蒙藥白花龍膽花總黃酮提取工藝及醇提物的抗炎活性研究

嘎 魯，格根塔娜，盛 華，王玉華

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，呼和浩特 010011）

白花龍膽花為龍膽科植物高山龍膽（gentiana purdomii Marq.）的干燥花，蒙語名為查干—珠勒根—其木格，別名有邦占嘎日布，那木日音—其其格，查干—邦占（通稱）。按花的顏色可分為白、黑、花3種，但白色者為上品[1-2]，主要分布于西藏、青海、新疆、甘肅、四川等地，其味澀、苦，性寒；效軟、柔、稀。具有清熱解毒，止咳，利咽喉作用，蒙醫(yī)臨床上主要用于治咽喉腫痛，音啞，肺熱，毒熱等。蒙醫(yī)藥古籍《蒙藥驗(yàn)方》中記載查干—珠勒根—其木格在對咽喉病癥特效的蒙藥復(fù)方呼和嘎日迪-13等中均有應(yīng)用[3]，主要含龍膽堿等生物堿，異葒草素等黃酮類化合物[4-8]。本項(xiàng)目對白花龍膽花總黃酮提取工藝和醇提物體內(nèi)抗炎活性進(jìn)行研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 動物 昆明種小鼠（雌雄兼用，19～27 g），由內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

1.2 藥材及藥物 白花龍膽花采自青海省，阿司匹林（石藥集團(tuán)）、二丁顆粒（修正藥業(yè)）。

1.3 試劑 乙醇（分析純）、蒸餾水、生理鹽水；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（Y-132-150801，含量：98.0%，中國食品藥品檢定研究院）。

1.4 儀器 分析天平、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、超聲提取儀、高壓滅菌鍋、冷凍干燥機(jī)、紫外分光光度計(jì)。

2 白花龍膽花總黃酮提取工藝試驗(yàn)

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品11.55 mg，用乙醇溶解，定容至50 mL容量瓶中，搖勻，得濃度為0.23 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

2.2 線性關(guān)系的考察 分別取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.0 mL，0.5 mL，1.0 mL，1.5 mL，2.0 mL，2.5 mL于6個25 mL容量瓶中，以乙醇溶液作為空白對照，依次加入5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，搖勻，靜止5 min；加10%硝酸鋁溶液0.5 mL，搖勻，靜止6 min；加40%氫氧化鈉溶液0.5 mL，用乙醇定容，搖勻。在510 nm波長處分別檢測吸光度，以標(biāo)準(zhǔn)品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得蘆丁溶液在0.005 6～0.023 0 mg/mL濃度范圍之內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 乙醇濃度對白花龍膽花總黃酮含量的影響 精密稱取白花龍膽花粉末5份，每份約1 g，25℃超聲提取2次，提取儀功率220 W，液料比1:30，超聲時間30 min，提取溶劑分別為40%、55%、70%、80%、95%乙醇，測定波長為510 nm 處吸光度，40%濃度提取物黏度過高，無法過濾，剩余4組吸光度（A）分別為0.863、0.920、0.841、0.744，總黃酮含量分別為3.02%、3.23%、2.96%、2.62%，選擇55%、70%、80%乙醇作為正交試驗(yàn)考察因素。

2.3.2 料液比對白花龍膽花總黃酮含量的影響 精密稱取白花龍膽花粉末5份，每份約1 g，25 ℃超聲提取2次，提取儀功率220 W，溶劑為70%乙醇，超聲時間30 min，料液比分別為1:10，1:20，1:30，1:40，1:50，測定波長為510 nm 處吸光度（A），分別為0.877、0.984、0.912、0.822、0.845，總黃酮含量分別為5.40%、6.06%、5.63%、4.99%、5.21%，選擇料液比1:10、1:20、1:30作為正交試驗(yàn)考察因素。

