O2血清型肺炎克雷伯氏菌多糖結(jié)合疫苗的生物合成

張璐璐，潘超，馮爾玲，華孝挺，俞云松，王恒樑，朱力

1 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100071

2 浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院 浙江省微生物技術(shù)與生物信息研究重點實驗室，浙江 杭州 310016

肺炎克雷伯氏菌 (Klebsiella pneumonia，Kp)是一種普遍存在于環(huán)境中、人和動物皮膚表面和黏膜上的革蘭氏陰性菌。它是條件致病菌，可引起肺炎、眼內(nèi)炎、肝膿腫以及菌血癥等疾病，容易感染幼兒以及年老體弱者，已成為目前醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染的最主要致病因素之一[1]。Kp常常具有耐藥性，為其治療帶來了巨大的困難。近年來報道的能夠產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(Extended-spectrum β-lactamase，ESBL) 的Kp病例逐漸增加，臨床上幾乎面臨無藥可用的局面。另外，高毒力Kp的出現(xiàn)，使得健康的成年人也極易感染該病原菌；而且由于耐藥菌和高毒力菌株越來越具有交叉和重疊的趨勢[2]，迫切需要研制出一種能夠有效預(yù)防其感染的疫苗。

Kp的胞外多糖包括莢膜多糖和O特異多糖。莢膜多糖有77種[3]，其中K1血清型流行性較高，有研究者曾制備過莢膜多糖疫苗[4]，該疫苗雖能夠刺激機體產(chǎn)生較高的IgG抗體效價，但由于生產(chǎn)工藝復(fù)雜，難以進(jìn)一步擴大生產(chǎn)。而KpO特異多糖只有8種，其中O1和O2血清型是主要流行型[5]，因此制備O抗原多糖疫苗比莢膜疫苗更具備可行性。目前大部分針對KpO多糖結(jié)合疫苗的研究主要集中在化學(xué)交聯(lián)法制備的疫苗上[6]，其免疫原性強，能夠增強細(xì)胞吞噬作用，但缺點是過程繁瑣、成本高昂并且產(chǎn)品質(zhì)控困難。

同化學(xué)交聯(lián)法相比，多糖結(jié)合疫苗的生物法制備是在構(gòu)建工程菌株的基礎(chǔ)上，利用細(xì)菌在周間質(zhì)酶促合成糖蛋白，省去了對多糖和底物蛋白的多次純化，因此降低了生產(chǎn)成本，更有利于產(chǎn)品質(zhì)控，并且不存在復(fù)雜的環(huán)保排放問題。據(jù)報道已有研究者利用生物法成功制備了KpK1/K2型莢膜多糖結(jié)合疫苗[7]。

相對于莢膜多糖結(jié)合疫苗，KpO血清型種類少，因此制備O血清型疫苗更具有經(jīng)濟性。本文以臨床分離株Kp355為研究對象，通過生物法制備多糖結(jié)合疫苗。Kp355由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院饋贈，經(jīng)驗證其血清型為O2型。Kp355waaL基因編碼O抗原連接酶，能夠?qū)⒆陨淼腛多糖轉(zhuǎn)移到核心寡糖上形成脂多糖LPS，敲除該基因后細(xì)菌無法合成完整的脂多糖，毒力明顯降低且周間質(zhì)中出現(xiàn)大量游離的O多糖。腦膜炎耐瑟氏菌編碼的糖基轉(zhuǎn)移酶PglL具有非常寬松的底物特異性，可以識別并催化O多糖轉(zhuǎn)移到含29個糖化位點的重組霍亂毒素B亞單位 (rCTB) 上。將具有上述兩種蛋白 (PglL和rCTB) 編碼基因的糖基工程載體導(dǎo)入構(gòu)建的Kp355waaL缺失株(Kp355△waaL) 中后，PglL可催化游離的O多糖轉(zhuǎn)移到rCTB上，從而能夠在突變株細(xì)菌周間質(zhì)中合成帶有Kp355 O抗原結(jié)構(gòu)的糖蛋白(C-OPSKp)。這種多糖蛋白綴合物有望成為新型多糖結(jié)合疫苗。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌株與實驗動物

Kp355由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院分離并保存，大腸桿菌Escherichia coliDH5α感受態(tài)購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司；SPF級BALB/c小鼠，5–6周齡，雌性，購自斯貝福 (北京) 生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 質(zhì)粒與試劑

