參附益心顆粒通過線粒體KATP通道改善缺氧H2C9心肌細胞能量代謝的作用＊

鄭榮菲，曹亞選，司春嬰，陳玉善，李 彬，3，崔 琳，關(guān)懷敏，朱明軍，王 賀＊＊

（1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 鄭州 450099；2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心臟中心 鄭州 450099；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院研究生科 鄭州 450099；4. 河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心實驗室 鄭州450099）

心力衰竭（Chronic heart failure,CHF）是一種因心臟充盈和射血功能衰減而導(dǎo)致循環(huán)血量不能滿足全身代謝需求的病理生理綜合征，是各種器質(zhì)性心臟病的終末階段[1]。心臟代謝的基礎(chǔ)是三磷酸腺苷（Adenosine triphosphate, ATP）的產(chǎn)生和利用，ATP 為心臟的收縮和基礎(chǔ)代謝提供能量，并在維持正常心臟功能中起重要作用。線粒體是細胞進行有氧呼吸的主要場所，是細胞氧化磷酸化、電子傳遞和產(chǎn)生能量的重要場所，心肌線粒體為不斷運動的心臟提供能源。線粒體外膜和內(nèi)膜上存在離子通道或離子轉(zhuǎn)運體，參與線粒體和細胞內(nèi)的離子調(diào)節(jié)，而且調(diào)控著線粒體結(jié)構(gòu)和功能，進而影響心肌細胞的生理過程，與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。線粒體ATP 敏感鉀通道（Mitochondrial ATP-sensitive potassium channels,mitoKATP）位于線粒體內(nèi)膜上的內(nèi)向整流鉀通道，通過調(diào)節(jié)線粒體體積和功能響應(yīng)細胞內(nèi)能量狀態(tài)，改善心肌能量代謝的異常[3]。心肌缺血缺氧時，ATP 大量消耗，同時生成ATP 的重要場所線粒體的損傷，將加重ATP 的耗竭，并導(dǎo)致細胞膜上離子泵功能失調(diào)，引起細胞內(nèi)、線粒體內(nèi)鈣超載，這將加重心肌細胞損傷[4]。心肌梗死后心肌細胞缺血壞死，線粒體損傷，呼吸功能受抑制，ATP 的生成減少；而心肌梗死后心力衰竭發(fā)生時，心肌細胞能量產(chǎn)生及儲備功能受損。前期我們研究顯示參附益心顆粒能改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心臟功能，抑制心室的重構(gòu)；能抑制缺氧心肌細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，穩(wěn)定線粒體膜電位，調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)蛋白的表達，改善能量代謝[5，6]；能夠改善心力衰竭大鼠心肌線粒體呼吸功能，具有抗心力衰竭的作用[7]；但參附益心顆粒是否通過mitoKATP通道改善缺氧心肌細胞的能量代謝機制不清楚。因此，本研究通過建立缺氧的大鼠H9C2 心肌細胞模型，利用mitoKATP的開放劑和拮抗劑，觀察參附益心顆粒對缺氧的大鼠H9C2 心肌細胞增殖、凋亡、能量代謝及mitoKATP蛋白表達的作用，從而探索參附益心顆粒改善缺氧心肌細胞能量代謝的機制。

1 實驗方法

1.1 細胞株

H2C9心肌細胞來自于中國協(xié)和細胞庫。

1.2 藥物及制備

參附益心顆粒（陜西步長集團提供，批號：131101），主要成分有：人參6 g，炮附片10 g，桂枝12 g，丹參30 g，赤芍15 g，益母草30 g，澤瀉15 g，葶藶子15 g，大棗12 g。二氮嗪（美國Selleck公司，批號：S4630）。5-羥基癸酸（美國Sigma公司，批號：H135）。

