橘紅顆粒特征圖譜研究

彭善貴 王良 文永盛

[摘要]目的 研究橘紅顆粒的特征圖譜，為科學(xué)評(píng)價(jià)和有效控制質(zhì)量提供可靠方法。方法 采用高效液相色譜法（紫外檢測(cè)）對(duì)橘紅顆粒成分進(jìn)行測(cè)定，以Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-水，進(jìn)行梯度洗脫，體積流量為0.5 ml/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。供試品溶液制備采用甲醇直接超聲處理進(jìn)樣。對(duì)橘紅顆粒處方中7味藥材的主要成分進(jìn)行檢測(cè)，建立橘紅顆粒特征圖譜。結(jié)果 橘紅顆粒特征圖譜有11個(gè)共有峰，分別歸屬了處方中的化橘紅、陳皮、甘草、桔梗、地黃、瓜蔞皮和款冬花7味藥材，并且確認(rèn)了特征峰5為甘草苷，峰7（S）為參照物柚皮苷，峰9為橙皮苷。精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD均<1.0%，其相對(duì)峰面積的RSD均<4.0%。結(jié)論 建立的橘紅顆粒特征圖譜分析方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，可用于橘紅顆粒的質(zhì)量控制和評(píng)價(jià)。

[關(guān)鍵詞]橘紅顆粒;高效液相色譜法;特征圖譜;質(zhì)量和控制評(píng)價(jià)

[中圖分類號(hào)] R917? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1674-4721（2020）3（a）-0009-06

Study on characteristic chromatogram of Juhong Granules

PENG Shan-gui? ?WANG Liang? ?WEN Yong-sheng▲

Chengdu Institute of Food and Drug Inspection， Sichuan Province， Chengdu? ?610045， China

[Abstract] Objective To study the characteristic chromatogram of Juhong Granuls and provide a reliable method for scientific evaluation and effective control of quality. Methods High performance liquid chromatography （ultraviolet detection） was used to determine the components of Juhong Granuls， Sunfire C18 （250 mm×4.6 mm， 5 μm） was used as the chromatographic column. The mobile phase consisted of acetonitrile-water， with gradient elution at the flow rate of 0.5 ml/min， column temperature was 30℃. Detection wavelength was 283 nm. The sample solution was prepared by direct ultrasonic treatment with methanol. The main components of seven herbs in the prescription of tangerine granules were detected and the characteristic spectrum of tangerine granules was established. Results There were 11 common characteristic peaks of Juhong Granuls， and the characteristic chromatographic peaks were classified into seven medicinal herbs in the prescription， namely， Citrigrandis Exocarpium， Citripericarpium Reticulatae， Glycyrrhizae Radixet Rhizome， Plycyrrhizae Radix， Rehmanniae Radix， Trichosanthis Pericarpium Farfarae Flos， and the characteristic peak 5 was glycyrrhizin， peak 7（S） was the reference naringin and peak 9 was hesperidin. The precision， repeatability and stability test results showed， the RSD of the relative retention time of each common peak was less than 1.0%， and the RSD of the relative peak area was less than 4.0%. Conclusion The etablished characteristic chromatogram method of Juhong Granuls is simple， accurate， and can be used for the quality control and evaluation of Juhong Granuls.

[Key words] Juhong Granuls; High performance liquid chromatography; Characteristic chromatogram; Quality and control evaluation