糖基工程載體pET28a-PglL-CTB以及質(zhì)粒pET28a-CTB、pKOBEG、pET-Kan、pCP20等均為軍事醫(yī)學(xué)研究院生物工程研究所保存。質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收與PCR產(chǎn)物回收試劑盒均購自江蘇康為世紀(jì)生物科技有限公司。蛋白親和純化樹脂購自羅氏公司。Superdex200分子排阻色譜樹脂購自GE公司。引物由北京天一輝遠(yuǎn)公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 Kp355 O抗原連接酶基因waaL的敲除

利用λ-Red重組系統(tǒng)[8]敲除Kp355waaL基因。根據(jù)Kp355waaL基因及其上下游序列，設(shè)計構(gòu)建基因打靶片段所需引物，具體引物名稱及序列見表1。其中引物waaL-up-F、waaL-up-R擴增waaL基因上游同源臂，waaL-dw-F、waaL-dw-R擴增下游同源臂；同時為了驗證突變體構(gòu)建是否成功，設(shè)計了基因組上waaL基因上下游同源臂以外的一對引物waaL-out-F和waaL-out-R，內(nèi)部檢測引物waaL-in-F和waaL-in-R。將上下游同源臂通過酶切連接的方式，分步連接到載體pET-Kan上；之后以含有靶基因上下游同源臂的載體pET-Kan為模板，利用引物waaL-up-F和waaL-dw-R擴增waaL基因打靶片段，將擴增產(chǎn)物進(jìn)行回收得到打靶片段。

表1 基因敲除引物Table 1 Primers for gene-knockout experiments

通過電擊轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pKOBEG導(dǎo)入Kp355中，其中pKOBEG編碼合成3種與同源重組相關(guān)的酶Exo、Beta、Gam；在打靶片段存在下，可以將宿主基因組上的目的基因片段置換下來從而實現(xiàn)基因的敲除。將含有該質(zhì)粒的Kp355陽性克隆在試管中轉(zhuǎn)接兩代后再接種至50 mL低鹽LB培養(yǎng)基中，置于30 ℃搖床培養(yǎng)，在細(xì)菌培養(yǎng)到600 nm紫外吸收峰 (OD600) 為0.5前的1 h加入終濃度為1 mmol/L的阿拉伯糖；1 h后將菌液置于冰上30 min，之后8 000 r/min離心8 min收菌，并用預(yù)冷的10%甘油洗3次制備Kp355/pKOBEG感受態(tài)細(xì)胞，最后電轉(zhuǎn)打靶片段到制備好的Kp355/pKOBEG感受態(tài)中，30 ℃復(fù)蘇1–2 h后涂布于卡那霉素終濃度為50 μg/mL的抗性平板，次日利用內(nèi)外部引物進(jìn)行PCR篩選陽性克隆。由于篩選到的重組菌株含有Kan篩選基因及兩側(cè)的FRT位點，因此將其培養(yǎng)于42 ℃搖床并轉(zhuǎn)接3代去除pKOBEG后，再導(dǎo)入另一溫敏質(zhì)粒pCP20，pCP20編碼Flp重組酶可誘導(dǎo)兩側(cè)FRT位點重組從而去除Kan片段，最終得到不含篩選標(biāo)記的缺失株Kp355△waaL。對野生株Kp355以及缺失株Kp355△waaL進(jìn)行表型鑒定，即通過銀染觀察敲除前后細(xì)菌LPS結(jié)構(gòu)的差異，并用梅里埃API 50 CH 試劑條檢測糖代謝差異。

1.2.2 底物蛋白rCTB的表達(dá)及其糖基化水平的檢測

將Kp355以及Kp355△waaL制成感受態(tài)，均導(dǎo)入實驗室保存的糖基工程質(zhì)粒pET28a-PglL-CTB以及對照質(zhì)粒pET28a-CTB，加入液體LB培養(yǎng)基在37 ℃搖床復(fù)蘇1–2 h，涂布到抗性平板上，37 ℃溫箱培養(yǎng)過夜。第2天挑選PCR驗證正確的陽性單克隆，將其在試管中轉(zhuǎn)接兩代；第2代37 ℃搖床培養(yǎng)到對數(shù)生長期后，加入終濃度為1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-Dthiogalactopyranoside，IPTG)誘導(dǎo)劑，置于30 ℃搖床過夜誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。第2天將每組樣品各取1 mL，13 000 r/min離心1 min，棄上清收集菌體沉淀，加入100 μL蒸餾水重懸菌體，再加入等體積的2×SDS上樣緩沖液，沸水浴10 min后進(jìn)行SDS-PAGE；待電泳結(jié)束后用半干轉(zhuǎn)印儀將膠上的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，15 V恒壓轉(zhuǎn)印65 min，用鼠源HRP-Anti-His tag 單克隆抗體檢測不同菌株中底物蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3 Kp355 C-OPSKp的純化與糖定量

