山仙顆粒含藥血清對S－180肉瘤細(xì)胞bax、VEGF的影響＊

胥 冰 應(yīng)小平 方 艷 吳肖曉 陜西中醫(yī)學(xué)院（西安 712046）

我們通過長期臨床觀察表明，中藥復(fù)方山仙顆粒（SXG）在抑制惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移方面均有較好療效[1，2]。SXG以扶正固本、軟堅散結(jié)、活血化瘀之大法[1]治療惡性腫瘤，本研究旨在觀察大鼠SXG含藥血清對S-180肉瘤細(xì)胞bax、VEGF蛋白表達(dá)的影響，探討其治療腫瘤的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑 山仙顆粒（SXG）陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑中心（生產(chǎn)日090328）一抗：Bax兔抗鼠多克隆抗體，二抗：生物素化羊抗兔IgG，VEGF鼠源單多隆抗體，熒光（FITC）標(biāo)記羊抗兔IgG武漢博士德生物工程有限公司。DAB顯色劑 北京博奧森生物技術(shù)有限公司 。

1.2 主要儀器 超凈工作臺 蘇州凈化，倒置顯微鏡 奧特BDS-200，二氧化碳培養(yǎng)箱 德國BindCD-150，倒置熒光數(shù)碼顯微鏡 Nikon TS-100F（配 DS-5MC），研究級正置顯微鏡 Zeiss AxioImager A1（配Nikon DXM1200F），電子精密天平 塞多利斯，全自動高壓滅菌器 日本三洋MLS-3780。

1.3 實驗動物、瘤株 健康SD大鼠20只（雌、雄各半），6～8周齡，體質(zhì)量（250±5）g，第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（軍）2002-005；S-180肉瘤瘤株 第四軍醫(yī)大學(xué)。

2 實驗方法

2.1 含藥血清的制備及滅活 大鼠分籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周隨機(jī)分為4組（n＝5）：空白組；對照組；含藥血清大劑量組；含藥血清小劑量組。含藥血清組，按中藥人、鼠劑量換算標(biāo)準(zhǔn)換算后，以大鼠2.5g／（kg·次）（相當(dāng)于臨床等效劑量10倍），配制濃度為山仙顆粒（g）∶生理鹽水（mL）為1∶2，配成0.5g／mL懸液，即5mg／（kg·次）灌胃給藥，空白組，給予同劑量生理鹽水[4]。于上、下午各灌胃1次，連續(xù)7d，末次灌胃（灌胃前禁食不禁水12h）2h后，3%戊巴比妥鈉0.15mL／100g腹腔注射麻醉，頸動脈采血，離心取上清液，經(jīng)0.22μm濾器濾過除菌，同組混勻，經(jīng)56℃，30min滅活后分裝，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及擴(kuò)增 將S-180肉瘤細(xì)胞接種于含10%胎牛血清、100u／青霉素、100U／鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2飽和濕度條件下擴(kuò)增培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞，制備成1×105／mL細(xì)胞懸液，接種于6孔板，每孔1800μl。分為4組，每組設(shè)3個復(fù)孔。于空白組：加入200μl小牛血清；含藥血清大劑量組 ：加入200μl100%含藥血清；含藥血清小劑量組：加入100%含藥血清20μl和小牛血清180μl，制成10%含藥血清；對照組：加入200μl100%正常大鼠血清。

2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測 S-180肉瘤細(xì)胞bax、VEGF的表達(dá)培養(yǎng)24、48、72h后，分別取出細(xì)胞離心洗滌，調(diào)整密度約為105個／mL制備細(xì)胞涂片，多聚甲醛固定。阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，抗原熱修復(fù)，按試劑盒說明操作S-P法免疫組化染色，光鏡下觀察，胞漿及核膜內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色物質(zhì)為Bax陽性細(xì)胞。胞質(zhì)／胞核內(nèi)出現(xiàn)黃褐色顆粒為VEGF陽性表達(dá)。隨機(jī)選取5個視野（×200）分別計數(shù)Bax、VEGF陽性細(xì)胞數(shù)，計數(shù)100個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞表達(dá)率。