參附益心顆粒含藥血清制備：按照人每kg體質(zhì)量的臨床用藥劑量的5 倍，折算成大鼠的每kg 體質(zhì)量劑量，參附益心顆粒連續(xù)灌胃5 天，在最后1 次灌胃1 h后，于大鼠腹主動脈下端采血，3000 r·min-1，離心15 min，上層澄清、淡黃色液體即為含藥血清。0.22 μm 無菌濾器過濾除菌，分裝后置于-70℃冰箱備用，避免反復(fù)凍融。

1.3 主要試劑及儀器

DMEM 培養(yǎng)基（美國Thermofisher 公司，批號：C22400500BT）、磷 酸 鹽 緩 沖 液（PBS，pH7.4；美 國Thermofisher 公司，批號：C10010500BT）、胰蛋白酶（美國Thermofisher 公司，批號：25200056）、胎牛血清（FBS，以色列Biological Industries 公司，批號：04-001-1A）；CCK-8 檢測試劑盒（上海碧云天公司，批號：C0037）；腺苷三磷酸（ATP）檢測試劑盒（瑞士Roche 公司，批號：11699695001）；十二烷基硫酸鈉（SDS，美國sigma 公司，批號：L3771）三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBS-T，美國Thermofisher 公司，批號：TA-125-TT）；RIPA 細胞裂解液（美國Thermofisher 公司，批號：R0728）；Annexin V/PI 細胞凋亡檢測試劑盒（美國Thermofisher 公司，批號：R37601）；Kir6.2（美國abcam公司，批號：ab79171）、SUR2A(美國Thermofisher 公司，批號：MA5-27637)、β-actin 抗體（美國sigma 公司，批號：A5441）；驢抗兔熒光二抗（美國CST 公司，批號：7074）；311 型CO2 培養(yǎng)箱（美國ThermoFisher 公司）；IX51 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Airtech 型生物超凈工作臺（江蘇蘇凈集團安泰公）；JA203 型電子分析天平（上海海康電子儀器廠）；Multiskan FC 型酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；FACSCalibur型流式細胞儀（美國BD公司）。

1.4 觀察指標(biāo)及方法

1.4.1 H2C9心肌細胞培養(yǎng)

將H9C2 心肌細胞株在37℃水浴中解凍復(fù)蘇，加入10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基混合均勻。在500 g 條件下離心，吹打均勻，然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)皿中37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日觀察細胞生長狀況。胰酶消化傳代，選取對數(shù)生長周期的細胞進行實驗。

1.4.2 參附益心顆粒含藥血清濃度篩選

CCK-8 法測定不同濃度參附益心顆粒含藥血清對H9C2 心肌細胞活動的作用。取對數(shù)生長期的細胞接種于96孔板中，每孔接種5000個細胞，將96孔板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，后以0、50、100、250、500、750、1000μM 參附益心顆粒含藥血清孵育24 h 和48 h，每個濃度6 個復(fù)孔。用MTT 法檢測細胞的活性，篩選出最適宜的參附益心顆粒含藥血清的濃度及時間用以后續(xù)的實驗研究，以O(shè)D值表示。

1.4.3 實驗分組

將H9C2 細胞傳代到6 孔板或96 孔板中，將細胞隨機分為5 組：正常組，缺氧組，缺氧+ 二氮嗪組（mitoKATP通道開放劑），缺氧+參附益心顆粒組，缺氧+參附益心顆粒+5-羥基癸酸（mitoKATP通道阻滯劑）。根據(jù)實驗分組，正常組置于常氧5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)6 h，缺氧組置入缺氧培養(yǎng)箱（92%N2+5%CO2+3%O2）37℃連續(xù)培養(yǎng)6 h。藥物干預(yù)的細胞分別使用二氮嗪（100μM）、5-羥基癸酸（100μM）和參附益心顆粒（250μM）預(yù)處理30 min，后將細胞置于缺氧培養(yǎng)箱37℃連續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.4.4 心肌細胞ATP濃度水平