將攜帶糖基工程載體pET28a-PglL-CTB的Kp355△waaL，以1︰100的比例接種于2 L三角瓶中，37 ℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)生長期后加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)劑，30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)過夜。第2天8 000 r/min離心8 min收集菌體沉淀，以溶液A1 (0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5) 重懸菌體后，經(jīng)過勻漿機充分破碎直至菌懸液澄清，離心取上清；將上清通過A1平衡過的鎳離子親和層析柱，之后洗脫非特異性結(jié)合的雜蛋白，用高濃度咪唑溶液B1 (0.5 mol/L NaCl，500 mmol/L咪唑，20 mmol/L Tris-HCl，pH 7.5) 洗脫目的蛋白；將得到的樣品濃縮后經(jīng)過凝膠過濾層析 (Superdex200分子排阻色譜樹脂) 進(jìn)一步純化，根據(jù)蛋白質(zhì)在280 nm處吸收值的變化收集樣品，樣品經(jīng)SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色和蛋白免疫印跡檢測蛋白表達(dá)情況，蒽酮濃硫酸法檢測其糖含量。

1.2.4 候選疫苗的實驗動物免疫評價

將Kp355培養(yǎng)至OD600為2.0時的菌液進(jìn)行梯度稀釋涂布，計算每毫升菌液所含有的菌落形成單位 (Colony forming unit，CFU)。根據(jù)Kp355OD600為2.0時的菌液濃度，預(yù)先設(shè)置3個梯度，即分別以106CFU/只、107CFU/只、108CFU/只的菌量腹腔注射小鼠，每組5只；再根據(jù)攻毒后小鼠一周的存活率，將致死劑量的范圍進(jìn)一步縮?。好拷M設(shè)置10只，每組的活菌注射量相差不超過0.5×107CFU，攻毒后觀察小鼠一周存活情況，確定小鼠攻毒實驗的半數(shù)致死劑量 (LD50)。

將5–6周齡雌性BALB/c隨機分為5組，每組8只，分別是PBS組、糖蛋白組、糖蛋白+鋁佐劑(Al(OH)3) 組、糖蛋白+角鯊烯 (Squalene) 組以及糖蛋白+Poly(I:C)[9]組。每只小鼠按照2.5 μg多糖含量分別于第0、14、28天進(jìn)行腹腔免疫，第3次免疫后10 d斷尾取血，分離血清；以Kp355 LPS為抗原包被酶標(biāo)板，間接ELISA法測定血清抗體效價，三免后第14天進(jìn)行腹腔攻毒，觀察各組小鼠存活率。通過測定的抗體效價以及存活曲線，評價該糖蛋白疫苗的保護(hù)效果以及不同佐劑之間保護(hù)效果的差異。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析

間接ELISA法測定小鼠血清抗體效價時，以陰性血清值的2.1倍為陽性標(biāo)準(zhǔn)判斷；兩組比較采用t檢驗，以P<0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Kp355 O抗原連接酶基因waaL的缺失

通過λ-Red重組技術(shù)敲除了Kp355waaL基因，缺失株P(guān)CR驗證結(jié)果如圖1A所示，用內(nèi)部引物PCR擴增后，缺失株結(jié)果為陰性，而野生株為陽性；外部引物擴增后缺失株和野生株產(chǎn)物的條帶大小均符合理論值1.4 kb和2.2 kb，并且外部引物擴增產(chǎn)物測序結(jié)果與理論序列結(jié)果一致；khe引物為驗證Kp種屬特征性引物[10]，以排除雜菌污染。結(jié)果表明我們在基因?qū)用娉晒η贸藈aaL基因，得到缺失株Kp355△waaL。之后將蛋白酶K消化后的野生株和缺失株全菌蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后進(jìn)行銀染，結(jié)果如圖1B所示，由于野生株LPS O側(cè)鏈重復(fù)單位的數(shù)量并不相同，因此呈現(xiàn)分子量差異相對固定的典型梯狀LPS條帶[5]，而缺失株由于waaL基因缺失糖鏈無法轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)A核心，因此無LPS典型條帶。接著，又對Kp355和Kp355△waaL的生長狀態(tài)和生理生化特性進(jìn)行了探究。結(jié)果如圖1C所示，兩株菌生長曲線無明顯差異，通過參考API 50CH試驗條成分 (表2) 發(fā)現(xiàn)其糖代謝能力除D-塔格糖以及2-酮基-葡萄糖酸鹽代謝有略微差異外，其他種類糖代謝未見明顯差異 (圖1D)，表明waaL基因的缺失對菌株的生長和代謝無明顯影響。