橘紅顆粒具有清肺、化痰、止咳的作用，用于痰熱咳嗽、痰多、色黃黏稠、胸悶口干。橘紅顆粒標(biāo)準(zhǔn)收載于《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版一部[1]（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）。橘紅顆粒處方由化橘紅、陳皮、法半夏和浙貝母等15味藥物組成，制法上采用全部藥材水煎煮。標(biāo)準(zhǔn)中僅用薄層色譜法鑒別了陳皮和浙貝母藥材，用高效液相色譜法測(cè)定了化橘紅的主要成分柚皮苷的含量[1]。另外現(xiàn)有的資料和文獻(xiàn)都是單味藥材含量測(cè)定或薄層鑒別，基本沒(méi)有反映復(fù)方制劑橘紅顆粒較為全面的質(zhì)量評(píng)價(jià)方法[2-9]。中藥特征圖譜是一種多指標(biāo)的質(zhì)量控制模式，它可以比較全面的反映所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，從而能夠全面、綜合地反映和控制中藥的質(zhì)量[10-13]。本研究為專項(xiàng)抽驗(yàn)評(píng)價(jià)研究，為了真實(shí)地反映橘紅顆粒內(nèi)在成分的整體特性，科學(xué)評(píng)價(jià)其質(zhì)量的均一性和穩(wěn)定性，采用自制橘紅顆粒與專項(xiàng)抽驗(yàn)的198批次橘紅顆粒制劑進(jìn)行了特征圖譜考察研究。根據(jù)實(shí)際情況，采用高效液相色譜法建立橘紅顆粒的特征圖譜，現(xiàn)報(bào)道如下。

1儀器、試藥與試劑

1.1儀器

Anilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫公司），Anilent 1260 DAD檢測(cè)器，LC open LAB自動(dòng)進(jìn)樣色譜工作站，AE-240電子天平（德國(guó)賽多利斯公司），SK250H超聲儀（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）。

1.2試藥與試劑

對(duì)照品：柚皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110722-201613，純度：94.3%），橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-201611，純度：96.1%），甘草苷對(duì)照品（批號(hào)：111610-201607，純度：93.1%），均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供。

橘紅顆粒樣品：198批為2018年四川省評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品，均符合規(guī)定（四川省食品藥品監(jiān)督管理局組織的2018年評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)專項(xiàng)工作，抽樣地域覆蓋了全省21個(gè)地、市、州。涉及批準(zhǔn)文號(hào)13個(gè)，占全部批文的48.2%。生產(chǎn)企業(yè)13家，占全部生產(chǎn)廠家的50.0%）。化橘紅（Citrusgrandis Exocarpium）、陳皮（Citripericarpium Reticulatae）、法半夏（Pinelliaerhizome Praeparatum）和浙貝母（Fritillariaethunbergii Bulbus）等15味中藥材均為廣州白云山中一藥業(yè)有限公司提供的生產(chǎn)橘紅顆粒所用的處方投料藥材。經(jīng)本院中藥室主任中藥師周世玉鑒定均符合《中國(guó)藥典》[1]要求。課題組按《中國(guó)藥典》[1]“橘紅顆?！辟|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)收載的處方與制法自制橘紅顆粒樣品1批。

流動(dòng)相中的甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑試藥均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Sunfire C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相A：乙腈、流動(dòng)相B：水溶液，按流動(dòng)相梯度表（表1）進(jìn)行梯度洗脫;流速為0.5 ml/min;柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)為283 nm。

2.2溶液的制備

2.2.1參照物溶液的制備? 取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1毫升約含0.1 mg的溶液。

2.2.2供試品溶液的制備? 分別取橘紅顆粒樣品（廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，批號(hào)W00003M）和自制橘紅顆粒樣品，研細(xì)，取約1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 ml，稱定重量，超聲處理（功率250 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得，橘紅顆粒供試品溶液和自制橘紅顆粒供試品溶液。

2.2.3陰性溶液的制備? 取不加化橘紅、陳皮、法半夏和浙貝母等15味藥物的空白樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下的橘紅顆粒供試品溶液制備方法，制成溶液，即得。

2.4專屬性試驗(yàn)

取“2.2.1”“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下溶液，按“2.1”試驗(yàn)條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，并對(duì)色譜圖中出峰時(shí)間5 min后的峰，進(jìn)行了積分處理。圖1～4分別為柚皮苷對(duì)照品溶液、橘紅顆粒供試品溶液、自制橘紅顆粒供試品溶液及橘紅顆粒陰性溶液的高效液相色譜圖。結(jié)果顯示，橘紅顆粒樣品（廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，批號(hào)W00003M）和自制橘紅顆粒樣品，都檢測(cè)出了11個(gè)峰，陰性樣品色譜在與供試品色譜11個(gè)峰相應(yīng)位置上均未有色譜峰出現(xiàn)，無(wú)干擾。提示供試品色譜中的11個(gè)特征峰為橘紅顆粒物質(zhì)成分的反應(yīng)，為特征峰，該方法具有較好的專屬性。

