蝦虹彩病毒TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

韋信賢 陳孝宇 賈鵬 王瑞 譚紅連 楊慧贊 童桂香 黃光華

摘要：【目的】建立檢測(cè)蝦虹彩病毒（SIV）的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR，為實(shí)現(xiàn)蝦虹彩病毒?。⊿IVD）快速診斷及疫情監(jiān)測(cè)提供一種新的技術(shù)手段?！痉椒ā扛鶕?jù)SIV的MCP基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物和TaqMan-MGB探針，將目的片段克隆至pMD18-T載體制備重組質(zhì)粒pMD18-T-MCPSIV;優(yōu)化反應(yīng)體系及擴(kuò)增條件后建立檢測(cè)SIV的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR，以pMD18-T-MCPSIV為標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并通過(guò)特異性、敏感性、重復(fù)性試驗(yàn)及臨床應(yīng)用驗(yàn)證其實(shí)用性?！窘Y(jié)果】制備的重組質(zhì)粒（pMD18-T-MCPSIV）DNA穩(wěn)定性好，滿(mǎn)足作為標(biāo)準(zhǔn)品的要求;標(biāo)準(zhǔn)品起始模板范圍為2.0×101～2.0×109拷貝/反應(yīng)時(shí)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好線性關(guān)系。優(yōu)化后的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR靈敏度高，對(duì)重組質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度可達(dá)20拷貝/反應(yīng)，對(duì)蝦組織SIV的檢測(cè)靈敏度約10拷貝/mg，其臨床檢測(cè)的敏感性與套式PCR相當(dāng);與蝦類(lèi)其他常見(jiàn)病原無(wú)交叉反應(yīng)，組內(nèi)和組間變異系數(shù)分別為0.27%～0.54%和0.61%～0.95%，且擴(kuò)增與產(chǎn)物分析同步完成，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需1 h左右。采用建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的套式PCR同時(shí)對(duì)276份臨床蝦樣品進(jìn)行SIV檢測(cè)，結(jié)果顯示，兩種方法的大部分檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為98.6%，但檢測(cè)低拷貝數(shù)樣品時(shí)前者具有更高的靈敏度。2018和2019年廣西蝦樣品的SIV陽(yáng)性檢出率分別為19.7%和7.5%，且養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦和紅螯螯蝦均檢測(cè)到SIV陽(yáng)性?！窘Y(jié)論】基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量范圍寬及簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于蝦類(lèi)樣品SIV檢測(cè)，可為SIVD快速診斷及疫情監(jiān)測(cè)提供一種新的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞： 蝦虹彩病毒（SIV）;MCP基因;TaqMan-MGB探針;熒光定量PCR;套式PCR

中圖分類(lèi)號(hào)： S945.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）02-0404-08

Development of TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR for detection of shrimp iridescent virus

WEI Xin-xian1， CHEN Xiao-yu2， JIA Peng3， WANG Rui1， TAN Hong-lian1，

YANG Hui-zan1， TONG Gui-xiang1*， HUANG Guang-hua1*

（1Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning? 530021， China; 2Technology Center of Wuhan Customs， Wuhan 430050， China; 3Shenzhen Customs/State Key Quarantine Laboratory of Aquatic Animal Diseases， Shenzhen， Guangdong? 518045， China）

Abstract：【Objective】The TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR detection method for shrimp iridescent virus（SIV） was developed in order to provide a new detection technology for clinical diagnosis and epidemic monitoring of shrimp iridescent virus disease（SIVD）. 【Method】A pair of specific primers and a fluorogenic-labeled TaqMan-Minor Groove Binder（TaqMan-MGB） probe were designed based on the conserved sequence of MCP gene in SIV， and the target fragments were cloned into the pMD18-T vector to construct pMD18-T-MCPSIV recombinant plasmids. Then the TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR detection method was developed after optimizing reaction system and amplification， the standard curve was established for quantitative analysis with pMD18-T-MCPSIV as standards and the specificity， sensitivity， reproducibility tests and detection of clinical samples were carried out to evaluate the applicability of this method. 【Result】The prepared recombinant plasmid DNA of pMD18-T-MCPSIV had good stability and could meet the requirements of the standards， and the standard curve showed a good linear relationship with quantitative range from 2.0×101 to 2.0×109 copies/reaction. The optimized TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR method had a high sensitivity with the detection limit as low as to 20 copies/reaction for the pMD18-T-MCPSIV and approximately 10 copies/mg for the shrimp tissue samples， and its clinical detection sensitivity was comparable to nested PCR. It had no cross reaction with common shrimp pathogens， the variation coefficients of intra-group and inter-group were 0.27%-0.54% and 0.61%-0.95%， amplification could be completed together with products analysis and the entire detection could be completed within 1 h for a single sample. The TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR and nested PCR method recommended by Ministry of Agriculture and Rural Affairs were adopted to detect 276 clinical samples， the results showed that most of the results were the same with coincidence rate of 98.6%. But TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR had better sensitivity in detecting samples with low copies SIV. The SIV positive rates of Guangxi were 19.7% in 2018 and 7.5% in 2019， respectively. SIV positive samples were detected in aquaculture Litopenaeus vannamei， Macrobrachium rosenbergii and Cherax quadricarinatus. 【Conclusion】The TaqMan-MGB probe fluorescence quantitative PCR assay based on MCP gene conservative sequence in SIV developed in the study is fast， sensitive， specific， reproducible and of wide quantitative range， making it an ideal method for detecting SIV in shrimp clinical samples and a new technique for the diagnosis and monitoring of SIVD.

