兩種慢性萎縮性胃炎大鼠模型的建立與比較

趙唯含，于 勇，陳泳凝，簡祿勇，沈家林，陳 璐*

（1.陜西中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，陜西 咸陽 712000；2.陜西中醫(yī)藥大學，陜西 咸陽 712046）

慢性萎縮性胃炎（Chronic atrophic gastritis,CAG）為消化系統(tǒng)常見疾病，發(fā)病率占慢性胃炎的10%～20%。CAG動物模型的建立，是進行慢性萎縮性胃炎病因病機研究的重要基礎。幽門彈簧植入術配合高鹽熱淀粉糊灌胃法及MNNG復合多因素法均為目前常用的萎縮性胃炎造模方法。本研究擬分別采用這兩種方法復制慢性萎縮性胃炎模型，對比兩種模型的特征及穩(wěn)定性，為今后進一步研究藥物防治CAG的實驗研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 健康雄性Wistar大鼠220只，體質量（160±20）g，SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物許可證編號：SCXK（京）20090007，飼養(yǎng)于北京市中醫(yī)研究所SPF級動物飼養(yǎng)間，12 h光照/黑夜循環(huán)，相對恒溫（25℃），恒濕（75%）。

1.2 試劑 氯化鈉（分析純，北京化工廠）；可溶性淀粉（分析純，天津福晨化學試劑廠）；MNNG（日本TCI公司）；鹽酸雷尼替丁膠囊（石家莊中諾藥業(yè)有限公司）；無水乙醇（北京化工廠）；PGE1酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號：SEA165Ra），PGE2酶聯(lián)免疫試劑盒（武漢優(yōu)爾生科技股份有限公司，批號：SEA166Ra），GAS酶聯(lián)免疫試劑盒（美國abcam，批號：ab133049）。

1.3 主要儀器 活性金屬環(huán)型165宮內節(jié)育器（上海醫(yī)用縫合針廠），分析天平（上海精密科學儀器有限公司天平儀器廠），石蠟切片機（SLEE），離心機（Centrifuge 5415D，Eppendorf），BT224S 電子天平（德國 Sartouris 公司）。

1.4 模型的構建和分組 適應性飼養(yǎng)大鼠7d后，按隨機對照表分為空白組10只、假手術組10只、手術模型組100只和MNNG模型組100只。

1.4.1 幽門彈簧植入術配合高鹽熱淀粉糊灌胃法的萎縮性胃炎大鼠模型構建。

1.4.1.1 手術造模期 1）制備幽門彈簧：將活性金屬環(huán)型165宮內節(jié)育器剪成2 cm長的彈簧，螺距約為0.02～0.03 cm，所有彈簧經高溫蒸汽滅菌后使用；2）彈簧幽門植入術：雄性Wistar大鼠禁食不禁水16 h，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，開腹暴露胃，將制備好的彈簧插入幽門，逐層縫合胃及腹壁切口。假手術組不放入彈簧，其余操作相同。手術后禁食不禁水24 h，連續(xù)3 d予青霉素腹腔注射，每只每天40萬單位，恢復性飼養(yǎng)1周[1]。

1.4.1.2 藥物造模期 手術后第2周開始，造模大鼠給予含15%氯化鈉和25%可溶性淀粉的高鹽熱淀粉糊溶液灌胃，溫度控制在60℃左右，每只大鼠灌胃2 mL，每周2次，共造模4個月。

1.4.2 MNNG負荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法的萎縮性胃炎大鼠模型構建 造模大鼠每天自由飲用MNNG溶液（120 μg·mL-1），同時每天予雷尼替丁溶液灌胃（0.03 g·kg-1），每周禁食1次，每次16 h，禁食第2天不予雷尼替丁灌胃，代之以體積分數(shù)45%的乙醇（每只1 mL），連續(xù)造模14周[2]。

1.5 標本的采集 實驗大鼠禁食水16 h，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，沿胃大彎剪開，先進行大體觀察；取幽門與前胃與腺胃交界線連線的2/5部分，用10%中性福爾馬林液固定，石蠟包埋。動脈血置于離心管中常溫3 000 r·min-1離心10 min，取上清，-80℃保存，用于血清學指標測定。