2.4 免疫熒光化學(xué)檢測 S-180肉瘤細(xì)胞Bax、VEGF的表達(dá)分組培養(yǎng)24h，48h，72h后，同上法制備細(xì)胞涂片，固定阻斷內(nèi)源性過氧化物酶抗原熱修復(fù)，5%BSA封閉液作用，按試劑盒說明操作，50%緩沖甘油封片避光，5min內(nèi)快速在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞。

3 結(jié) 果

3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測S-180肉瘤細(xì)胞bax、VEGF的表達(dá) bax定位于細(xì)胞漿及核膜，陽性表達(dá)呈黃褐色顆粒；VEGF定位于胞質(zhì)／胞核，光鏡下觀察，由圖1、2及表1、2可知，含藥血清大、小劑量組在24h、48h、72h內(nèi)S-180肉瘤細(xì)胞中bax、VEGF表達(dá)均有顯著性差異（P＜0.05），bax隨作用時間延長而增高；相反VEGF隨作用時間延長而降低。大、小劑量組與對照組比較及大、小劑量組間比較均有極顯著性差異（P＜0.01）。

圖1 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測S-180肉瘤細(xì)胞bax的表達(dá)（×200）

圖2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測S-180肉瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)（×200）

圖3 免疫熒光化學(xué)法檢測S-180肉瘤細(xì)胞bax的表達(dá)（×200）

圖4 免疫熒光化學(xué)法檢測S-180肉瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)（×200）

表1 各組不同時間段對S-180細(xì)胞bax表達(dá)的影響（）

表1 各組不同時間段對S-180細(xì)胞bax表達(dá)的影響（）

注：各組與相同時段對照組比較，△P＜0.05；相同組在不同時段比較，▲P＞0.05，◇P＜0.05

組 別 n 24h 48h 72h空白組 538.17±5.36▲ 35.68±4.52▲ 30.83±3.69▲含藥血清大劑量 556.15±2.08△◇52.06±3.12△◇54.21±1.98△◇含藥血清小劑量 547.36±3.32△◇44.52±5.43△◇41.87±2.96△◇對照組 536.52±4.21▲ 34.06±6.39▲ 31.25±7.29▲

表2 各組不同時間段對S-180細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響（）

表2 各組不同時間段對S-180細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響（）

注：各組與相同時段對照組比較，△P＜0.05；相同組在不同時段比較，▲P＞0.05，◇P＜0.05

組 別 n 24h 48h 72h空白組 566.25±4.38▲ 65.16±3.82▲ 63.34±6.85▲含藥血清大劑量 548.09±3.15△◇42.29±4.17△◇39.72±5.32△◇含藥血清小劑量 553.33±2.83△◇48.47±3.25△◇41.87±4.18△◇對照組 567.29±4.61▲ 63.54±3.05▲ 60.07±5.13▲

3.2 免疫熒光化學(xué)法檢測S-180肉瘤細(xì)胞bax、VEGF表達(dá) bax表達(dá)于胞漿和核膜上，VEGF定位于胞質(zhì)／胞核，熒光顯微鏡下觀察，由圖3、4知，呈明顯黃綠色鮮艷熒光，含藥血清大、小劑量組在 24h，48h，72h 時，S-180肉瘤細(xì)胞中 bax、VEGF表達(dá)，隨血清作用時間延長，bax熒光亮度增強(qiáng)，VEGF熒光亮度減弱；含藥血清大、小劑量組中bax熒光亮度明顯增強(qiáng)，VEGF熒光亮度明顯減弱，與對照組比較，有顯著性差異，大、小劑量組比較，肉瘤細(xì)胞中的bax、VEGF的表達(dá)有差異。

