葡萄糖氧化酶在枯草芽孢桿菌芽孢表面的展示及其酶電極制備

林平，宋龍祥，常德軍，馬耀宏，王騰飛

1 齊魯工業(yè)大學(xué) (山東省科學(xué)院) 生物基材料與綠色造紙國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353

2 齊魯工業(yè)大學(xué) (山東省科學(xué)院) 山東省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250353

3 齊魯工業(yè)大學(xué) (山東省科學(xué)院) 生物研究所山東省生物傳感器重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103

葡萄糖-1-氧化酶 (Glucose oxidase，GOD)(β-D-葡萄糖氧化還原酶，EC 1.1.3.4) 是一種重要的糖蛋白，由2個相同的80 kDa亞基和2個黃素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 輔酶組成。在有氧條件下，能夠以分子氧為電子受體，將葡萄糖氧化為葡萄糖酸和過氧化氫。GOD主要生產(chǎn)菌株為黑曲霉和青霉，由于其氧化能力，顯示出較高的酶穩(wěn)定性，因此與其他酶相比，GOD在酶電極中起著主導(dǎo)作用[1-2]。但是，在電極的固定化過程中需要酶的純化，這增加了成本，并且已成為固定化酶電極開發(fā)領(lǐng)域的瓶頸[3]。另外，常規(guī)的物理或化學(xué)固定方法經(jīng)常導(dǎo)致酶活性損失、酶泄漏和傳質(zhì)阻抗[4]。

近幾年，隨著微生物表面展示技術(shù)的不斷發(fā)展，實(shí)現(xiàn)了微生物表面展示酶與酶電化學(xué)生物傳感器的結(jié)合。在傳感器的發(fā)展中，純度較高的商品酶應(yīng)用較多，但由于其制備和提取工藝極其繁瑣，使得酶的成本增加，這也就限制了商品酶生物傳感器的使用范圍。通過微生物表面展示技術(shù)，將外源蛋白展示在微生物表面，有利于提高酶的熱穩(wěn)定性和pH耐受性[5-8]。相比于商品酶，展示在微生物表面的酶不需要復(fù)雜的制備工藝，容易獲取，節(jié)約成本。因此，微生物表面展示技術(shù)與酶電化學(xué)生物傳感器的結(jié)合是一種必然趨勢。隨著完成枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis基因組的測序工作，B.subtilis芽孢表面已成功展示了多種外源蛋白，并因該菌株為安全菌株，無內(nèi)毒素，在許多生產(chǎn)領(lǐng)域備受認(rèn)可，如食品與醫(yī)藥、水質(zhì)凈化、飼料生產(chǎn)等領(lǐng)域[9-11]。構(gòu)建B.subtilis芽孢表面表達(dá)體系時，以芽孢衣殼蛋白為錨定蛋白，將外源蛋白融合展示在芽孢表面，因?yàn)檠挎呤窃诩?xì)菌細(xì)胞質(zhì)中合成的，所以外源蛋白的表達(dá)都不需要穿過任何膜，并且芽孢能抵抗惡劣的環(huán)境條件，有利于提高外源蛋白質(zhì)在復(fù)雜環(huán)境中的使用穩(wěn)定性[12-14]。發(fā)酵得到的重組芽孢可以直接用于電極修飾，避免因細(xì)胞破碎、雜質(zhì)分離造成的成本增加。

氧化石墨烯 (Graphene oxide，GO) 是石墨烯的氧化物，其片層上有大量的羥基和羧基活性基團(tuán)[15]，含氧官能團(tuán)隔開了石墨烯共軛自由基團(tuán)，使氧化石墨烯具有良好的親水性和機(jī)械性能[16]，而且為固定生物分子提供表面修飾活性位置和較大的比表面積，在電化學(xué)傳感器中還起到了信號放大的作用[17]。普魯士藍(lán) (Prussian blue，PB) 在低電位下可以迅速催化還原H2O2，因此，又被稱為“人工過氧化物酶”[18-19]。同時使用GO材料和PB電子媒介體構(gòu)建葡萄糖酶生物傳感器，有利于增強(qiáng)生物傳感器的靈敏度，這是因?yàn)镚OD催化葡萄糖產(chǎn)生的H2O2能接著被PB還原[19-20]。聚四氟乙烯 (Nafion) 能將酶包埋在聚合物材料的網(wǎng)格或微膠囊結(jié)構(gòu)中，防止酶的滲漏，而對應(yīng)的底物可以通過網(wǎng)格與Nafion內(nèi)部包埋的酶接觸使催化反應(yīng)正常進(jìn)行，這樣幾乎不改變活性物質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，因而不破壞酶的生物活性[21]。

