化濁解毒方對多氯聯(lián)苯暴露大鼠胰島素抵抗及糖脂代謝的影響

郭勝男，劉弘毅，吳深濤*

（1.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，天津 300380；2.云南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，昆明 650000）

國際糖尿病聯(lián)盟（IDF）發(fā)布數(shù)據(jù)顯示，2017年全世界有4.51億糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者。預計到2045年將增加到6.93億。2017年全球醫(yī)療衛(wèi)生支出約為8 500億美元[1]。DM患病人群中90%患有2型糖尿病（T2DM），亞洲是全球T2DM流行病的中心，中國和印度排在前兩位[2]。T2DM是一種以高血糖為主要表現(xiàn)，進而引起糖、脂、蛋白質(zhì)紊亂的代謝性疾病。T2DM發(fā)病機制復雜，胰島素抵抗（Insulin Resistance,IR）和胰島素分泌受損是導致其發(fā)病的兩大機制。目前，傳統(tǒng)的發(fā)病因素，如遺傳、飲食結(jié)構(gòu)不合理及靜坐少動等已不能解釋T2DM患病率飛速增長的原因。研究[3]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)性有機污染物（Persistent organic pollutants,POPs）具有生物蓄積性和高毒性，并嚴重危害環(huán)境和人類健康，人體內(nèi)POPs 的積累與胰島素抵抗和T2DM具有相關(guān)性。早期研究[4]發(fā)現(xiàn)，脂代謝異常及脂毒性既是IR的結(jié)果，又是IR的重要致病因素。前期研究[5-6]表明，化濁解毒顆粒在改善SD大鼠糖、脂毒性相關(guān)胰島素抵抗方面療效確切。本研究選取POPs中典型的有機污染物—多氯聯(lián)苯，探討化濁解毒方對多氯聯(lián)苯暴露的ZDF大鼠胰島素抵抗及糖脂代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 動物及飼料 選擇SPF級雄性ZDF（fa/fa）大鼠為模型鼠，6周齡，體質(zhì)量180～200 g；選擇SPF級雄性ZDF（fa/+）大鼠為正常對照鼠，6周齡，體質(zhì)量140～160 g；均購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006。PMILabdiet 5008飼料：成分，粗蛋白24%，粗脂肪7.1%，粗纖維3.2%，無氮浸出物48.9%，礦物質(zhì)（有機物）6.7%，維生素3.2%，購自雍立（上海）生物科技有限公司。飼養(yǎng)于屏障級實驗動物中心（配備獨立通氣飼養(yǎng)籠），控制溫度20～25 ℃，濕度（55±10）%，12 h明暗交替照明（光照時間7:00—19:00）。實驗期間，動物自由攝食進水，每日更換墊料，保持籠內(nèi)干燥、清潔。

1.2 藥物 PCBs標準品，成分：2,2′,3,3′,4,5,6,6′-Octac hlorobiphenyl，均購自美國AccuStandard公司；化濁解毒方顆粒，藥物組成：黃連、大黃、姜黃、蟬蛻、僵蠶、枳實、清半夏、白芍、柴胡、黃芩、干姜、佩蘭，由天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥廠制備，批號：津藥制字（臨）Z20130944。

1.3 試劑與儀器 試劑：碘[125I]胰島素放射免疫試劑盒，購自北京北方生物技術(shù)研究所；游離脂肪酸測定試劑盒（比色法），南京建成生物工程研究所。儀器：羅氏血糖儀（型號：ACCU-CHEK），購自德國羅氏診斷有限公司；血糖試紙（型號：ACCU-CHEK），購自德國羅氏診斷有限公司，批號 477493；SN697雙探頭全自動放免γ計數(shù)器，購自上海核所日環(huán)光電儀器有限公司；全自動生化分析儀（規(guī)格型號：7020型ISE），購自日本日立公司；電子天平（型號：KFS-3000），購自浙江凱豐集團公司；低速多管架自動平衡離心機（型號：TDZ5-WS）生產(chǎn)廠家，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；分光光度計（型號：723S），購自上海棱光技術(shù)有限公司。

1.4 動物與分組 選取6周齡雄性ZDF（fa/fa）大鼠為模型鼠，以普通飼料適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，按照隨機數(shù)字表法隨機分為模型組與PCBs染毒組，共染毒4周，將PCBs染毒組隨機分為染毒組與化濁解毒方治療組，期間均以PMILabdiet 5008專用飼料喂養(yǎng)。選取6周齡雄性ZDF（fa/+）大鼠為正常對照鼠，始終以普通飼料喂養(yǎng)。

1.5 染毒及治療方法 PCBs用玉米油溶解，以5 μg·kg-1PCBs灌胃染毒，模型組和正常對照組以等體積玉米油灌胃，每日1次，共4周。化濁解毒方治療組按生藥6 g·kg-1·d-1灌胃給藥，余組以等體積生理鹽水灌胃，共治療4周。

1.6 口服葡萄糖耐量測定（OGTT）治療后對各組大鼠進行OGTT試驗。實驗前大鼠禁食不禁水12 h，于上午7時對各組大鼠依次剪尾，使用血糖儀檢測空腹血糖（FBG），隨后對實驗大鼠予以50%葡萄糖以2 g·kg-1的劑量灌胃，在灌胃后30、60、90、120 min再次剪尾檢測血糖濃度。