4 討 論 山仙顆粒（SXG）為中藥復(fù)方制劑，在抑制惡性腫瘤生長和轉(zhuǎn)移方面均有較好療效[3，4]。SXG以西洋參滋陰補(bǔ)氣，清熱生津；莪術(shù)能行氣破血，消積止痛；生山楂等助莪術(shù)行氣，消食化積，活血化瘀；龜板抑陰潛陽；仙鶴草補(bǔ)虛扶正，諸藥合用共奏扶正固本，軟堅散結(jié)，理氣化滯之功。顯示出較好的臨床效果，本實驗采用免疫組化法及免疫熒光化學(xué)法檢測S-180肉瘤細(xì)胞中bax、VEGF表達(dá)。bax為凋亡促進(jìn)基因，bcl-2是凋亡抑制基因，其基因蛋白產(chǎn)物能抑制細(xì)胞凋亡，延長細(xì)胞生存周期；Bax基因的蛋白產(chǎn)物可與bcl-2形成異二聚體，使bcl-2的抗凋亡能力喪失而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。與正常組織相比，在腫瘤組織Bax往往低表達(dá)。本實驗發(fā)現(xiàn)S-180肉瘤細(xì)胞中Bax在不同劑量SXG含藥血清中表達(dá)升高，表明山仙顆粒含藥血清能上調(diào)bax蛋白表達(dá)。與應(yīng)小平等報道山仙顆粒對小鼠S180肉瘤組織中Bax基因表達(dá)的影響結(jié)果相同[5]。

腫瘤生長依賴新生血管的形成已經(jīng)是腫瘤生物學(xué)上研究比較透徹的一個方面。腫瘤生長依賴血液供應(yīng)，需要生成新生血管，而血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）在新生血管生長過程中能強(qiáng)烈促使血管內(nèi)皮有絲分裂并最終形成新生血管，為腫瘤的生長提供豐富的營養(yǎng)充足的血供。是刺激腫瘤血管生成最強(qiáng)的細(xì)胞因子[6]。VEGF過表達(dá)，通過促進(jìn)腫瘤血管的生成而促進(jìn)細(xì)胞的生長。不同劑量SXG含藥血清有效地抑制VEGF的表達(dá)，與崔劉福等報道結(jié)果一致[7]。

綜上所述，SXG含藥血清具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，對大鼠S180肉瘤具有抑制作用。機(jī)制可能與其能明顯增強(qiáng)S-180肉瘤細(xì)胞中Bax基因的表達(dá)，降低VEGF的表達(dá)誘導(dǎo)肉瘤細(xì)胞的凋亡而實現(xiàn)的。但SXG成分復(fù)雜，是否通過其他途徑達(dá)到抗腫瘤效果。確切的抗癌作用機(jī)制尚不完全明確，有待于進(jìn)一步研究。

[1]王希勝，陳光偉，李紅廷，等.山仙顆粒治療惡性腫瘤56例[J].陜西中醫(yī)，2002，23（9）：778.

[2]李光耀，辛春雷，張彬海，等.海生素對K562細(xì)胞生長及凋亡基因表達(dá)的影響[J].解剖學(xué)報，2008，39（5）：713.

[3]金泉克，肖海娟，孫 玨，等，中藥復(fù)方腸胃清含藥血清對胃癌SGC7901細(xì)胞凋亡的影響[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2012，19（5）：34-35.

[4]曹治云，杜 建.扶正抑瘤方對ICR小鼠H22皮下移植瘤組織中凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響[J].福建中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報 ，2012 ，22 （2）：27.

[5]應(yīng)小平 ，史迎麗 ，郭蘭生，等.山仙顆粒對小鼠S180肉瘤組織中Bax基因表達(dá)的影響[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2007，15（9）：1240.

[6]段澤星，謝立群.VEGF在腫瘤生長和血管生成中的作用[J].世界華人消化雜志，2010，18（27）：2894-2896.

[7]崔劉福，姚樹坤，宋海澄，等.肝癥口服液含藥血清抑制肝癌細(xì)胞SMMC-7721血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)[J].中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2004，10（5）：52.