正交試驗(yàn)法優(yōu)化加味八珍合劑中特女貞苷的提取工藝

張衛(wèi) 施曉卉

[摘要]目的 優(yōu)化加味八珍合劑中特女貞苷的提取工藝。方法 采用正交試驗(yàn)法，以提取液中特女貞苷的含量為考察指標(biāo)，對(duì)影響水煎提取效果的煎煮前浸漬時(shí)間（A）、加水倍數(shù)（B）、提取次數(shù)（C）與提取時(shí)間（D）四項(xiàng)作為考察因素進(jìn)行研究，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定加味八珍合劑中特女貞苷的含量。結(jié)果 加味八珍合劑的最佳提取工藝為A2B1C2D1，即加6倍量的水，浸漬1 h，煎煮提取3次，每次1 h。結(jié)論 該實(shí)驗(yàn)所優(yōu)選工藝得到的出膏率和特女貞苷的提出率最高。

[關(guān)鍵詞]加味八珍合劑;特女貞苷;高效液相色譜法;提取工藝;正交試驗(yàn)

[中圖分類號(hào)] R282? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）3（a）-0028-04

Optimization of extraction process of Specnuezhenide in Jiawei Bazhen Mixture by orthogonal experiment

ZHANG Wei? ?SHI Xiao-hui▲

Department of Pharmacy， Zhangjiagang Hospital Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine， Jiangsu Province Zhangjiagang? ?215600， China

[Abstract] Objective To optimize the extraction process of Specnuezhenide in Jiawei Bazhen Mixture. Methods The orthogonal experiment method was used to determine the content of the Specnuezhenide in the extract as the index， and the immersion time （A）， the water addition ratio （B）， the extraction times （C） and the extraction time （D） as factors which affected the extraction effect of the decoction were studied. High performance liquid chromatography （HPLC） was used to determine the content of Specnuezhenide in Jiawei Bazhen Mixture. Results A2B1C2D1 was the best extraction process for Jiawei Bazhen Mixture， that was， adding 6 times of water， immersing for 1 hour， and boiling and extracting 3 times for 1 hour each time. Conclusion The preferred process for this experiment is to obtain the highest extraction rate of mixture and the highest extraction rate of Specnuezhenide.

[Key words] Jiawei Bazhen Mixture; Specnuezhenide; High performance liquid chromatography; Extraction process; Orthogonal experiment

加味八珍合劑作為南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬?gòu)埣腋坩t(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“我院”）的院內(nèi)制劑，全方由多味中藥組成，如茯苓、當(dāng)歸、川芎、女貞子等，具有益氣血、補(bǔ)肝腎之效。加味八珍合劑是在八珍顆粒[1]的基礎(chǔ)上增加了女貞子和狗脊兩味中藥，增強(qiáng)了滋腎陰、強(qiáng)腰膝之功效，主要用于氣弱血虧、腎虛腰酸、四肢倦怠及婦女月經(jīng)不調(diào)等癥。方中女貞子具有扶正固本、滋補(bǔ)肝腎、明目烏發(fā)的功效[2]。隨著當(dāng)今研究的不斷深入，女貞子更多的功效被挖掘出來(lái)，如在抗腫瘤、護(hù)肝[3]、延緩衰老、抗炎抗菌、調(diào)節(jié)免疫等方面都具有相應(yīng)的療效，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)高血脂[4]、高血壓、骨質(zhì)疏松[5]等病癥都有一定的效果[6]?，F(xiàn)代藥理研究表明女貞子的有效成分為特女貞苷[7]，故本研究選擇特女貞苷的含量作為水提正交工藝研究的評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)影響水煎提取效果的煎煮前浸漬時(shí)間、加水倍數(shù)、提取次數(shù)與提取時(shí)間4個(gè)因素進(jìn)行研究，采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定加味八珍合劑中特女貞苷的含量對(duì)加味八珍合劑水提取工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，以期優(yōu)選出加味八珍合劑的最佳工藝。