2.5精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下的橘紅顆粒供試品溶液，按“2.1”試驗(yàn)條件，連續(xù)進(jìn)針5次，進(jìn)行測(cè)定，分析并計(jì)算11個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。表2為橘紅顆粒精密度試驗(yàn)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～0.50%，表3為橘紅顆粒精密度試驗(yàn)共有峰的相對(duì)峰面積，其相對(duì)峰面積的RSD為0.00%～2.83%。結(jié)果表明儀器等整個(gè)檢測(cè)系統(tǒng)的精密度良好，符合特征圖譜的要求。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下的橘紅顆粒供試品溶液，按“2.1”試驗(yàn)條件，分別在0、4、8、16、24 h測(cè)定。分析并計(jì)算11個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。表4為橘紅顆粒穩(wěn)定性試驗(yàn)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～0.71%，表5為橘紅顆粒穩(wěn)定性試驗(yàn)共有峰的相對(duì)峰面積，其相對(duì)峰面積的RSD為0.00%～3.51%。結(jié)果表明，在24 h內(nèi)橘紅顆粒的圖譜基本穩(wěn)定，沒(méi)有明顯的變化，符合特征圖譜的要求。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

同一橘紅顆粒供試品粉末（廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，批號(hào)W00003M），取6份，精密稱定，按“2.2.2”制備供試品溶液，按“2.1”試驗(yàn)條件，平行測(cè)定6份。分析并計(jì)算11個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。表6為橘紅顆粒重復(fù)性試驗(yàn)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間，相對(duì)保留時(shí)間的RSD為0.00%～0.72%，表7為橘紅顆粒重復(fù)性試驗(yàn)共有峰的相對(duì)峰面積，其相對(duì)峰面積的RSD為0.00%～3.45%。結(jié)果表明同一批次的6 份供試品色譜相似，沒(méi)有明顯的差異，方法的重復(fù)性良好，符合特征圖譜的要求。

2.8特征峰歸屬性試驗(yàn)

按照《中國(guó)藥典》[1]‘橘紅顆粒處方和制劑，選取相應(yīng)的對(duì)照藥材分別制成15味藥材樣品（水煎煮，濃縮為浸膏）。再按“2.2.2”制備對(duì)照藥材溶液，按“2.1”試驗(yàn)條件，分別進(jìn)樣測(cè)定。采用橘紅顆粒樣品特征圖譜與15味對(duì)照藥材圖譜比較，找出特征峰歸屬。另外根據(jù)歸屬藥材具有的主要成分，配制不同的對(duì)照品溶液并測(cè)定，各特征峰歸屬信息見(jiàn)表8，結(jié)果確認(rèn)峰7為參照物柚皮苷、峰5為甘草苷，峰9為橙皮苷。