本研究以枯草芽孢桿菌為宿主菌，構(gòu)建了芽孢展示GOD的重組菌，利用GO材料、PB電子媒介體構(gòu)筑了一種新型葡萄糖電化學(xué)生物傳感器。通過Western blotting、免疫熒光分析以及酶活檢測等手段證明GOD成功在芽孢表面展示并有效表達(dá)，同時還研究了所制備的基于芽孢表面展示GOD構(gòu)筑的葡萄糖電化學(xué)生物傳感器的各種影響因素、傳感器的檢測方法以及性能參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

pDG1730質(zhì)粒 (含amyE基因上下游同源臂)購自山東沃森生物科技有限公司。pET28a-god質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)室保存。感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌Escherichia coliDH5α購自南京諾唯贊生物科技有限公司。B.subtilisWB800n為實(shí)驗(yàn)室保存菌株，為cotX基因的來源菌株，也是外源蛋白的表達(dá)宿主菌。

1.1.2 培養(yǎng)基與實(shí)驗(yàn)試劑

SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒、DNA純化回收試劑盒、細(xì)菌基因組抽提試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒購于生工生物工程 (上海) 股份有限公司。限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ、2×Phanta Max Master Mix等工具酶購自賽默飛公司。無縫克隆試劑盒、核酸分子量Marker(DL5000)、蛋白分子量Marker購自南京諾唯贊生物科技有限公司。BSA、山羊血清、BCA蛋白濃度測定試劑盒、FITC-羊抗兔IgG、辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG購自博士德生物工程有限公司。Anti-GODZ antibody購自英國Abcam公司。5 wt%Nafion購自Sigma-Aldrich公司。氧化石墨烯 (GO)購自南京吉倉納米科技有限公司。D-(+)-葡萄糖購買于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。0.1 mol/L PBS(pH 7.0) 實(shí)驗(yàn)室自制。

LB (Luria-Bertani medium) 培養(yǎng)基(W/V):1%NaCl、0.5%酵母浸粉、1%蛋白胨；LB固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基中加入1.5%–2%瓊脂粉即可；LB淀粉培養(yǎng)基在LB培養(yǎng)基中添加1%淀粉即可，用于檢測淀粉酶酶活。

DSM (Difico sporulation medium)：0.8% (W/V)營養(yǎng)肉湯，0.1% KCl，0.025% MgSO4?7H2O，1 mmol/L Ca(NO3)2，0.01 mmol/L MnCl2，0.01 mmol/L FeSO4。

普魯士藍(lán)沉積液配制方法：用二次蒸餾水配制2.5 mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液，記為A液；2.5 mmol/L FeCl3，0.1 mol/L KCl，0.2 mol/L HCl溶液，記為B液；以及0.1 mol/L EDTA-Na2溶液，記為C液。使用時4.5 mL的A液、4.5 mL的B液和1 mL的C液混合。

1.1.3 主要儀器

DNA擴(kuò)增儀 (美國ABI)；水平電泳槽、蛋白質(zhì)電泳儀 (北京六一儀器廠)；濕式轉(zhuǎn)印槽 (北京君意)；超聲波破碎儀 (新芝生物科技股份有限公司)；高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf)；生物電泳凝膠成像分析系統(tǒng) (北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司)；激光共聚焦顯微鏡 (德國Leica) 等。電化學(xué)測量法是在CHI760D電化學(xué)分析儀 (中國上海辰華儀器公司) 完成的。臺式掃描電子顯微鏡；高速冷凍離心機(jī) (Eppendorf)；電子分析天平；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

