β-甘露聚糖酶Man5A和木聚糖酶Tlxyn11B的融合表達(dá)

孔海洋，蔣肖，王苑，黃火清，羅會穎

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院飼料研究所，北京 100081

半纖維素這一概念于1891年由Schulze提出，表示植物中能夠用2%–20%的NaOH溶出的酸性多糖，通常占植物干重的15%–30%[1]，硬質(zhì)木材和禾本科植物中半纖維素的主要成分為木聚糖[2]，而植物的種子和果實中半纖維素主要成分為甘露聚糖[3]。木聚糖酶、甘露聚糖酶在半纖維素的生物轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮重要作用[4]。在半纖維素的水解中甘露聚糖酶和木聚糖酶通常聯(lián)合使用[3]，且兩種酶在降解半纖維素方面存在協(xié)同效果[5]。木聚糖酶 (Endo-1,4-β-xylanase，EC 3.2.1.8) 能夠作用于含有β-1,4木糖苷鍵的木聚糖的主鏈并將其降解為木二糖及木二糖以上的寡聚和少量木糖[6]。主要分布在糖苷水解酶 (Glycoside hydrolase，GH)第5、7、8、10、11和43家族[7]，其中GH10和GH11家族研究最多，GH10家族木聚糖酶采用(β/α)8桶狀結(jié)構(gòu)，而GH11家族木聚糖酶為β-果凍卷結(jié)構(gòu)，它們均以雙保留機制對底物進(jìn)行降解(催化氨基酸為兩個谷氨酸)。β-甘露聚糖酶(β-1,4-mannanase，EC 3.2.1.78) 能夠水解含有β-1,4-D-甘露糖苷鍵的甘露聚糖，主要分布在糖苷水解酶GH5和GH26家族[8-10]，兩個家族序列相似性通常不足20%，但它們均為規(guī)則的TIM桶結(jié)構(gòu)且采用相同的雙保留機制 (催化氨基酸通常為位于第4個和第7個β-折疊片上的谷氨酸)[11-12]，此外在GH113和GH134等家族甘露聚糖酶也有少數(shù)分布。糖苷水解酶除了含有一個成熟的催化結(jié)構(gòu)域，通常還含有一個碳水化合物結(jié)合結(jié)構(gòu)域，目前根據(jù)氨基酸序列，結(jié)合特異性和結(jié)構(gòu)被分為86個家族 (CAZy數(shù)據(jù)庫：www.cazy.org)，它們之間通常借助一個較短的連接區(qū)進(jìn)行連接，CBM通常與底物的水解和酶的穩(wěn)定性相關(guān)，已有報道的甘露聚糖酶中含有的CBM結(jié)構(gòu)域分布在CBM1、2、27、35等家族中，通常由β折疊片構(gòu)成三明治結(jié)構(gòu)[13-16]。

有的糖苷水解酶具有雙功能或多功能，但天然存在的多功能酶普遍存在活性低、耐酸堿及高溫能力差等特點[17-20]。蛋白質(zhì)融合技術(shù)作為一種具有簡化生產(chǎn)工藝、節(jié)約生產(chǎn)成本、改善酶學(xué)性質(zhì)等優(yōu)點的基因工程技術(shù)，近年來在蛋白的表達(dá)、純化、性質(zhì)改良、獲得雙功能或多功能蛋白、功能特異性的多功能抗體和蛋白的表面展示等方面均有應(yīng)用[21]。在植物生物質(zhì)的酶解方面蛋白質(zhì)融合也得到了廣泛的應(yīng)用，Elleuche等將耐寒基因與木聚糖酶基因進(jìn)行融合，獲得的酶的耐低溫能力大幅提升[22]。Lu 等融合了葡聚糖酶和木聚糖酶，極大改善了融合酶的催化效率[23]。張獻(xiàn)偉等通過將黑曲霉來源的木聚糖酶和甘露聚糖酶借助連接肽進(jìn)行融合并在豬腎細(xì)胞 (pK15) 中進(jìn)行表達(dá)，融合酶中的木聚糖酶和甘露聚糖酶的活性分別比單獨表達(dá)時提高了54.0%和104.4%[24]。Adlakha 等把從昆蟲腸道中獲得的木聚糖酶與纖維素酶融合表達(dá)，融合酶較親本酶活性也都有一定提高[25]。