采用ATP 檢測試劑盒測定，按照實驗說明書步驟將收集的細胞進行檢測，使用化學(xué)發(fā)光儀測定ATP 的濃度。

1.4.5 心肌細胞增殖的測定

使用CCK-8法檢測心肌細胞的增殖，將收集的各組細胞按CCK-8 試劑盒說明書步驟進行，酶標(biāo)儀檢測，細胞活性以O(shè)D值表示，檢測波長為450 nm。

1.4.6 心肌細胞凋亡的測定

按照Annexin V/PI 雙染說明書，洗滌、消化收集細胞。用100 μL 預(yù)冷的Annexin V Binding Buffer（全式金FA11）重懸細胞，加入5 μL的Annexin V-EGFP和5 μL的PI，輕輕混勻，室溫條件下避光反應(yīng)15 min。加入400 μL 預(yù)冷的Annexin V Binding Buffer，輕輕混勻，用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。FlowJo 7.6 軟件分析凋亡細胞的分布情況。

1.4.7 心肌細胞中mitoKATP通道蛋白的表達

Western blot 法 檢 測mitoKATP通 道 蛋 白Kir6.2 和SUR2A。將收集的細胞，按照線粒體提取試劑盒說明書提取線粒體蛋白，按照BCA 蛋白定量試劑盒進行定量。取30 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE 電泳后，100 V電壓下轉(zhuǎn)移90 min 至NC 膜上。麗春紅染色后，5%脫脂奶粉封閉液室溫封閉1 h 后，將NC 膜放入一抗孵育盒中（Kir6.2 一抗稀釋比例1∶500；SUR2A 一抗稀釋比例1∶500；β-actin 一抗稀釋比例1∶500）4℃環(huán)境孵育過夜。次日取出抗體孵育盒，復(fù)溫20 min，取出NC膜并放入TBS-T 溶液清洗3 次，每次10 min。使用帶熒光標(biāo)記的驢抗兔二抗按1∶15000比例避光孵育1 h，取出NC 膜用TBS-T 避光漂洗3 次，每次10 min。在ODYSSEY 紅外凝膠掃描儀上將NC 膜按順序鋪平，進行掃描顯影，利用Image J軟件對目的條帶灰度比值進行定量分析。

1.4.8 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 參附益心顆粒對H9C2心肌細胞活性的時間和劑量作用

心肌活力作用結(jié)果顯示，參附益心顆粒含藥血清從50、100、250 μM 時對H9C2 心肌細胞的活性無顯著性差異，隨著濃度的增加500、750、1000 μM 時H9C2心肌細胞的活性顯著降低（P＜0.01），24 h和48 h的作用結(jié)果相一致，結(jié)果提示高濃度的參附益心顆?？赡苡幸欢ǖ募毎拘裕ū?）。因結(jié)果顯示50-500 μM 間不同濃度對細胞活性相似，故采用250 μM 用于接下來的細胞實驗研究。

表1 參附益心顆粒對缺氧H9C2的細胞活力的作用（±s，n=6）

表1 參附益心顆粒對缺氧H9C2的細胞活力的作用（±s，n=6）

注：vs.0.5 μM，ΔΔP ＜0.01

濃度/μM 0501002505007501000 OD（24 h）0.60±0.030.60±0.020.62±0.020.63±0.020.60±0.02ΔΔ 0.50±0.05ΔΔ 0.44±0.03ΔΔ OD（48 h）0.49±0.030.51±0.020.52±0.010.53±0.020.49±0.02ΔΔ 0.42±0.03ΔΔ 0.36±0.03ΔΔ

2.2 參附益心顆粒通過mitoKATP對缺氧H9C2 心肌細胞ATP水平的作用

表2 參附益心顆粒對缺氧H2C9心肌細胞ATP的水平（±s，n=6）

表2 參附益心顆粒對缺氧H2C9心肌細胞ATP的水平（±s，n=6）

注：vs.正常組，**P ＜0.01；vs.缺氧組，##P ＜0.01；vs.缺氧+ 二氮嗪組，§P ＜0.01；vs.缺氧+參附益心顆粒，?P ＜0.01

Groups正常組缺氧組缺氧+二氮嗪組缺氧+參附益心顆粒缺氧+參附益心顆粒+5-羥基癸酸ATP/（μM·mg-1）0.24±0.020.02±0.01**0.18±0.03**##0.16±0.02**##§0.06±0.03**##§?