圖1 Kp355 waaL基因缺失株的構(gòu)建及鑒定Fig.1 The construction of Kp355 waaL gene deletion mutants.(A) Identification of Kp355 waaL gene deletion by PCR.(B) Silver staining of Kp355 wild type and waaL mutant.(C) Growth curves of Kp355 wild type and waaL mutant strain.(D) Carbohydrate metabolism tests of Kp355 wild type and waaL mutant strain using API 50 CH kits.

表2 API 50CH試驗條成分Table 2 Components of API? 50 CH kit

2.2 底物蛋白rCTB的表達(dá)及其糖基化水平的檢測

在Kp355和Kp355△waaL中均導(dǎo)入質(zhì)粒pET28a-PglL-CTB以及pET28a-CTB后，將其全菌蛋白樣品經(jīng)過SDS-PAGE分離后，通過蛋白免疫印跡 (Western blotting，WB) 檢測rCTB的表達(dá)，其中質(zhì)粒pET28a-PglL-CTB表達(dá)的PglL和rCTB分別定位于細(xì)菌內(nèi)膜上和周間質(zhì)中。結(jié)果如圖2所示，在Kp355△waaL中共表達(dá)PglL和底物蛋白rCTB時，細(xì)菌本身游離的O-抗原多糖在糖基轉(zhuǎn)移酶PglL催化下轉(zhuǎn)移到載體蛋白rCTB上，因此WB條帶上呈現(xiàn)了底物蛋白條帶向高分子量區(qū)域遷移的現(xiàn)象；同時，由于細(xì)菌多糖為串聯(lián)重復(fù)單位，因此呈現(xiàn)出典型的梯狀條帶，表明蛋白與細(xì)菌多糖成功偶聯(lián)，得到了帶有Kp355 O多糖的糖蛋白 (C-OPSKp)；而對照組在無PglL的情況下只有底物蛋白的表達(dá)。

圖2 rCTB蛋白糖基化鑒定Fig.2 Identification of glycosylated rCTB.

2.3 Kp355 C-OPSKp的純化

通過對表達(dá)Kp355 O抗原糖蛋白工程菌的大量培養(yǎng)和發(fā)酵純化，得到了純度較高的糖蛋白。由于底物蛋白rCTB帶有6個組氨酸標(biāo)簽，通過鎳柱親和層析進(jìn)行第一步純化，可用低濃度咪唑溶液A1洗脫雜蛋白，高濃度咪唑溶液B1洗脫目的蛋白；再根據(jù)目的蛋白與雜蛋白分子大小的差異將樣品通過凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，以盡可能地除去雜蛋白。圖3A為將樣品注射入分子排阻色譜柱后，OD280值隨流經(jīng)色譜柱緩沖液體積的變化，箭頭所示為樣品收集峰，約為上樣后80 mL處。通過考馬斯亮藍(lán)染色檢測糖蛋白樣品 (圖3B) 可以看出，純化得到的C-OPSKp糖蛋白純度較高，樣品中幾乎沒有雜蛋白，說明鎳柱親和層析以及凝膠過濾層析兩步足以去掉絕大多數(shù)雜蛋白。經(jīng)計算每升LB培養(yǎng)基得到的糖蛋白中糖含量約為120 μg左右。

圖3 糖蛋白C-OPSKp的純化Fig.3 Purification of glycoprotein C-OPSKp.(A) The optical density at 280 nm changes with PBS elution after sample injection.The arrow points to the appearance peak of C-OPSKp.(B) Detection of the purified glycoprotein by commassie stain and Western blotting.