藍(lán)狀菌T.leycettanusJCM12802是一株耐熱真菌，最適生長溫度為40 ℃，目前已經(jīng)從該菌株克隆獲得了大量的生物質(zhì)降解酶資源，且多數(shù)具有耐高溫的特性[26]，本實驗室先前從該菌株中克隆獲得了一個GH5家族甘露聚糖酶Man5A，其最適溫度為90 ℃，且在80 ℃條件下穩(wěn)定，同時獲得了一個GH11家族木聚糖酶Tlxyn11B，最適溫度為65 ℃，比活高達(dá)8 300.0 U/mg，但其熱穩(wěn)定性較差。本研究將木聚糖酶基因Tlxyn11B成熟蛋白編碼區(qū)序列與去除CBM區(qū)的甘露糖酶基因man5A通過甘露糖酶連接區(qū)相融合，并在畢赤酵母當(dāng)中進(jìn)行表達(dá)和性質(zhì)測定，最終融合酶同時具有較高的甘露聚糖酶和木聚糖酶活性，木聚糖酶的熱穩(wěn)定性得到了明顯的提升。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和載體

帶有木聚糖酶基因的質(zhì)粒pPIC9-Tlxyn11B和帶有甘露聚糖酶基因的質(zhì)粒pPIC9-man5A均由本實驗室保存[27-28]。質(zhì)粒 pEASY-T3和宿主菌大腸桿菌Escherichia coliTrans1-T1購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，用于目的基因的克隆。質(zhì)粒pPIC9和表達(dá)宿主畢赤酵母Pichia pastorisGS115購自Invitrogen，用于表達(dá)載體的構(gòu)建和外源基因的表達(dá)。

1.1.2 試劑和試劑盒

限制性內(nèi)切酶購自TaKaRa有限公司；重組酶和DNA純化試劑盒購自南京諾唯贊生物公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA公司；底物角豆膠和櫸木木聚糖購自Sigma-Aldrich；蛋白Marker購自Genestar 生物公司；DNA高保真聚合酶FastPfuDNA Polymerase購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

實驗中所用的培養(yǎng)基有LB (Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基、YPD (Yeast extract peptone dextrose medium) 液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基、MD (Minimal dextrose) 固體培養(yǎng)基、BMGY(Buffered glycerol-complex medium) 培養(yǎng)基、BMMY (Buffered methanol-complex medium) 培養(yǎng)基。其詳細(xì)制備方法可參照文獻(xiàn)[19]。

1.2 甘露聚糖酶和木聚糖酶融合基因的獲得

以帶有木聚糖酶TlXYN11B編碼基因Tlxyn11B的質(zhì)粒pPIC9-Tlxyn11B為模板，以xyn11-F1和xyn11-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得木聚糖酶成熟區(qū)編碼基因Tlxyn11B；以質(zhì)粒pPIC9-man5A為模板，以man-F1和man-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得去除了CBM區(qū)的甘露聚糖酶基因man5A。PCR反應(yīng)程序為：95 ℃保溫5 min；95 ℃保溫30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃保溫10 min。引物序列見表1，下劃線部分代表限制性酶切位點EcoRⅠ和NotⅠ，其中man-F1和xyn11-R1含有15 bp的同源序列以便于后續(xù)通過重疊延伸PCR進(jìn)行木聚糖酶與甘露聚糖酶基因的融合。

表1 構(gòu)建木聚糖酶-甘露聚糖酶融合基因的引物序列Table 1 Primer sequences for constructing xylanase-mannanase fusion gene

上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳并分別回收目標(biāo)條帶，以回收條帶混合物為模板，以xyn11-F1和man-R1為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件同上。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接pEASY-T3熱激轉(zhuǎn)化到Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，并涂布氨芐青霉素抗性的LB固體培養(yǎng)基平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后進(jìn)行菌落PCR驗證，并挑選陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序驗證。The underline represents the restriction enzyme cleavage site.