1.7 血清采集及觀察指標 治療后分別于大鼠目內(nèi)眥取血，將收集到的血漿樣本置于離心機中3 000 r/min 離心10 min收集血清，檢測空腹血糖（FBG）、空腹血清胰島素（FINS）、三酰甘油（TG）、膽固醇（TC）及游離脂肪酸（FFA）；參照李光偉教授發(fā)表的相關(guān)胰島素抵抗計算公式[7]，對各組大鼠的HOMA指數(shù)進行計算。公式如下：胰島素抵抗指數(shù)HOMA-IRI=FBG×FINS/22.5，胰島素敏感指數(shù)HOMA-ISI=Ln（1/（FBG×FINS））。

1.8 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 19.0軟件包進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（±s）表示，計量資料比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），2組間數(shù)據(jù)比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療后口服糖耐量試驗結(jié)果比較 見表1。

表1 各組大鼠治療后口服糖耐量試驗結(jié)果比較（±s，n =6） mmol·L-1

表1 各組大鼠治療后口服糖耐量試驗結(jié)果比較（±s，n =6） mmol·L-1

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與染毒組比較，▲P＜0.05

2.2 各組大鼠治療后空腹血清胰島素水平、胰島素抵抗與胰島素敏感指數(shù)比較 見表2。

表2 各組大鼠治療后空腹血清胰島素水平、胰島素抵抗與胰島素敏感指數(shù)比較（±s，n =6）

表2 各組大鼠治療后空腹血清胰島素水平、胰島素抵抗與胰島素敏感指數(shù)比較（±s，n =6）

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與染毒組比較，▲P＜0.05

2.3 各組大鼠治療后血脂水平比較 見表3。

表3 各組大鼠治療后血脂水平比較（±s，n =6）

表3 各組大鼠治療后血脂水平比較（±s，n =6）

注：與正常組比較，# P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05；與染毒組比較，▲P＜0.05

3 討論

自工業(yè)革命以來，人類有意或無意產(chǎn)生的許多化學物質(zhì)被釋放到生態(tài)系統(tǒng)中。自20世紀以來，這些有毒化學物質(zhì)不會降解的傾向性一直在報道。最具代表性的有毒化學物質(zhì)是持久性有機污染物（POPs）[8]，難以降解，具有親脂性和疏水性，并通過水、空氣及生物散布到世界各地，滲透到食物鏈中，從而污染和暴露所有生物，包括人類。POPs與人類和其它生物體的健康風險有關(guān)[9]，已經(jīng)在各種生物體中測出了持久性有機污染物[10]，例如人體血液、體脂和母乳，這些化學物質(zhì)沒有很好的代謝或排泄。早期流行病學數(shù)據(jù)顯示，長期持續(xù)接觸低濃度POPs的人群，其胰島素抵抗、葡萄糖代謝失衡和患T2DM的風險增加[11]，POPs增加了肥胖癥患者2型糖尿病的發(fā)病風險[12]。研究[13]證明慢性接觸多氯聯(lián)苯會加劇肥胖導致的小鼠胰島素抵抗和高胰島素血癥。流行病學和實驗研究表明，接觸包括多氯聯(lián)苯在內(nèi)的POPs會增加患胰島素抵抗和T2DM的風險[14]。

本研究結(jié)果進一步證實，PCBs具有導致ZDF大鼠IR的作用，且能夠升高TG與FFA水平。POPs導致IR的具體的分子機制尚未闡明，有研究[15]報道PCB-153通過肝細胞核因子1b（HNF1b）/ROS/NF-κB的失調(diào)來損害胰島素敏感性。本實驗PCBs使TG與FFA水平升高，可能是通過脂毒性導致IR。胰島素抵抗可以由各種情況引起，包括異常的胰島素信號傳導、脂毒性、炎癥、線粒體功能障礙和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（ER）應(yīng)激[14]。PCBs是否通過其他途徑導致IR，還有待進一步研究。導致T2DM發(fā)病的重要因素—濁毒，貫穿糖尿病的整個過程[16-18]。研究[19]表明，化濁解毒方在改善糖脂毒性及胰島素抵抗方面療效確切。該方以清代醫(yī)家楊栗山之古方升降散化裁，謂其“蓋取僵蠶、蟬蛻，升陽中之清陽；姜黃、大黃，降陰中之濁陰，一升一降，內(nèi)外通和，而雜氣之流毒頓消矣?！保ā逗疁貤l辨》卷四）；更以黃連清胃腸之熱，合大黃為君清熱解毒，蕩滌濁邪；加柴胡、黃芩為臣清利少陽，瀉肝膽而疏理脾胃；白芍柔肝斂陰，輔佐以不傷陰。枳實理氣導滯行濁；清半夏降濁合黃連辛開苦降，疏暢中焦；佩蘭和胃化濁消脾癉；干姜辛溫以暖中焦，兩者相合亦制它藥之苦寒，全方共奏化濁解毒，清肝和胃之功。本實驗研究表明，化濁解毒方能夠降低多氯聯(lián)苯暴露ZDF大鼠血糖、TG及FFA,改善糖耐量及胰島素抵抗，提高其胰島素敏感性。

綜上所述，化濁解毒方能夠改善多氯聯(lián)苯暴露ZDF大鼠的糖脂代謝及IR，可能與其改善糖脂毒性相關(guān)，具體機制還有待進一步研究。