2.4 Kp355 LD50測定與疫苗保護(hù)效果評價

將Kp355培養(yǎng)至OD600為2.0時，對其進(jìn)行計數(shù)，經(jīng)計算每毫升菌液約含有1×109CFU。通過觀察不同活菌劑量組小鼠一周存活率的變化，得出其LD50為2.0×107CFU。

隨后，我們通過糖蛋白疫苗刺激小鼠產(chǎn)生的抗體效價、抗體亞型效價以及攻毒后不同佐劑組小鼠一周存活率的差異，來探究該疫苗的保護(hù)效果[11]。如圖4A–E所示，各組小鼠血清抗體效價以10為底做對數(shù)變換后的結(jié)果為縱坐標(biāo)，橫坐標(biāo)為不同試驗組以及PBS組，試驗組的總體IgG抗體效價均與PBS組差異明顯，無佐劑組、角鯊烯佐劑組以及Poly(I:C) 佐劑組的抗體效價均高于鋁佐劑組；按照上述Kp355兩倍半數(shù)致死劑量腹腔攻擊小鼠，結(jié)果如圖4F所示，同總體IgG抗體效價測定結(jié)果一致，無佐劑組、角鯊烯佐劑組以及Poly(I:C) 佐劑組小鼠的存活率均可達(dá)75%，與PBS組差異明顯，表明本研究制備的糖蛋白疫苗能夠保護(hù)小鼠免于Kp355致死劑量的攻擊。

圖4 C-OPSKp的保護(hù)效果Fig.4 Protective effect of C-OPSKp.Serum anti-LPS IgG (A),IgG1 (B),IgG3 (C),IgG2a (D),IgG2b (E) antibody titers were detected by ELISA.(F) Survival rate of different groups in one week after injection with Kp355 lethal dose at 4.0×107 CFU.*:P<0.05;**:P<0.01;***:P<0.001;****:P<0.000 1.

3 討論

來自腦膜炎奈瑟球菌的糖基轉(zhuǎn)移酶PglL具有非常寬松的底物特異性[12]，能夠催化多種糖單位轉(zhuǎn)移到底物蛋白的絲氨酸、蘇氨酸殘基上，使底物蛋白發(fā)生O糖基化修飾。本研究所用糖基工程載體編碼合成的糖基轉(zhuǎn)移酶PglL可在細(xì)菌周間質(zhì)將多糖轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，目前已實現(xiàn)在多個菌種的底物蛋白糖基化，如志賀菌、鮑曼不動桿菌以及霍亂弧菌等。在本研究中，該載體在Kp waaL缺失株中也能將細(xì)菌Kp的O多糖轉(zhuǎn)移到底物蛋白上，說明PglL也能夠識別此類型的O糖結(jié)構(gòu)，拓展了O-連接多糖體系的應(yīng)用。

本研究制備的KpO2血清型糖蛋白能夠刺激小鼠產(chǎn)生較高的抗體效價、保護(hù)75%的小鼠免于致死劑量的攻擊，且配伍不同佐劑糖蛋白疫苗組的抗體亞型效價之間存在一定的差異。聚肌苷酸Poly(I:C)是一種雙鏈RNA、干擾素誘導(dǎo)劑，能夠激活TLR3，可在抵抗病毒感染中發(fā)揮重要作用，其主要介導(dǎo)粘膜免疫；配伍角鯊烯佐劑糖蛋白疫苗組小鼠產(chǎn)生的IgG1抗體效價高達(dá)1︰10 000，與其他試驗組差異明顯 (P<0.05)，并且IgG3和IgG2b的抗體效價均不低于1︰1 000。

根據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查研究，KpO1和O2屬于主要流行株，其中O2血清型多糖由于其較低的免疫原性不能有效激發(fā)機體的免疫反應(yīng)[13]，感染后難以被人體免疫系統(tǒng)清除，因此最近流行性呈上升趨勢，而單獨的多糖制備的疫苗由于這種較低的免疫原性，無法作為有效的疫苗產(chǎn)品。本研究制備的Kp多糖結(jié)合疫苗攜帶的多糖屬于O2型，通過簡單的糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)，一步將多糖連在載體蛋白rCTB上，成功制備多糖結(jié)合疫苗。此候選疫苗能夠刺激小鼠產(chǎn)生較高的抗體效價，并且攻毒后試驗組小鼠具有較高的存活率，能夠保護(hù)小鼠免于Kp355致死劑量的攻擊，有望成為針對肺炎克雷伯氏菌的新型候選疫苗，對預(yù)防醫(yī)院和社區(qū)獲得性感染具有重要的意義[14]。

另有研究表明KpO1血清型抗體的被動免疫能夠保護(hù)小鼠免受致死劑量的攻擊[15]。已有研究表明通過將O2多糖基因簇與Kp的wbbY和wbbZ基因共表達(dá)可得到O1多糖，因此理論上我們的技術(shù)可以進(jìn)一步制備O1血清型多糖結(jié)合疫苗，從而實現(xiàn)針對Kp不同血清型更為廣泛的保護(hù)。