使用特異性引物cotX-BamHⅠ-F和cotX-R從B.subtilisWB800n菌株基因組DNA中擴(kuò)增克隆芽孢衣殼蛋白基因cotX；使用特異性引物god-F和god-Hind Ⅲ-R，以pET28a-god質(zhì)粒為模板擴(kuò)增目的基因god(序列見表1)。將得到的PCR產(chǎn)物通過多片段無縫克隆技術(shù)連入經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的pDG1730質(zhì)粒中，得到重組質(zhì)粒pDG730-cotX-god，通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入B.subtilisWB800n感受態(tài)細(xì)胞，構(gòu)建重組菌B.subtilisWB800n-cotX-god。

表1 本研究中所用的引物序列Table 1 Primers used in this study

1.2.2 重組芽孢的制備

利用饑餓法在DSM (Difico sporulation medium) 培養(yǎng)基上誘導(dǎo)重組菌產(chǎn)生芽孢。取重組菌落點(diǎn)接5 mL LB (含壯觀霉素，工作濃度為100 μg/mL) 液體培養(yǎng)基 中，37 ℃過夜培養(yǎng)，然后在含壯觀霉素 (工作濃度為100 μg/mL) 的50 mL DSM中接入1% (V/V) 的菌液，37 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)96 h。培養(yǎng)結(jié)束后的菌體8 000 r/min離心20 min，除去上清，用無菌去離子水將沉淀洗滌2次，最后得到重組芽孢[22]。

1.2.3 重組芽孢Western blotting分析

提取重組菌B.subtilisWB800n-cotX-god芽孢表面總蛋白，采用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)樣品[23]，分離后的蛋白用濕轉(zhuǎn)法從凝膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，再用封閉液室溫下封閉1 h，將膜上封閉液洗凈后，把膜置于一抗 (Anti-GODZ antibody) 中，4 ℃條件下孵育12 h，將一抗回收，用TBST把膜洗3次，每一次振蕩洗滌5 min。再用對應(yīng)的二抗稀釋液與膜接觸，于室溫下孵育1 h，同樣回收二抗，用TBST洗膜3次，每次10 min，化學(xué)發(fā)光反應(yīng)后掃描[24]。

1.2.4 重組芽孢免疫熒光分析

將制得的重組芽孢加入適量一抗 (Anti-GODZ antibody)，置于冰上2 h，用抗體結(jié)合緩沖液洗滌離心盡量除去上清，再向其中加入由PBS適當(dāng)稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG (二抗)，置于冰上2 h，反應(yīng)結(jié)束后，再用抗體結(jié)合緩沖液洗滌離心，將適量芽孢懸液滴涂在載玻片上，蓋上蓋玻片，在室溫避光的環(huán)境中將其吹干，用熒光顯微鏡觀察[25]。

1.2.5 芽孢表面展示GOD的酶活分析[26]

一個酶活力單位為：30 ℃、pH 6.0的磷酸鹽緩沖體系下，每分鐘催化1 μmol/L葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸的酶的量。

取20 g/L的葡萄糖磷酸緩沖溶液25 mL于錐形瓶中，在30 ℃恒溫水浴中預(yù)熱3 min，加入樣品，混勻后立即計時反應(yīng)，準(zhǔn)確反應(yīng)60 min后立即加入0.1 mol/L的NaOH溶液20 mL，混勻終止反應(yīng)，加入1滴酚酞，用0.1 mol/L的HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定，記錄消耗HCl的體積V。

空白對照：用水代替酶液，其余步驟相同，消耗HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液體積為V0。

計算：GOD(U/g)=(V0?V)×C×N×1 000/(60×m)。

式中，C為HCl標(biāo)準(zhǔn)溶液的準(zhǔn)確反應(yīng)濃度；N為酶液的稀釋倍數(shù)；1 000為換算系數(shù)；60為反應(yīng)時間，單位為min；m為菌體干重。