1.6 模型評價

1.6.1 一般情況 觀察動物一般狀況體征的變化，每周給大鼠稱量體質量，每天記錄進食量、飲水量，并觀察大鼠的毛發(fā)情況、排泄情況以及一般活動狀況。

1.6.2 胃組織病理學評價 病理分析標準采用中國慢性胃炎共識意見中的病理診斷標準[3]。

1.6.3 血清PG I、PG II及GAS含量測定 按照說明書要求雙抗體兩步夾心酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定大鼠血清胃蛋白酶原I（pepsinogen I,PG I），胃蛋白酶原II（pepsinogen II,PG II）和血清胃泌素（Gastrin,GAS）水平。

1.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較計量資料符合正態(tài)分布且方差齊采用單因素方差分析，符合正態(tài)分布且方差不齊采用Welch檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 兩種模型在造模過程中均出現(xiàn)體質量降低，進食及飲水量較空白組減少，兩者之間對比無明顯統(tǒng)計學差異。幽門彈簧植入術配合高鹽熱淀粉糊灌胃法制備萎縮性胃炎大鼠模型死亡率為26.6%，MNNG負荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法制備萎縮性胃炎大鼠模型死亡率為20%。

2.2 造模期間各組大鼠體質量變化比較 與空白組比較，手術造模組及MNNG模型組大鼠毛發(fā)松散凌亂，沒有光澤，進食、飲水量均減少，體質量減輕，手術模型組從第2周開始差異明顯有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），MNNG模型組從第4周開始差異具有統(tǒng)計意義（P＜0.01），從第8周開始MNNG模型組體質量減輕更為明顯。假手術組體重減輕介于空白組及手術模型組之間。見表1。

表1 造模期間各組大鼠體質量變化比較（±s） g

表1 造模期間各組大鼠體質量變化比較（±s） g

注：與空白組比較，# P＜0.05，## P＜0.01

2.3 大鼠造模16周期間進食量變化比較 與空白組比較，手術模型組及MNNG模型組進食量均明顯減少，假手術組進食量介于空白組及模型組之間。

2.4 大鼠造模16周期間飲水量比較 與空白組比較，手術模型組及MNNG模型組的飲水量均減少，MNNG模型組減少尤為明顯，假手術組飲水量介于空白組及模型組之間。

2.5 各組大鼠血清PG I、PG II及PG I/PG II水平比較 見表2。

表2 各組大鼠血清PG I、PG II及PG I/PG II水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清PG I、PG II及PG I/PG II水平比較（±s）

注：與空白組比較，## P＜0.01

2.6 各組大鼠血清GAS水平比較 見表3。

表3 各組大鼠血清GAS水平比較（±s） pg·mL-1

表3 各組大鼠血清GAS水平比較（±s） pg·mL-1

注：與空白組比較，## P＜0.01

2.7 大鼠胃組織病理情況

2.7.1 肉眼觀察 空白組和假手術組：前胃無明顯變化，腺胃黏膜被覆較多黏液，黏膜紅潤，胃壁質地柔軟有彈性；手術模型組：腺胃黏膜表面黃染，暴露黏膜顏色較空白組和假手術組略白，胃壁質地較僵硬，彈性下降。MNNG模型組大鼠固有層腺體減少，排列不規(guī)則，間隙較大。

2.7.2 HE染色光鏡下觀察 空白組及假手術組大鼠黏膜結構正常，腺體排列緊密、整齊；手術模型組大鼠胃黏膜見不同程度的萎縮，黏膜層變薄，固有層腺體減少，排列稀疏不規(guī)則，細胞核著色深染，有炎性細胞浸潤，黏膜肌層增厚。MNNG模型組大鼠胃黏膜見明顯萎縮，固有層腺體減少，有腸上皮化生，少數(shù)見異型增生，細胞核著色深染，有炎性細胞浸潤。見圖1。

圖1 各組大鼠胃組織觀察（HE，×100）

3 討論

慢性萎縮性胃炎（CAG）是消化系統(tǒng)常見病，但其病因和發(fā)病機制至今仍未闡明，治療上也缺乏特異有效的藥物，因此建立理想的、模擬人類CAG發(fā)病機制的動物模型對于研究CAG發(fā)病機制和防治方法有著很重要的意義。