與正常組相比，缺氧的H9C2 心肌細胞ATP 含量明顯降低（P＜0.01）。而經(jīng)二氮嗪，參附益心顆粒含藥血清干預(yù)后ATP 含量顯著升高，與缺氧組相比有顯著性差異（P＜0.01）。參附益心顆粒藥血清經(jīng)mitoKATP通道的特異性組織劑5-羥基癸酸干預(yù)后參附益心顆粒的作用顯著下降（P＜0.01）（表2）。

2.3 參附益心顆粒通過mitoKATP通道對缺氧H9C2 心肌細胞增殖的作用

與正常組相比，缺氧組的細胞增殖能力顯著下降（P＜0.01），二氮嗪組和參附益心顆粒含藥血清組細胞較缺氧H9C2 心肌細胞的活力明顯改善（均P＜0.01）；經(jīng)5-羥基癸酸作用后，能明顯降低參附益心顆粒的促增殖作用（P＜0.01）（表3）。

表3 參附益心顆粒對缺氧H2C9心肌細胞增殖的作用（±s，n=6）

表3 參附益心顆粒對缺氧H2C9心肌細胞增殖的作用（±s，n=6）

注：vs.正常組，**P ＜0.01；vs.缺氧組，##P ＜0.01；vs.缺氧+ 二氮嗪組，§P ＜0.01；vs.缺氧+參附益心顆粒，?P ＜0.01

Groups正常組缺氧組缺氧+二氮嗪組缺氧+參附益心顆粒缺氧+參附益心顆粒+5-羥基癸酸OD值1.69±0.050.70±0.04**1.27±0.05**##1.09±0.10**##§0.85±0.04**##§?

2.4 參附益心顆粒通過mitoKATP通道對缺氧H9C2 心肌細胞凋亡的作用

細胞凋亡結(jié)果顯示：正常組心肌細胞的凋亡率較低，而與正常組組相比，缺氧心肌細胞的凋亡率顯著升高（P＜0.01），二氮嗪和參附益心顆粒能顯著降低缺氧心肌細胞的凋亡（P＜0.01），參附益心顆粒的作用低于二氮嗪（P＜0.01）；參附益心顆粒干預(yù)缺氧的心肌細胞使用mitoKATP阻斷劑作用后，參附益心顆粒的抗凋亡作用顯著降低（P＜0.01）（圖1）。

圖1 參附益心顆粒通過KATP通道對缺氧H9C2心肌細胞凋亡作用

2.5 參附益心顆粒對缺氧H9C2 心肌細胞mitoKATP通道蛋白表達的作用

結(jié)果顯示，與正常組相比，缺氧時Kir6.2 和SUR2A 的表達增加（P＜0.01），二氮嗪和參附益心顆粒能增加兩通道蛋白的表達（均P＜0.01），但二氮嗪和參附益心顆粒間無顯著性差異，當(dāng)參附益心顆粒被5-羥基癸酸作用后，參附益心顆粒升高Kir6.2 和SUR2A 的作用也被減弱（均P＜0.01）（圖2）。結(jié)果分析后顯示：與正常組相比，缺氧組大鼠心肌組織中的KATP通道蛋白Kir6.2 和SUR2A 均代償性的升高（P ＜0.01），而經(jīng)過藥物治療后Kir6.2和SUR2A的表達均進一步的增加（均P ＜0.01），二氮嗪和參附益心顆粒能顯著升高Kir6.2 和SUR2A 的表達（P ＜0.01），當(dāng)參附益心顆粒被5-羥基癸酸作用后，參附益心顆粒升高Kir6.2和SUR2A的作用也被減弱（P ＜0.01）（圖2）。

