiàn)siRNA-2（q= 17.50）、siRNA-3（q= 18.24）和siRNA-4（q= 19.10）能夠顯著降低VDR的mRNA 水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中siRNA-4 效果最為顯著。陰性對照組（NC）與siRNA-1（q= 4.56）、siRNA-5（q=4.82）和siRNA-6（q=2.58）之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1。

圖1 RT-PCR 檢測siRNA轉(zhuǎn)染后VDR mRNA的表達(dá)Fig.1 The expression of VDR mRNA after siRNA transfection by RT-PCR

進(jìn)一步采用Western Blot 方法檢測了6 條siRNAs 在HK-2細(xì)胞中對VDR的敲降效率，以內(nèi)參基因β-actin 表達(dá)量為參照（1.16 ± 0.08），siRNA-1至siRNA-6 六組中VDR的蛋白表達(dá)水平分別為（0.97 ± 0.05）、（0.44 ± 0.06）、（0.44 ± 0.13）、（0.43± 0.13）、（0.83 ± 0.06）及（0.98 ± 0.05）。結(jié)果7組VDR 蛋白比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 25.37，P＜0.05），其中發(fā)現(xiàn)siRNA-2（q= 11.78）、siRNA-3（q=11.78）和siRNA-4（q=11.98）能夠顯著降低VDR的蛋白質(zhì)水平，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。但siRNA-1（q=3.11）、siRNA-5（q=5.43）和siRNA-6（q=3.05）卻不能顯著降低VDR的蛋白水平（P＞0.05），因此選擇siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4 這3 條siRNA 進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖2。

圖2 WB檢測siRNA轉(zhuǎn)染后VDR 蛋白的表達(dá)Fig.2 The expression of VDR protein after siRNA transfection by WB

2.2 RT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siRNA 后對NaDC1mRNA表達(dá)的影響 選擇siRNA-2、siRNA-3和siRNA-4三條已經(jīng)篩選有效的siRNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染48 h后。運(yùn)用qPCR檢測NaDC1的mRNA表達(dá)水平，以內(nèi)參基因GAPDH 表達(dá)量均值為參照值1.0，siRNA-2至siRNA-4三組中NaDC1的mRNA相對表達(dá)水平分別為（0.04 ± 0.02）、（0.11 ± 0.18）及（0.05 ± 0.01）。結(jié)果4組NaDC1 mRNA 比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2213，P＜0.05），siRNA-2（q=96.65）、siRNA-3（q = 89.69）和siRNA-4（q= 95.31）組NaDC1的mRNA 表達(dá)水平顯著降低，且差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 RT-PCR 檢測siRNA轉(zhuǎn)染后NaDC1 mRNA的表達(dá)Fig.3 The expression of NaDC1 mRNA after siRNA transfection by RT-PCR

2.3 WesternBlot檢測轉(zhuǎn)染siRNA 后對NaDC1 蛋白表達(dá)的影響 運(yùn)用Western Blot檢測NaDC1的蛋白表達(dá)水平，以內(nèi)參基因β-actin 表達(dá)量為參照（1.81±0.29），siRNA-2 至siRNA-4 三組中VDR的蛋白表達(dá)水平分別為（1.26±0.09）、（0.92±0.10）及（0.94±0.03）。結(jié)果4組NaDC1 蛋白比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 13.71，P＜0.05），siRNA-2（q= 4.86，P＜0.05），其中siRNA-3（q=7.95，P＜0.05）和siRNA-4（q= 7.74，P＜0.05）組NaDC1的蛋白表達(dá)水平顯著降低，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

3 討論

圖4 WB檢測siRNA轉(zhuǎn)染后NaDC1 蛋白的表達(dá)Fig.4 The expression of NaDC1 protein after siRNA transfection by WB