2.3.3 提取時間對白花龍膽花總黃酮含量的影響 精密稱取白花龍膽花粉末5份，每份約1 g，25℃超聲提取2次，提取儀功率220 W，溶劑為70%乙醇，料液比為1:20，超聲提取時間分別為10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，測定510 nm 處吸光度（A），分別為0.488、0.433、0.590、0.523、0.533,總黃酮含量分別為2.49%、2.21%、3.02%、2.67%、2.72%，選擇超聲提取時間20 min、30 min、40 min作為正交試驗(yàn)考察因素。

2.4 正交試驗(yàn) 黃酮類化合物是白花龍膽花中的主要有效成分之一，多數(shù)均有抗炎抗菌等生物活性，黃酮類化合物分子顯弱極性，易溶于乙醇中。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為3個考察因素，每個因素設(shè)置3個水平，利用L9（3）4正交表做正交試驗(yàn)。見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素及水平

精密稱取白花龍膽花粉末9份，每份約1 g，加溶劑，搖勻，超聲提取2次，過濾，合并濾液，旋除溶劑，將得到的棕黃色浸膏用乙醇定容至25 mL容量瓶中，每一因素水平試驗(yàn)平行操作3次，確保其重現(xiàn)性。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果，見表2。

3 體內(nèi)抗炎活性實(shí)驗(yàn)

3.1 白花龍膽花醇提物的制備 白花龍膽花干燥藥材200 g，粉粹，用試驗(yàn)2.4中得到的最佳工藝條件提取2次，合并濾液，濃縮，冷凍干燥得到干燥粉54.2 g，提取率為27.1%。

3.2 急性毒性實(shí)驗(yàn) 將50只小鼠（雌雄兼有）隨機(jī)分5組，每組10只，對其進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，并利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，得LD50的估計(jì)值為18.727 g/kg；95%的置信區(qū)間為（15.875，22.528）。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及含量測定結(jié)果

3.3 小鼠肉芽腫實(shí)驗(yàn) 將濾紙裁剪為0.02 g，置于燒杯中，高壓滅菌備用；將60只小鼠隨機(jī)分6組（雌雄兼有），每組10只，分別是模型組、阿司匹林組、二丁顆粒組、試驗(yàn)藥物低劑量組、試驗(yàn)藥物中劑量組、試驗(yàn)藥物高劑量組，稱重，乙醚麻醉，左腹溝處消毒，切開皮膚，埋入滅菌濾紙，縫合；根據(jù)體重灌胃（0.8 mL/20 g），模型組用生理鹽水，阿司匹林0.208 mg/10 g，二丁顆粒78 mg/10 g，試驗(yàn)藥物低劑量11.7 mg/10 g，試驗(yàn)藥物中劑量23.4 mg/10 g，試驗(yàn)藥物高劑量46.8 mg/10 g。觀察小鼠外觀、行為、死亡情況；連續(xù)給藥9 d后無死亡，第10 d根據(jù)小鼠體重用10%水合氯醛麻醉后取出濾紙，80 ℃恒溫干燥24 h，稱紙片重量，計(jì)算肉芽腫脹度和肉芽腫脹抑制率。利用軟件SPSS 20.00處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肉芽腫脹度比較（±s，n=10）

表3 各實(shí)驗(yàn)組小鼠肉芽腫脹度比較（±s，n=10）

3.4 小鼠耳腫脹實(shí)驗(yàn) 將60只小鼠（雌雄兼有）隨機(jī)分6組，每組10只，分別是模型組、阿司匹林組、二丁顆粒組、試驗(yàn)藥物低劑量組、試驗(yàn)藥物中劑量組、試驗(yàn)藥物高劑量組，稱重，根據(jù)體質(zhì)量灌胃，模型組用生理鹽水，阿司匹林0.208 mg/10 g，二丁顆粒78 mg/10 g，試驗(yàn)藥物低劑量11.7 mg/10 g，試驗(yàn)藥物中劑量23.4 mg/10 g，試驗(yàn)藥物高劑量46.8 mg/10 g。觀察小鼠外觀、行為、死亡情況；連續(xù)給藥5 d后，于末次給藥后30 min后右耳兩面涂抹二甲苯20 μL致炎，左耳不涂做對照，1 h后處死，剪下兩耳，用打孔器在兩耳相同部位取片，稱重，計(jì)算腫脹度，腫脹抑制率。數(shù)據(jù)利用SPSS 20.00軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 各實(shí)驗(yàn)組小鼠耳腫脹度比較（±s，n=10）