2.9特征圖譜的建立

按“2.2.2”供試品溶液制備和“2.1”試驗(yàn)條件，對(duì)2018年四川省評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)項(xiàng)目橘紅顆粒198批樣品進(jìn)行特征圖譜的采樣及分析。由于不同樣品特征峰面積相差較大，僅對(duì)保留時(shí)間進(jìn)行了計(jì)算及分析。按照相對(duì)保留時(shí)間±5%的原則計(jì)算和分析。結(jié)果顯示：198批次橘紅顆粒中，14批次樣品有峰缺失，均為5號(hào)甘草苷峰缺失，其余184批次樣品均具有11個(gè)特征峰（表9、圖5）。占樣品量的92.93%，其11個(gè)特征峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD為0.00%～0.82%（不同企業(yè)的樣品色譜中，11個(gè)特征峰中參照峰S對(duì)應(yīng)的柚皮苷占80%以上，由于受生產(chǎn)工藝、投料藥材質(zhì)量等許多因素影響，11個(gè)峰的面積變化較大，與S峰比較，其相對(duì)面積沒(méi)有規(guī)律性，因此沒(méi)有對(duì)11個(gè)特征峰的相對(duì)面積作出統(tǒng)計(jì)分析）。結(jié)合專屬性、重復(fù)性和穩(wěn)定性的結(jié)果，建立橘紅顆粒特征圖譜。特征圖譜具有11個(gè)特征峰;其中7號(hào)峰為參照物柚皮苷S峰，5號(hào)峰為甘草苷，9號(hào)峰為橙皮苷;11個(gè)特征峰與相應(yīng)的S峰比較，其相對(duì)保留時(shí)間規(guī)定值為：0.277（峰1）、0.330（峰2）、0.463（峰3）、0.519（峰4）、0.787（峰5）、0.934（峰6）、1.000（峰7（S））、1.018（峰8）、1.029（峰9）、1.176（峰10）、1.303（峰11），相對(duì)保留時(shí)間都應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，符合要求。

3討論

按照中國(guó)藥典及相關(guān)文獻(xiàn)[14-20]，結(jié)合橘紅顆粒的制法以及處方中化橘紅、陳皮、甘草等多味藥材的含量測(cè)定方法，在供試品的提取方法上，考察了水、甲醇和乙醇不同溶劑超聲提取，結(jié)果表明，各提取方法得到的液相色譜差異不大，其中甲醇處理的色譜圖，基線最平整;在超聲時(shí)間上，以君藥化橘紅的主成分柚皮苷，也就是特征圖譜中最大峰面積S峰為考察指標(biāo)，超聲處理15、30和45 min，其中30 min就基本達(dá)到最高值了，最后確定供試品溶液的制備以“2.2.2”試驗(yàn)條件為最好。流動(dòng)相的選擇上，考察了甲醇-水（梯度洗脫）、乙腈-水（梯度洗脫），其中甲醇-水基線噪音比較大，不夠平穩(wěn)，甘草苷成分分離效果不理想;在波長(zhǎng)選擇上，考察了207、237 nm和283 nm，其中207 nm靠近末端吸收，基線噪音比較大，而283 nm為柚皮苷和橙皮苷的最大吸收峰，同時(shí)也具有甘草苷237 nm的吸收效果，選擇283 nm最為理想，最后確定本研究的試驗(yàn)條件最好，其特征峰較多，分離效果好，基線噪音小。在測(cè)定儀器方面，以Anilent 1260高效液相色譜儀（安捷倫公司）建立方法并測(cè)定樣品，以Waters 2695-2487高效液相色譜儀（Waters公司）驗(yàn)證其儀器選擇性，結(jié)果提示其重現(xiàn)性良好。

橘紅顆粒藥味多，成分復(fù)雜，采用特征圖譜來(lái)反映并評(píng)價(jià)其質(zhì)量是一種比較有效的手段，其優(yōu)點(diǎn)在于可以較為全面地反映不同藥味的化學(xué)成分，表征制劑質(zhì)量。本研究建立的橘紅顆粒特征圖譜，可以歸屬處方中的7味藥材。本研究測(cè)定不同企業(yè)生產(chǎn)的198批橘紅顆粒，結(jié)果顯示，14批次樣品有峰缺失，主要是5號(hào)甘草苷峰缺失，占測(cè)定樣品的7.1%。橘紅顆粒藥味多，現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺少多味藥材的鑒別，投料藥材產(chǎn)地不同，批次不同，其質(zhì)量相差很大，如果把控出現(xiàn)漏洞，就會(huì)給部分產(chǎn)品帶來(lái)質(zhì)量安全隱患。

綜上所述，本研究建立的橘紅顆粒特征圖譜檢測(cè)法專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好，簡(jiǎn)便快速，可有效鑒別和評(píng)價(jià)橘紅顆粒的質(zhì)量?jī)?yōu)劣，用于橘紅顆粒的質(zhì)量控制，方法可行。

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（收稿日期：2019-07-08? 本文編輯：孟慶卿）