1.3 融合表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-Tlxyn11B-man5A的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化與陽性克隆篩選

測序正確的克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切后回收基因片段，連入同樣經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ處理的pPIC9載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)，挑選陽性克隆并測序驗證。獲得重組載體pPIC9-Tlxyn11B-man5A用于畢赤酵母的轉(zhuǎn)化。

重組載體pPIC9-Tlxyn11B-man5A用限制性內(nèi)切酶BglⅡ線性化處理，經(jīng)凝膠電泳純化后回收線性化產(chǎn)物，利用電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，用1 mol/L 的山梨醇重懸，30 ℃靜置孵育1 h使細(xì)胞復(fù)蘇，然后涂布于組氨酸缺陷型MD平板，30 ℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)2–3 d至長出肉眼可見的單菌落，隨機用牙簽挑選48個克隆子后點種到標(biāo)有數(shù)字1–100的MD和MM平板上30 ℃恒溫箱內(nèi)倒置培養(yǎng)1–2 d，用牙簽挑取克隆接種于有相應(yīng)標(biāo)號的含有3 mL BMGY培養(yǎng)基的15 mL酵母管中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h后離心去除上清液，菌體用1 mL BMMY培養(yǎng)基重懸，誘導(dǎo)培養(yǎng)48 h后離心收集上清液進(jìn)行酶活測定，篩選出高活性的轉(zhuǎn)化子。

1.4 重組酶的獲得和純化

篩選獲得的活性高的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)。將陽性轉(zhuǎn)化子在YPD培養(yǎng)基活化后按1%接種量接種于300 mL BMGY液體培養(yǎng)基中，30 ℃、220 r/min培養(yǎng)48 h，4 500 r/min離心5 min棄上清，菌體重懸于150 mL含有0.5%甲醇的BMMY液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，期間每隔12 h補加0.5%的甲醇。培養(yǎng)結(jié)束后離心收集上清液，經(jīng)截留分子量10 kDa的膜包濃縮，用10 mmol/L的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液 (pH 6.5) 進(jìn)行過夜透析以去除多余的鹽分。透析處理后的酶液加載到經(jīng)過平衡的HiTrap QXL陰離子交換層析柱中，并用10 mmol/L的pH 6.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液的配制的1 mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，收集相應(yīng)的峰所對應(yīng)的蛋白并進(jìn)行酶活性的測定和SDS-PAGE分析。

1.5 酶活力的測定

木聚糖酶及甘露聚糖酶的酶活性測定均采用3,5-二硝基水楊酸 (DNS) 法，具體參照Miller等[29]的方法并有所改進(jìn)。具體反應(yīng)體系為：100 μL適當(dāng)稀釋的酶液，900 μL質(zhì)量體積比為1%的櫸木木聚糖 (用于木聚糖酶酶活的測定) 或0.5%角豆膠 (用于甘露聚糖酶酶活的測定) 的檸檬酸-磷酸氫二鈉溶液，恒溫反應(yīng)10 min后加入1.5 mL DNS終止反應(yīng)，沸水浴中煮沸5 min后立即置于冷水中冷卻，取250 μL反應(yīng)終止液于540 nm下測定吸光值，并根據(jù)相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出酶活力。木聚糖酶活力在pH 4.0、70 ℃條件下測定，甘露聚糖酶活力在pH 5.0、90 ℃條件下測定。酶活定義為：在上述條件下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol還原糖所需的酶量為1個單位 (U)。