1儀器與試藥

1.1儀器

Waters 2695高效液相色譜儀（沃特世公司），Waters 2998紫外檢測(cè)器（沃特世公司），Empower色譜工作站;AG135型電子天平（瑞士梅特勒公司，精確度為十萬(wàn)分之一），AUX220電子天平（日本島津公司，精確度為萬(wàn)分之一）;GZX-DH400-BS-II型電熱恒溫干燥箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）;搖擺式高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

1.2試藥

加味八珍合劑（我院自制，批號(hào)：20141208）;特女貞苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111926-201404，供含量測(cè)定用）;女貞子飲片由本院中藥房提供，經(jīng)我院藥學(xué)部副主任余輝主任中藥師進(jìn)行品種和質(zhì)量鑒定，鑒定結(jié)果為合格（批號(hào)：20140503，）;流動(dòng)相用甲醇為色譜純（Merck公司，德國(guó)），實(shí)驗(yàn)用水為超純水，其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

擬以煎煮前浸漬時(shí)間（A）、加水倍數(shù)（B）、提取次數(shù)（C）與提取時(shí)間（D）四項(xiàng)作為考察因素[8-10]，每一因素設(shè)2個(gè)水平，按L8（27）正交表進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），考察指標(biāo)為出膏率及相同飲片用量情況下特女貞苷提出量。

2.2樣品提取液的制備

按處方比例，取黨參等10味藥共50.45 g（共8份），按以下表2進(jìn)行試驗(yàn)，提取液濾過后，合并，最后濃縮或稀釋，定容至500 ml，備用。

2.3出膏率測(cè)定

分別精密量取“2.2項(xiàng)下”制備的各樣品溶液10 ml于恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃常壓干燥5 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，稱重，按飲片量計(jì)算出膏率[11-13]，結(jié)果見表2。

2.4特女貞苷含量測(cè)定

2.4.1色譜條件

色譜柱為Waters Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相為甲醇-水（40∶60），檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm，柱溫30℃，流速為1 ml/min。

2.4.2對(duì)照品溶液的制備

精密稱定特女貞苷對(duì)照品10.01 mg于10 ml量瓶中，加甲醇溶解，搖勻，定容至刻度，即得特女貞苷對(duì)照品母液，于4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。精密量取上述特女貞苷母? ml于10 ml量瓶中，加流動(dòng)相稀釋，搖勻，定容至刻度，得濃度為0.1001 mg/ml的對(duì)照品溶液。

2.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取“2.4.2項(xiàng)下”對(duì)照品工作液2、4、8、l0、12、15 μl進(jìn)樣，平行進(jìn)樣2次。以進(jìn)樣量C（μg）對(duì)峰面積平均值A(chǔ)進(jìn)行回歸處理，得回歸方程：A=1 141 828.5C-75 342.2（r=0.9999）。結(jié)果表明，特女貞苷在0.2002～1.5015 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4特女貞苷提出量測(cè)定

精密吸取“2.2項(xiàng)下”各樣品提取液1 ml，用0.45 μm濾膜壓濾，取續(xù)濾液備用。精密吸取“2.4.2項(xiàng)下”工作液2、15 μl及上述各供試液10 μl，分別平行進(jìn)進(jìn)樣2次。以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，并計(jì)算指標(biāo)成分特女貞苷絕對(duì)提出量，結(jié)果見表2。

2.4.5數(shù)據(jù)分析及結(jié)果驗(yàn)證

2.4.5.1直觀分析? 出膏率最佳提取工藝：A2B1C2D2（C、A為主要因素）;特女貞苷最佳提取工藝：A2B2C2D1（C、A、D為主要因素）。

2.4.5.2方差分析? 特女貞苷出膏率、提出量方差分析結(jié)果具體見表3、表4。方差分析結(jié)果表明，對(duì)出膏率而言，C因素不同水平間有一定差異，C2>C1，其他A、B、D三因素各水平間均無(wú)顯著性差異;對(duì)特女貞苷提出率而言，A、C兩因素各水平間有顯著性差異，A2 >A1，C2>C1，B、D兩因素各水平間無(wú)顯著性差異。結(jié)合大生產(chǎn)實(shí)際，綜合考慮后，選擇A2B1C2D1，即加6倍量的水，浸漬1 h，煎煮提取3次，每次1 h。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)