1.2.6 Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE修飾電極的制備

將預(yù)處理玻碳電極表面快速晾干，向電極工作面滴涂5 μL氧化石墨烯溶膠，電極記作GO/GCE。晾干后浸入PB沉積儲備溶液中進(jìn)行PB沉積，沉積方法為循環(huán)伏安法，沉積條件為電壓?0.2–0.6 V，掃描速度50 mV/s，掃描圈數(shù)50圈。以去離子水充分清洗工作電極表面，晾干后向工作面滴涂5 μL的Spore-GOD懸液，置于4 ℃冰箱晾干，最后滴加5 μL的0.5 wt% Nafion溶液，晾干，修飾電極記作Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE，其制作方法和原理如圖1所示。

圖1 電極的制作過程及作用原理示意圖[27]Fig.1 Schematic diagram of electrode fabrication process and catalytic reaction mechanism[27].

2 結(jié)果與分析

2.1 重組枯草芽孢桿菌的PCR驗(yàn)證

將重組質(zhì)粒pDG1730-cotX-god轉(zhuǎn)入B.subtilisWB800n感受態(tài)細(xì)胞中，得到可以表達(dá)GOD的轉(zhuǎn)化子。PCR驗(yàn)證表明擴(kuò)增得到2 500 bp左右的目的片段 (圖2)，與理論值相同。未轉(zhuǎn)質(zhì)粒的B.subtilisWB800n沒有出現(xiàn)相應(yīng)的條帶，說明重組質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入。

圖2 重組菌B.subtilis WB800n-cotX-god的PCR驗(yàn)證Fig.2 PCR validation of recombinant B.subtilis WB800n-cotX-god.1:5 000 bp DNA marker;2–6:B.subtilis WB800n-cotX-god ;7:B.subtilis WB800n.

2.2 芽孢表面展示GOD的Western blotting分析

提取B.subtilisWB800n-cotX-god芽孢衣殼總蛋白后，Western blotting分析結(jié)果見圖3。圖中得到的82 kDa左右的特異性條帶表明重組芽孢表面成功展示了葡萄糖氧化酶。

圖3 重組菌B.subtilis WB800n-cotX-god的芽孢表面融合蛋白Western blotting分析圖Fig.3 Western blotting analysis of spore surface fusion enzyme of recombinant B.subtilis WB800n-cotX-god.

2.3 芽孢表面展示GOD的IF分析

取陽性轉(zhuǎn)化子B.subtilisWB800n-cotX-god的芽孢以及B.subtilisWB800n的芽孢進(jìn)行了IF分析，圖4A中可以看到，對照菌B.subtilisWB800n的芽孢在紫外光的激發(fā)下沒有出現(xiàn)熒光，而圖4B中B.subtilisWB800n-cotX-god的芽孢表面可以看到紅色熒光，表明外源蛋白GOD已經(jīng)成功展示在芽孢表面。

圖4 免疫熒光分析圖 (A:B.subtilis WB800n免疫熒光分析；B:B.subtilis WB800n-cotX-god免疫熒光分析)Fig.4 Immunofluorescence analysis of B.subtilis WB800n (A) and B.subtilis WB800n-cotX-god (B).

2.4 Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE修飾電極的表征

SEM被用于表征GO，GO/PB和Spore-GOD/GO/PB等材料的形態(tài)和分散情況。圖5A中GO表面具有褶皺，這種自然的褶皺對保持GO具有高的比表面積非常有利，有利于生物材料的吸附。圖5B為芽孢包埋在GO/PB復(fù)合材料表面的SEM，圖中可觀察到PB納米顆粒自由分散在GO表面，且GO表面的褶皺使芽孢更穩(wěn)定存在電極表面。

圖5 電極SEM表征圖 (A:GO;B:Spore-GOD/PB/GO)Fig.5 SEM characterizations of GO (A) and Spore-GOD/PB/GO (B).