1.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

最適溫度及熱穩(wěn)定性的測定：將純化后的融合酶進(jìn)行適當(dāng)稀釋，在30 ℃–95 ℃溫度條件下及pH 4.0或pH 5.0的條件下分別測定木聚糖酶和甘露聚糖酶的酶活，以確定融合酶中木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適溫度。將稀釋酶液 (100 ng/μL)分別在60 ℃、70 ℃、80 ℃ 三個不同溫度下處理2、5、8、10、20、30、60 min后立即置于冰上，之后稀釋合適的倍數(shù)并在最適條件下測定處理過的酶液的剩余酶活。以未經(jīng)處理的酶的酶活力為100%，分別計算不同溫度條件、處理不同時間后樣品的剩余酶活以測定酶在不同溫度下的穩(wěn)定性。

最適pH及pH穩(wěn)定性的測定：分別在甘露聚糖酶和木聚糖酶的最適溫度條件下測定不同pH(1.0–12.0)條件下的酶活力來確定最適pH；將酶用不同pH的緩沖液進(jìn)行稀釋，37 ℃恒溫孵育1 h，在最適條件下測定剩余酶活力，并以未處理酶液的酶活力為100%，計算不同pH處理下的相對剩余酶活以測定酶在不同pH下的穩(wěn)定性。

動力學(xué)常數(shù)的測定：分別以濃度范圍為0.1–10.0 mg/mL的櫸木木聚糖和0.5–5.0 mg/mL的角豆膠為底物，在pH 4.0、70 ℃條件下測定木聚糖酶活性，在pH 5.0、90 ℃條件下測定甘露聚糖酶活性，反應(yīng)時間均為5 min，利用雙倒數(shù)法作圖并計算得到Km及Vmax的值。

金屬離子及化學(xué)試劑對酶活性的影響測定：將5 mmol/L的不同的金屬離子和化學(xué)試劑添加到酶促反應(yīng)體系中，以不添加任何離子和化學(xué)試劑作為對照，在酶的最適條件下測定它們對酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組載體的構(gòu)建與融合蛋白的表達(dá)與純化

通過PCR將594 bp的木聚糖酶成熟區(qū)編碼基因Tlxyn11B和1 131 bp的甘露聚糖酶基因man5A(不含N端CBM區(qū)) 進(jìn)行拼接，獲得1 725 bp的融合基因Tlxyn11B-linker-man5A，融合基因編碼的蛋白理論分子量為62.6 kDa，理論等電點為4.82。融合基因Tlxyn11B-linker-man5A在畢赤酵母GS115中實現(xiàn)了分泌表達(dá)，獲得融合蛋白Tlxyn11B-Man5A。其表觀分子量約為70 kDa，較理論分子量稍大 (圖1)，該融合酶有2個可能的N糖基化位點，在畢赤酵母中表達(dá)可能發(fā)生了糖基化從而造成表觀分子量大于理論分子量。

圖1 融合蛋白Tlxyn11B-Man5A的SDS-PAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis of fusion protein Tlxyn11B-Man5A.Lane M:the standard modecule weight;lane 1:concentrated Tlxyn11B-Man5A;lane 2:purified Tlxyn11B-Man5A.

2.2 融合酶的酶學(xué)性質(zhì)

2.2.1 融合酶的最適pH及pH穩(wěn)定性

在pH 1.0–8.0 范圍內(nèi)測定甘露聚糖酶和木聚糖酶的最適pH，結(jié)果顯示融合酶的木聚糖酶的最適pH (圖2A) 為4.0，在pH 3.0–5.0范圍內(nèi)能夠維持60%以上的酶活力。融合酶中的甘露聚糖酶的最適pH (圖2B) 為5.0，在pH 3.0–5.5范圍內(nèi)甘露聚糖酶的相對酶活力維持在50%以上。在pH 1.0–12.0范圍內(nèi)測定融合酶的pH穩(wěn)定性，結(jié)果顯示木聚糖酶在pH 2.0–9.0時穩(wěn)定，pH 2.0時剩余酶活仍達(dá)90% (圖2C)。甘露聚糖酶 (圖2D)在pH 2.0–9.0范圍內(nèi)，剩余酶活力能夠維持在60%以上 (圖中Tlxyn11B-W和TlxyB分別代表融合前后的木聚糖醇，Man5A-W和Man5A分別代表融合前后的甘露聚糖醇)。