2.5.1驗(yàn)證樣品溶液的制備

按處方比例，取黨參等10味藥共100.9 g（共2份），除煎煮次數(shù)外，嚴(yán)格按以上優(yōu)選工藝提?。?倍量水，煎煮提取3次，每次1 h）。每次提取液濾過后，適當(dāng)濃縮，分別定容至500 ml，備用。

2.5.2驗(yàn)證特女貞苷出膏率測(cè)定

精密量取“3.1項(xiàng)下”制備的各提取液10 ml，置恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，105℃常壓干燥5 h，取出，置干燥器中冷卻30 min，稱重，按飲片量計(jì)算出膏率及累積出膏率，結(jié)果見表5和圖1、圖2。

2.5.3驗(yàn)證特女貞苷提出率測(cè)定

用與上述相同的方法制得供試品溶液，精密吸取“2.4.2項(xiàng)下”工作液2、15 μl及各供試品溶液10 μl，分別平行進(jìn)樣2次。以隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，并按飲片量計(jì)算指標(biāo)成分特女貞苷提出率及累積提出率，結(jié)果見表5和圖3、圖4。

2.5.4結(jié)論

由以上驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知，按優(yōu)選工藝煎煮3次后，累積出膏率為27.90%（占5次總出膏率的90.38%），特女貞苷累積提出率為0.0816%（占5次總提出率的82.16%），此時(shí)特女貞苷累積提取轉(zhuǎn)移率已達(dá)71.60%。由于煎煮3次后，飲片中90%以上的固體及70%以上的特女貞苷已被提出，因此驗(yàn)證了上述優(yōu)選工藝的科學(xué)性及可行性。

3討論

3.1流動(dòng)相的選擇

本研究流動(dòng)相分別選用乙腈-0.1%磷酸（18∶82）、甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鉀水溶液（25∶75）、甲醇-水（40∶60）、甲醇-水（36∶64）、甲醇-水（80∶20）等條件[14-18]，經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)，考慮到方法簡(jiǎn)便，且實(shí)驗(yàn)后色譜柱易清洗，最終了選擇甲醇-水（40∶60）為流動(dòng)相。

3.2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

中藥復(fù)方制劑的提取工藝決定其療效的高低，因此盡可能溶解和浸出有效成分，避免提取出無(wú)效成分等雜質(zhì)顯得尤為重要。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，飲片大小以1～3 cm為宜，水浸漬1 h，兼顧大生產(chǎn)確定以煎煮前浸漬時(shí)間、加水倍數(shù)、提取次數(shù)與提取時(shí)間為考察因素[19]。本合劑的有效成分考察指標(biāo)選擇女貞子中特女貞苷的含量，出膏率作為相對(duì)的質(zhì)控指標(biāo)。從試驗(yàn)結(jié)果分析，特女貞苷的含量、出膏率各自最多得量的工藝條件是一致的，提示在此工藝條件下，即加6倍量水，浸漬1 h，煎煮提取3次，每次1 h，藥材有效成分的提取較完全。

綜上所述，HPLC測(cè)定加味八珍合劑提取液中特女貞苷的含量，專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，重復(fù)性好。最佳提取工藝為加6倍量的水，浸漬1 h，煎煮提取3次，每次1 h。此提取工藝經(jīng)驗(yàn)證科學(xué)合理，穩(wěn)定可行。

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（收稿日期：2019-07-25? 本文編輯：任秀蘭）