2.5 修飾電極的電化學(xué)表征

循環(huán)伏安法 (CV) 被用以表征Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE電極的修飾過程，裸玻碳電極、GO/GCE電極和Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE電極都是在0.20 mol/L的KNO3溶液中記錄10–3mol/L K3Fe(CN)6溶液的循環(huán)伏安曲線。如圖6A所示，將GO滴在裸玻碳電極表面后，峰電流有所增加，這是因?yàn)镚O具有導(dǎo)電能力，可促進(jìn)電子傳遞。但是修飾電極Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE的峰電流較GO/GCE的降低了，這是由于Spore-GOD不導(dǎo)電，阻止了電子向電極表面的傳遞。

交流阻抗法 (EIS) 也是表征修飾電極的方法之一。如圖6B所示，圖譜中的半圓大小表明了電極的阻抗大小，其中GO/GCE修飾電極的半圓最小，阻抗最低，因?yàn)殡姌O表面的GO可以促進(jìn)電子傳遞，使該電極的阻抗小于裸玻碳電極；而修飾電極Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE的阻抗值最大，這是因?yàn)榇罅垦挎咦璧K了電子的傳遞。由EIS得到的結(jié)論與CV一致。

圖6 不同修飾電極的CV圖和EIS圖 (A：不同修飾電機(jī)的CV圖；B：不同修飾電極的EIS圖)Fig.6 CVs (A) and EIS (B) of different modified electrodes.

2.6 pH和溫度對傳感器的影響

影響生物傳感器響應(yīng)特性的因素主要有測試溶液的pH值和溫度?？疾霳afion/Spore-GOD/PB/GO/GCE傳感器在pH 2.5–10范圍內(nèi)對1 mmol/L葡萄糖溶液的電流響應(yīng)，結(jié)果如圖7所示。在pH小于7范圍內(nèi)，隨著pH的增大電流值也增大；在pH為7時，電流響應(yīng)最大；pH大于7.0時，電流響應(yīng)呈下降趨勢。所以本研究選擇pH 7.0的PBS作為檢測溶液。

圖7 溶液pH值對電流響應(yīng)的影響Fig.7 Effect of solution pH on current response.

實(shí)驗(yàn)還考察了測試溫度 (在20–70 ℃范圍內(nèi))對傳感器的影響。結(jié)果如圖8所示，溫度在20–40 ℃范圍內(nèi)時，隨著溫度的升高，傳感器的電流響應(yīng)值也會增大；溫度在40 ℃時，電流值達(dá)到最大；溫度大于40 ℃時，電流值開始下降。因?yàn)榭紤]到過高的溫度會使酶失去活性而影響實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和實(shí)驗(yàn)過程中操作的方便性，所以選擇室溫25 ℃作為檢測溫度。

圖8 溶液溫度對電流響應(yīng)的影響Fig.8 Effect of solution temperature on current response.

2.7 傳感器的性能研究

為了進(jìn)一步檢測Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE修飾電極的工作性能，采用循環(huán)伏安法研究了修飾電極的檢測線性范圍。

如圖9所示，Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE電極對葡萄糖的響應(yīng)良好，電極峰電流隨著底物濃度的增加而逐漸增大，在0.1–7.0 mmol/L的葡萄糖濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.992 9。信噪比為3時 (S/N=3)，根據(jù)3 σ規(guī)則計算可得葡萄糖的檢測下限為7.5 μmol/L，靈敏度為41.55 μA·L/(mmol·cm2)。因此，人體的空腹血糖濃度 (空腹血糖的正常范圍為3.89–6.11 mmol/L)在酶電極的線性范圍內(nèi)，可適用于人體血液中葡萄糖的直接檢測。該生物傳感器性能優(yōu)于其他文獻(xiàn)報道的用于葡萄糖檢測的傳感器，Zhang等[28]通過將MnO2納米線修飾玻碳電極，并將GOD固定在其表面制得葡萄糖生物傳感器，線性范圍為0.2–3.8 mmol/L，檢出限為25.56 μmol/L，靈敏度為38.2 μA·L/(mmol·cm2)；Zhao[29]在聚苯胺修飾的玻碳電極 (PANI/GCE) 上進(jìn)行了GOD的固載，制得的傳感器線性范圍為0.5–2.25 mmol/L；Wang等[30]制備的用于葡萄糖檢測的ZnO納米梳生物傳感器其檢測限為20 μmol/L，靈敏度為15.33 μA·L/(mmol·cm2)。

圖9 傳感器對不同濃度葡萄糖溶液的催化響應(yīng)圖Fig.9 Catalytic response of the sensor to glucose solutions with different concentrations.