圖2 融合前后木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適pH及pH穩(wěn)定性Fig.2 Optimum pH and pH stability of xylanase and mannanase before and after fusion.(A) Effect of pH on the activities of xylanase Tlxyn11B-W and Tlxyn11B.(B) Effect of pH on the activities of mannanase Man5A-W and Man5A.(C) pH stabilities of xylanase Tlxyn11B-W and Tlxyn11B.(D) pH stabilities of mannanase Man5A-W and Man5A.

2.2.2 融合酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

分別在pH 4.0和pH 5.0條件下測定融合酶的木聚糖酶和甘露聚糖酶在不同溫度 (30–95 ℃)的酶活力，結(jié)果顯示 (圖3A–B) 融合酶中木聚糖酶和甘露聚糖酶分別在70 ℃和90 ℃時具有最高酶活力。甘露聚糖酶在80–95 ℃范圍內(nèi)維持在50%以上酶活力。木聚糖酶在低于70 ℃時酶活隨溫度升高而升高，70 ℃以上酶活急劇下降。在最適pH 4.0的條件下將酶液分別在60 ℃、70 ℃條件下處理不同時間測定木聚糖酶的熱穩(wěn)定性，結(jié)果顯示 (圖3C)，60 ℃處理1 h還剩余48%的酶活力，70 ℃處理2 min還剩60%的酶活力，70 ℃處理5 min還剩23%的酶活力。在最適pH 5.0的條件下將酶液分別在70 ℃、80 ℃條件下處理不同的時間測定甘露聚糖酶的溫度穩(wěn)定性，結(jié)果表明 (圖3D)，70 ℃處理2 min還剩余77.5%的酶活，80 ℃處理2 min還剩余71.26%的酶活。

圖3 融合前后木聚糖酶和甘露聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性Fig.3 Optimum temperature and thermostability of xylanase and mannanase before and after fusion.(A) Effect of temperature on the activities of xylanase Tlxyn11B-W and Tlxyn11B.(B) Effect of temperature on the activities of mannanase Man5A-W and Man5A.(C)Thermostability of xylanase Tlxyn11B-W and Tlxyn11B.(D) Thermostability of mannanase Man5A-W and Man5A.

2.2.3 融合酶的動力學(xué)參數(shù)測定

分別在甘露聚糖酶和木聚糖酶的最適條件下以角豆膠和櫸木木聚糖為底物進(jìn)行測定，經(jīng)Michaelis-Menten 模型計算出融合酶中甘露聚糖酶和木聚糖酶的動力學(xué)參數(shù) (表2)，最終得到融合酶的甘露聚糖酶的Km和Vmax分別為1.7 mg/mL、2 831.6 μmol/(min·mg)，木聚糖酶的Km和Vmax分別為1.2 mg/mL、2 000.0 μmol/ (min·mg)。

表2 木聚糖酶和甘露聚糖酶融合前后的動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic parameters before and after fusion of xylanase and mannanase

2.2.4 金屬離子及化學(xué)試劑對酶活性的影響

如表3所示，融合前后金屬離子和化學(xué)試劑對酶的活性的影響基本無變化，對于甘露聚糖酶Cr3+、Cu2+、Fe3+、SDS能夠抑制酶活，而其他離子和化學(xué)試劑對酶活幾乎沒影響。對于木聚糖酶Pb2+、Cu2+、Fe3+、SDS能夠抑制酶活，其余離子和化學(xué)試劑對其無明顯影響。

表3 不同金屬離子和化學(xué)試劑對融合前后甘露聚糖酶和木聚糖酶活性的影響Table 3 Effects of different metal ions and chemical reagents on mannanase and xylanase activities before and after fusion