3.1 幽門彈簧植入術配合高鹽熱淀粉糊灌胃法的萎縮性胃炎大鼠模型特點 萎縮性胃炎發(fā)病與膽汁反流、高鹽飲食、高熱飲食等相關。研究[4]表明，膽汁反流與胃黏膜的腺體萎縮以及腸上皮化生呈正相關，也可以誘導胃癌發(fā)生。飲食溫度過高也是萎縮性胃炎發(fā)生的致病因素[5]，過熱飲食會對消化道造成刺激并損傷黏膜，甚至造成癌變。高鹽飲食是致癌因素之一[6]，其可能機制為氯化鈉濃度高時可以延長胃排空時間，導致致癌物質侵入胃黏膜。本次實驗選擇的15%氯化鈉溶液灌胃，同時加入25%的可溶性淀粉，可以使食鹽在胃內停留時間更長，出現(xiàn)持續(xù)性的胃黏膜損傷。

3.2 MNNG負荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法的萎縮性胃炎大鼠模型特點 該模型是以化學致癌劑MNNG作為工具藥造模，模擬人不當攝入硝酸鹽在胃內轉化為亞硝酸胺等致癌物質，作用于胃黏膜而成模的。亞硝酸鹽在胃內會被轉化成亞硝基化合物，進而產生氧自由基，進一步會發(fā)生癌變[7]。雷尼替丁是臨床常用的選擇性的H2受體拮抗劑，給大鼠每日灌胃雷尼替丁以期抑制其胃酸分泌，促使飲用入胃的硝酸鹽轉為亞硝酸鹽,起到加速致模作用。研究[8]證實飲酒后，乙醇先停留在胃部，對胃及十二指腸的影響極大，可誘發(fā)多種急性或慢性胃或十二指腸的疾病。MNNG給藥同時負荷饑飽失常和酒精刺激，模擬人的不健康飲食習慣，多因素誘發(fā)大鼠黏膜病變。

3.3 手術模型組與MNNG模型組的區(qū)別 2種模型在造模過程中均出現(xiàn)體質量降低，進食及飲水量較空白組減少，幽門彈簧植入術模型死亡率為26.6%，MNNG負荷多因素法模型死亡率為20%。2種模型的病理均出現(xiàn)黏膜萎縮，固有層腺體減少等。但MNNG模型組大鼠胃黏膜可見明顯腸上皮化生及異型增生，幽門彈簧植入術淋巴濾泡較多，炎癥反應明顯。兩種模型比較，幽門彈簧植入術造模更符合萎縮性胃炎的病理變化，炎性細胞浸潤較MNNG模型明顯，而MNNG造模腸上皮化生較為明顯，更趨向于萎縮性胃炎癌前病變的病理變化。

血清胃泌素（GAS）以及胃蛋白酶原（PG I）和（PG II）的檢測可以判斷萎縮有無以及萎縮的部位，對于模型起到輔助診斷的作用。GAS由胃竇G細胞分泌，當胃竇部發(fā)生萎縮時，G細胞數(shù)量減少，所以GAS下降可以認為是胃竇萎縮的標志[9]。胃蛋白酶原（PG）分為胃蛋白酶原I（PG I）和胃蛋白酶原II（PG II），它是胃蛋白酶的前體[10]，當萎縮發(fā)生在胃體時，PG I/PG II比值下降。本次實驗結果顯示MNNG模型組PG I/PG II含量較空白組下降（P＜0.05），MNNG模型組及手術模型組GAS含量均較正常組顯著降低（P＜0.01）。結合病理切片分析，幽門彈簧植入術誘導的CAG大鼠模型萎縮部位為胃竇部，MNNG誘導的CAG大鼠模型存在全胃萎縮，以胃竇萎縮為主。

綜上所述，幽門彈簧植入術配合高鹽熱淀粉糊灌胃法和MNNG負荷乙醇、雷尼替丁、饑飽失常法均可以成功構建CAG模型。病理方面，幽門彈簧植入術誘導的CAG模型大鼠可導致胃竇黏膜萎縮，而且胃黏膜炎性細胞浸潤較明顯，更符合萎縮性胃炎的病理變化；MNNG誘導的CAG大鼠模型可導致全胃萎縮，而且胃黏膜腸上皮化生較為明顯，并且可以出現(xiàn)異型增生，更趨向于萎縮性胃炎癌前病變的病理變化。