2.8 傳感器的抗干擾性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)主要考察了抗壞血酸 (AA) 和尿酸(UA) 是否會對傳感器Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE產(chǎn)生干擾，在待檢測的1.0 mmol/L葡萄糖溶液里加入1.0 mmol/L抗壞血酸，1.0 mmol/L尿酸，葡萄糖的電流響應(yīng)沒有明顯的變化。說明該傳感器的抗干擾能力良好。

Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE傳感器的穩(wěn)定性和重復(fù)性。通過將Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE置于0.1 mmol/L葡萄糖溶液中進(jìn)行循環(huán)伏安掃描50圈，比較氧化峰電流，考察傳感器的穩(wěn)定性，得到電流值比最初電流增加了約5%，說明傳感器具有很好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。用同樣的方法分別制備了5根Nafion/Spore-GOD/PB/GO/GCE傳感器，測定同一份0.1 mmol/L葡萄糖溶液，電流值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 (Relative standard deviation，RSD) 為4.2%，這表明傳感器的制備方法具有較好的重現(xiàn)性。不使用時將該電極保存在4 ℃冰箱內(nèi)，用該電極每天測定0.1 mmol/L葡萄糖溶液，在1–10 d內(nèi)電流強(qiáng)度保持平穩(wěn)，未出現(xiàn)大幅度波動情況，10 d后電峰電流強(qiáng)度有所下降，這表明所制備的電極在10 d內(nèi)具有一定的穩(wěn)定性。

2.9 傳感器在實(shí)際樣品中的應(yīng)用

為描述該傳感器在實(shí)際分析中的可行性，將該傳感器用于實(shí)際血清中的葡萄糖檢測。為適應(yīng)該生物傳感器的檢測范圍，提高檢測準(zhǔn)確度，在檢測前將血樣用0.1 mol/L PBS (pH 7.0)適當(dāng)稀釋，每個樣品同時檢測3次。從表2可知，傳感器的回收率好，這表明構(gòu)建的電極具有實(shí)際應(yīng)用的可能性。

表2 實(shí)際樣品中葡萄糖含量的檢測Table 2 Determination of glucose content in actual samples

3 總結(jié)

利用重組芽孢以及GO材料和PB電子媒介體構(gòu)筑的新型葡萄糖電化學(xué)生物傳感器性能優(yōu)良，主要原因可能是：通過枯草芽孢桿菌芽孢表面展示GOD，芽孢優(yōu)良的抗逆性可有效提高外源蛋白GOD的穩(wěn)定性，從而有利于修飾電極的應(yīng)用和穩(wěn)定儲存；在電極構(gòu)建過程中引入Nafion溶液可以改善檢測過程中酶的滲漏問題，使得傳感器的穩(wěn)定性提高；GO-PB中的PB可以和Spore-GOD形成擬雙酶體系，使得信號放大，從而增強(qiáng)了生物傳感器的靈敏度；電極制備過程溫和，具有很好的生物兼容性，可以有效地保持酶的構(gòu)型和活性。

葡萄糖參與生命體代謝，是生命體能量的重要來源，對人體內(nèi)血糖含量的測定有利于疾病的診斷和預(yù)防。葡萄糖氧化酶是工業(yè)生產(chǎn)和醫(yī)學(xué)檢測中的一種重要用酶，但是由于酶分子的活性中心深埋其內(nèi)部、直接吸附在電極表面容易變形和污染等原因，大大限制了葡萄糖氧化酶電極的進(jìn)一步發(fā)展。本研究利用枯草芽孢桿菌芽孢表面展示技術(shù)將GOD展示到芽孢表面，可直接發(fā)酵獲取大量重組芽孢，避免了細(xì)胞破碎引起的污染及酶的純化成本問題，具有一定的應(yīng)用價值。將GO/PB復(fù)合膜修飾玻碳電極制成電化學(xué)傳感器用于葡萄糖的靈敏測定。此修飾電極具有良好的導(dǎo)電性能、催化性能、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，可適合于檢測人體血糖濃度。