3 討論

正常的心臟能量代謝是保持心臟內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織結(jié)構(gòu)不斷更新的物質(zhì)基礎(chǔ)，對維持心臟功能具有重要意義。ATP 的產(chǎn)生和利用是心臟代謝的基礎(chǔ)，ATP 為心臟的收縮和基礎(chǔ)代謝提供能量，并在維持正常心臟功能中起重要作用，心臟可利用葡萄糖、脂肪酸、酮體、乳酸、氨基酸等多種能量底物，通過氧化代謝反應(yīng)提供能量。心臟對于底物的選擇隨底物濃度和應(yīng)激狀態(tài)的不同而改變，并做出最優(yōu)選擇，從而為心肌提供足夠的能量。心肌梗死后心肌細胞壞死、膠原溶解，激活炎癥反應(yīng)、釋放大量的活性氧自由基（ROS）及炎癥因子、激活神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，通過直接作用或信號通路等影響能量代謝[2]。隨著心肌結(jié)構(gòu)重構(gòu)的進展，代謝始終發(fā)生著變化，而心肌能量代謝紊亂又直接或間接促進心肌重構(gòu)。Van Bilsen 等提出了衰竭心肌能量代謝的概念，即心力衰竭時，心肌細胞葡萄糖、脂肪酸、乳酸、氨基酸等物質(zhì)代謝紊亂引起心臟能量代謝途徑改變，導(dǎo)致心肌結(jié)構(gòu)和功能異常[8]。有研究證明心衰患者中，底物利用和中間代謝的紊亂、能量缺乏和氧化應(yīng)激是收縮功能障礙和疾病進展的基礎(chǔ)。在分子水平上，衰竭心肌中的ATP 和磷酸肌酸（PCr）表達顯著降低，這是由于底物利用、氧化磷酸化和代謝過程紊亂所致[9]。在心力衰竭的早期階段葡萄糖的利用增加，心肌能量代謝的主要特征是由氧化代謝減少而引起的葡萄糖攝取和糖酵解的增加，可能是由于抑制脂肪酸氧化后，葡萄糖利用途徑的調(diào)節(jié)發(fā)生了變化。研究發(fā)現(xiàn)，心臟長期超負(fù)荷能夠大量消耗心肌能量，致使心臟失代償而導(dǎo)致心力衰竭，心肌能量代謝障礙是慢性心力衰竭發(fā)生的重要環(huán)節(jié)[10]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心力衰竭的發(fā)生多由于外邪入侵、飲食偏嗜、情志所傷、先天不足、年老體衰等因素，久之影響及心，致心氣衰弱，氣不行血，血不利則為水，瘀水互結(jié)，損及心陽、心陰，氣血衰敗，發(fā)展為心力衰竭。心力衰竭的病位在心，病變臟腑涉及肺、肝、脾、腎。病機為本虛標(biāo)實，本虛為氣虛、陽虛，標(biāo)實為血瘀、水濕、痰飲，標(biāo)本俱病，虛實夾雜，貫穿于心力衰竭病程始終。綜上所述，心力衰竭的中醫(yī)證候主要為氣虛血瘀、陽虛水停，故益氣溫陽、活血利水為其基本治法。參附益心顆粒（原心衰康沖劑）是在我院名老中醫(yī)孫建芝教授經(jīng)驗方的基礎(chǔ)上開發(fā)而來。組方以人參益氣，附子、桂枝溫腎陽、通心脈，丹參、赤芍、益母草活血化瘀利水，澤瀉、豬苓、車前子、葶藶子、大腹皮化濕利水、瀉肺逐飲，砂仁、大棗健脾利濕、溫補中焦，全方標(biāo)本兼顧，扶正不滯邪，利水不傷陰。全方以共奏益氣溫陽，活血利水之功,臨床上可明顯改善慢性心衰患者的癥狀，如氣短、乏力、咳喘、下肢水腫等，提高患者的生活質(zhì)量。前期我們研究顯示參附益心顆粒能改善心肌梗死后心力衰竭大鼠的心臟功能，抑制心室的重構(gòu)；能抑制缺氧心肌細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)，穩(wěn)定線粒體膜電位，調(diào)節(jié)能量代謝相關(guān)蛋白的表達，改善能量代謝。mitoKATP通道的開放和關(guān)閉與細胞膜上的KATP通道相似，主要受細胞內(nèi)ATP 和ADP 濃度變化所調(diào)節(jié)。當(dāng)細胞處于能量匱乏狀態(tài)時，大量的ATP 被消耗，細胞會通過無氧酵解以及脂肪動員彌補能量供給的不足，而此時大量酸性物質(zhì)的產(chǎn)生，會引起細胞內(nèi)pH 值的下降，酸性環(huán)境以及ATP 抑制作用的解除，會促使mitoKATP的開放，鉀離子的內(nèi)向流動一方面可以形成電荷屏障抑制線粒體內(nèi)Ca2+蓄積，減輕Ca2+超載引起的線粒體腫脹、膜電位下降以及細胞色素C 釋放啟動凋亡[11]；另一方面，鉀離子的內(nèi)向流動可以減少再灌注過程中ROS 的大量生成，降低氧化應(yīng)激反應(yīng)，同時改善線粒體內(nèi)電子傳遞，促進能量合成，從而減輕缺血以及再灌注所引起的心肌損傷[12]。心力衰竭時，心肌細胞缺血、缺氧，線粒體結(jié)構(gòu)和數(shù)目發(fā)生改變，代謝途徑也隨之改變，從而影響心肌能量供給[8]。心肌能量代謝紊亂是心力衰竭的重要發(fā)病機制之一，有證據(jù)表明，心肌能量代謝失調(diào)可導(dǎo)致疾病的進展和惡化[13]。既往研究表明，線粒體損傷、線粒體自噬以及活性氧的產(chǎn)生是導(dǎo)致心肌缺血/再灌注損傷的重要因素[14]。有研究表明針對心肌能量代謝的新療法有改善患者預(yù)后的潛力，并為心力衰竭患者的治療提供新思路[15]。