表4 各實(shí)驗(yàn)組小鼠耳腫脹度比較（±s，n=10）

3.5 以白花龍膽花總黃酮提取量為指標(biāo)，對結(jié)果進(jìn)行方差分析 結(jié)果表明，各因素對白花龍膽花中總黃酮的提取影響的順序是B＞A＞C，（即料液比＞乙醇濃度＞提取時間）。因素A和B與各因素之間具有顯著性差異（P＜0.05），即乙醇濃度和料液比對白花龍膽花總黃酮提取量具有顯著性影響。因素C與各因素間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），即提取時間對白花龍膽花總黃酮提取量無顯著影響。見表5。

表5 方差分析結(jié)果

4 討論

黃酮類化合物是一類存在于自然界的，具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物，廣泛存在于植物藥物中，也是植物類藥物的主要有效成分之一。目前從植物藥物中提取黃酮類化合物方法有加熱回流法、超聲法、微波法等9種方法[9-10]。本研究中根據(jù)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)和參考文獻(xiàn)選擇乙醇加熱回流法提取白花龍膽花中的黃酮類化合物，并通過單因素試驗(yàn)，選擇乙醇濃度（A）、料液比（B）、提取時間（C）為3個考察因素，每個因素設(shè)置3個水平，進(jìn)行正交提取試驗(yàn)[11-12]，初步確定蒙藥白花龍膽花中提取黃酮類化合物的最佳工藝為 70%乙醇，料液比1:30，超聲提取時間20 min，即A2B3C1。

與模型組比較，阿司匹林組、二丁顆粒組、試驗(yàn)藥物中劑量組和高劑量組小鼠肉芽腫脹度顯著性降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），試驗(yàn)藥物低劑量組小鼠肉芽腫脹度無顯著性降低，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與模型組比較，阿司匹林組、二丁顆粒組、試驗(yàn)藥物低劑量組、試驗(yàn)藥物中劑量組和試驗(yàn)藥物高劑量組小鼠耳腫脹度顯著性降低，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。耳腫脹實(shí)驗(yàn)是將致炎物質(zhì)二甲苯涂抹于小鼠耳廓，增加其耳廓毛細(xì)血管通透性，導(dǎo)致增加滲入組織的液體，形成炎癥[13]，是一種常用炎癥模型。本研究中根據(jù)白花龍膽花在蒙醫(yī)復(fù)方中的實(shí)際應(yīng)用量和急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將白花龍膽花醇提物凍干粉分別按11.7 mg/10 g，23.4 mg/10 g和46.8 mg/10 g的3種不同劑量給予耳腫脹炎癥模型小鼠。結(jié)果顯示，23.4 mg/10 g，和46.8 mg/10 g 劑量組具有明顯降低模型小鼠耳腫脹度。肉芽腫（增殖相）實(shí)驗(yàn)是棉球、海綿、玻璃棒、濾紙等埋入動物局部皮下，可產(chǎn)生與臨床某些炎癥后期病理變化相似的肉芽增生[14-16]。本研究中分別按11.7 mg/10 g，23.4 mg/10 g和46.8 mg/10 g的3種不同劑量將白花龍膽花醇提物凍干粉給予肉芽腫模型小鼠（埋入濾紙）。結(jié)果顯示，23.4 mg/10 g，和46.8 mg/10 g 劑量組均具有明顯抑制肉芽腫脹度作用。從以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步得知，一定濃度的白花龍膽花醇提物具有明顯抗炎活性[17-20]。