泌尿系結(jié)石的發(fā)病機(jī)制受多種代謝、營養(yǎng)、環(huán)境和遺傳因素的影響[12]。低枸櫞酸尿癥是含鈣結(jié)石常見且公認(rèn)的代謝風(fēng)險(xiǎn)因素，但枸櫞酸在腎臟中的代謝尚未完全闡明，已知枸櫞酸排泄是腎臟過濾、重吸收、腎小管細(xì)胞合成等作用聯(lián)合發(fā)生的。已有研究發(fā)現(xiàn)兒童腎結(jié)石也與低枸櫞酸尿癥有著密不可分的聯(lián)系，且聯(lián)系愈加緊密[13]。因此，遺傳因素導(dǎo)致的代謝異常繼發(fā)泌尿系結(jié)石癥狀的疾病更應(yīng)從病因上考慮疾病的發(fā)生。而低枸櫞酸尿癥作為含鈣類結(jié)石的重要病因之一，被越來越多證據(jù)證實(shí)與VDR及NaDC1的表達(dá)有關(guān)。ARUGA等[14]研究表明，慢性代謝性酸中毒能增加近端腎小管枸櫞酸的重吸收，引起低枸櫞酸尿癥，導(dǎo)致腎結(jié)石的形成。有研究發(fā)現(xiàn)尿pH 正常的結(jié)石患者也有低枸櫞酸尿癥存在，STROHMAIER等[15]考慮可能是NaDC1 缺陷引起。關(guān)于VDR與枸櫞酸代謝的關(guān)系，已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)VDR的配體1，25（OH）2D3直接影響著參與枸櫞酸細(xì)胞內(nèi)代謝和跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)酶類的活性[16-17]，另外，VDR 本身可能直接參與到了枸櫞酸鹽的快速排泄途徑[18-19]。此外VDR參與調(diào)節(jié)編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶基因的轉(zhuǎn)錄，而磷酸烯醇丙酮酸羧激酶參與了調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)枸櫞酸鹽及尿枸櫞酸鹽水平[20]。關(guān)于VDR 與NaDC1 之間的聯(lián)系，已有實(shí)驗(yàn)通過基因型分析證明VDR 基因和NaDC1 編碼基因SLC13A2 之間在草酸鈣結(jié)石患者特發(fā)性低枸櫞酸尿癥的發(fā)病機(jī)制中存在上位互相作用[21]。通過桑格測序發(fā)現(xiàn)特發(fā)性低枸櫞酸尿癥與中國漢族、白族人群中的VDR基因單核苷酸多態(tài)性（SNP）相關(guān)[22-23]。然而，直接通過分子生物實(shí)驗(yàn)來證實(shí)VDR 與NaDC1 表達(dá)間的聯(lián)系的研究尚未見報(bào)道，以及通過動(dòng)物目的基因敲除，構(gòu)建低枸櫞酸尿癥動(dòng)物模型，進(jìn)行針對病因的治療研究將是本課題組下一步研究的重點(diǎn)。

在本實(shí)驗(yàn)中，合成針對VDR的siRNA，對HK-2細(xì)胞株進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并通過檢驗(yàn)干擾HK-2細(xì)胞后VDR的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，篩選出有效的3 條siRNA，可為后續(xù)實(shí)驗(yàn)挑選VDR的siRNA 提供參考。接著應(yīng)用了這3 條有效的siRNA，通過檢驗(yàn)干擾HK-2細(xì)胞后NaDC1的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)NaDC1的表達(dá)水平下調(diào)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明在HK-2細(xì)胞中，在一定表達(dá)水平范圍內(nèi)，VDR 調(diào)控NaDC1的表達(dá)，兩者表達(dá)水平呈正相關(guān)。由此也能推斷，由于VDR的表達(dá)上調(diào)引起了NaDC1的表達(dá)也相應(yīng)上調(diào)，從而使NaDC1的轉(zhuǎn)運(yùn)活性增加，尿枸櫞酸在腎近曲小管的重吸收也增加，表現(xiàn)為低枸櫞酸尿癥。

然而本實(shí)驗(yàn)所用的腎近曲小管上皮細(xì)胞（HK-2細(xì)胞）已為理想細(xì)胞，但是并不能代表整個(gè)腎臟枸櫞酸的代謝狀況。并且具體調(diào)節(jié)途徑及機(jī)制還未清晰，下一步實(shí)驗(yàn)尚需在其他腎臟細(xì)胞株中進(jìn)行檢測，更進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需設(shè)計(jì)目的基因敲除動(dòng)物與低枸櫞酸尿癥動(dòng)物模型之間NaDC1 表達(dá)是否存在差異，證實(shí)VDR 基因是否是導(dǎo)致低枸櫞酸尿癥的上游基因，更加深入探索VDR 基因與NaDC1之間是如何聯(lián)系。VDR 基因通過何種通路或者方法來影響NaDC1的機(jī)制尚未明確?？偟膩碚f，本實(shí)驗(yàn)通過檢測敲低了VDR 基因表達(dá)的HK-2細(xì)胞中NaDC1的表達(dá)，為低枸櫞酸尿癥病因?qū)W及泌尿系結(jié)石的病因的探索又邁出一步。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)VDR 基因表達(dá)下調(diào)后NaDC1 在HK-2細(xì)胞中表達(dá)也下調(diào)。通過分析NaDC1 與低枸櫞酸尿癥的聯(lián)系，提示VDR 有通過調(diào)節(jié)NaDC1 表達(dá)，進(jìn)而影響枸櫞酸的代謝，但通過何種通路或者方法實(shí)現(xiàn)上述調(diào)節(jié)的機(jī)制尚未明確，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦為實(shí)施，有待后續(xù)研究。