圖2 參附益心顆粒通過KATP通道對缺氧H9C2的mitoKATP蛋白表達影響

本研究通過建立缺氧的大鼠H9C2 心肌細胞模型，利用mitoKATP的開放劑和拮抗劑，觀察參附益心顆粒對缺氧的大鼠H9C2 心肌細胞增殖、凋亡、能量代謝及mitoKATP相關(guān)蛋白表達的作用，從而探索參附益心顆粒改善缺氧心肌細胞能量代謝的機制。采用熒光素酶發(fā)光法檢測細胞ATP 的濃度，CCK-8 檢測細胞的增殖能力，流式細胞術(shù)檢測細胞的凋亡水平，Western blot 測 定 線 粒 體KATP（mitoKATP）的 相 關(guān) 蛋 白Kir6.2 和SUR2A 的表達。結(jié)果顯示與正常組相比，缺氧H2C9心肌細胞ATP 水平顯著降低，細胞的增殖能力降低，凋亡率增加，mitoKATP通道蛋白的Kir6.2和SUR2A的表達水平均顯著降低（均P＜0.01）。與缺氧組相比，二氮嗪和參附益心顆粒組的ATP 濃度，細胞增殖能力和Kir6.2、SUR2A 蛋白表達水平均顯著升高，細胞的凋亡率顯著下降（均P＜0.01）。而參附益心顆粒經(jīng)mitoKATP阻斷劑5-羥基癸酸作用后，細胞的ATP 濃度，增殖能力和Kir6.2、SUR2A 的表達均顯著下降（均P＜0.01），凋亡率明顯升高（P＜0.01）。綜上所述，參附益心顆?？赡芡ㄟ^mitoKATP通道改善缺氧心肌細胞的能量代謝。將來可以進行更深層次的動物及細胞實驗，進一步研究其作用的具體通路機制，為改善缺氧心肌細胞能量代謝提供新的實驗基礎(chǔ)。