3 討論

研究通過甘露聚糖酶自身的連接區(qū)將木聚糖酶和甘露聚糖酶相連，從而實現(xiàn)了融合表達(dá)，獲得了具有高活性的木聚糖酶和甘露聚糖酶的雙功能融合蛋白，為半纖維素的降解及飼料和食品中的應(yīng)用提供了便利?；诘鞍踪|(zhì)融合來獲得多功能酶的研究不乏報道[30-31]，但融合設(shè)計并非都能成功，如涉及纖維素酶-木聚糖酶的研究中，與淀粉酶C末端融合的葡聚糖酶失去活性[32]。融合酶的種類、來源、結(jié)構(gòu)、融合順序、連接肽的長短和種類對融合酶的性質(zhì)都可能有重要的影響[24,32-33]。多數(shù)糖苷水解酶從結(jié)構(gòu)上來看其N端和C端相距較近并發(fā)生相互作用，任意一端的變動都可能影響酶的整體結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響酶學(xué)性質(zhì)。本研究中甘露聚糖酶Man5A的CBM區(qū)屬于CBM1家族，主要是由β折疊片構(gòu)成的三明治結(jié)構(gòu)，而木聚糖酶Tlxyn11B從三維結(jié)構(gòu)上來看同樣主要是由β折疊片構(gòu)成，在結(jié)構(gòu)上與CBM1有一定的相似度，從而保證了酶結(jié)構(gòu)功能的正常，該項工作為融合酶的選擇提供了一定的指導(dǎo)。

甘露聚糖酶Man5A有非常好的熱穩(wěn)定性[27]，而木聚糖酶Tlxyn11B熱穩(wěn)定性相對較差。當(dāng)將Man5A的CBM替換為木聚糖酶Tlxyn11B進(jìn)行融合時，使木聚糖酶的熱穩(wěn)定性明顯提高[28]，而甘露聚糖酶熱穩(wěn)定性有所降低，但優(yōu)于去掉CBM的Man5A (Man5AΔCBM) 熱穩(wěn)定性[27]。Wang等報道Man5A在80 ℃ 處理60 min后，仍然保留50%的酶活力，而Man5A-CBM在80 ℃ 處理30 min后完全失活。Tlxyn11B-Man5A的穩(wěn)定性處于Man5A和Man5A-CBM之間，可見CBM在甘露聚糖酶Man5A熱穩(wěn)定性的維持中發(fā)揮重要的作用，且與CBM的結(jié)構(gòu)相關(guān)。木聚糖酶Tlxyn11B熱穩(wěn)提高的機制尚不明確，推測與連接區(qū)對木聚糖酶的保護(hù)相關(guān)。同時，我們發(fā)現(xiàn)木聚糖酶Tlxyn11B作用的pH范圍在融合表達(dá)后也得到了拓寬。而融合前后木聚糖酶和甘露聚糖酶對不同金屬離子和化學(xué)試劑的抗性沒有明顯區(qū)別，Cu2+、Fe3+、SDS能夠同時抑制兩種酶的活性，此外Cr3+對甘露聚糖酶，Pb2+對木聚糖酶也有部分抑制作用，說明融合表達(dá)并不影響兩種酶對金屬離子和化學(xué)試劑的抗性。動力學(xué)參數(shù)方面，融合后甘露聚糖酶和木聚糖酶的Km值均降低，說明融合后有利于酶與底物的結(jié)合，從融合后Kcat/Km值均增加來看，融合后兩種酶的催化效率也都有提高。這類通過蛋白質(zhì)融合改變酶的活力和熱穩(wěn)定性的研究，目前大多認(rèn)為是連接肽的種類和長短影響了融合后蛋白單個結(jié)構(gòu)域及各結(jié)構(gòu)域間相互作用[23,34]。

綜上，通過不同活性酶編碼基因的融合表達(dá)，我們獲得了一個同時具有高的甘露聚糖酶和木聚糖酶的雙功能蛋白，并提高了木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。這為后續(xù)的應(yīng)用提供了便利、節(jié)約了成本，也為酶性能的改良提供了思路。