Key words： shrimp iridescent virus（SIV）; MCP gene; TaqMan-MGB probe; fluorescence quantitative PCR; nes-ted PCR

Foundation item：Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204081-4）; Guangxi Key Research and Development Project（Guike AB16380035）; Independent Project of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture（19-A-03-03）; Scientific Research Project of Wuhan Customs（2019WK003）

0 引言

【研究意義】蝦血細(xì)胞虹彩病毒（Shrimp hemocyte iridescent virus，SHIV）是近年發(fā)現(xiàn)的一種新型虹彩病毒，與紅螯螯蝦虹彩病毒（Cheraxquadricarinatus iridovirus，CQIV）的基因組序列相似性達(dá)99%，但現(xiàn)有的檢測(cè)方法尚無(wú)法將二者區(qū)分，故統(tǒng)稱(chēng)為蝦虹彩病毒（Shrimp iridescent virus，SIV）（Xu et al.，2016;Li et al.，2017;Qiu et al.，2017，2018b）。SIV可感染凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦、紅螯螯蝦和中國(guó)對(duì)蝦等多種經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖蝦類(lèi)并引起大規(guī)模死亡，還能感染浮游生物、河蝦、鯽、螺螄及河蟹等常見(jiàn)水生生物成為傳染源傳播病毒（Xu et al.，2016;王甘翔等，2018;Qiu et al.，2019）。近年來(lái)，從我國(guó)沿海多個(gè)?。ㄊ校┑奈r類(lèi)監(jiān)測(cè)樣品中檢測(cè)出SIV，檢出品種包括凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦、中國(guó)對(duì)蝦、紅螯螯蝦和克氏原螯蝦等主要養(yǎng)殖蝦類(lèi)品種，表明SIV已成為我國(guó)蝦類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)面臨的新威脅（李清和陳家永，2017）。目前針對(duì)病毒病尚無(wú)有效的治療方法，主要采取避免接觸感染的預(yù)防措施，而這又依賴(lài)于病毒傳染源的快速檢測(cè)。因此，建立一種快速、準(zhǔn)確的SIV檢測(cè)方法，可為親蝦篩選、蝦苗檢疫及疫情監(jiān)測(cè)等提供重要技術(shù)手段，對(duì)有效防控SIV感染引起的蝦類(lèi)病害具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】隨著SIV基因組序列測(cè)定的完成與發(fā)布及SIV檢測(cè)的需求（Li et al.，2017），SIV快速檢測(cè)技術(shù)如套式PCR、TaqMan探針定量PCR和LAMP等相繼問(wèn)世（Qiu et al.，2017，2018a;鄭曉葉等，2018）。在實(shí)際檢測(cè)工作中，套式PCR雖敏感性高，但需兩輪PCR及電泳，操作繁瑣，檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)且多次開(kāi)蓋極易交叉污染;TaqMan探針定量PCR由于探針長(zhǎng)度太長(zhǎng)，敏感性不夠理想;LAMP具有靈敏、快速的特點(diǎn)，但在實(shí)驗(yàn)室條件下易出現(xiàn)假陽(yáng)性。TaqMan-MGB探針是在TaqMan探針3'端連上不發(fā)光的淬滅基團(tuán)MGB（Minor groove binder）結(jié)合物，與TaqMan探針相比具有探針長(zhǎng)度短、穩(wěn)定性好及分辨率高等特點(diǎn)（Letertre et al.，2003;施開(kāi)創(chuàng)等，2018;童桂香等，2019），憑借其技術(shù)優(yōu)勢(shì)在各種病原體檢測(cè)中已得到廣泛應(yīng)用。劉俊等（2009）建立的一步TaqMan-MGB熒光定量PCR能有效鑒別豬瘟野毒株和HCLV疫苗株，且特異性好、靈敏度高;劉毅等（2014）基于犬細(xì)小病毒（CPV）VP2基因的保守區(qū)域建立了快速檢測(cè)CPV的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)方法;聶福平等（2017）建立了可鑒別牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒（LSDV）的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)方法;施開(kāi)創(chuàng)等（2018）建立針對(duì)黏菌素耐藥基因mcr-1的TaqMan-MGB熒光定量PCR檢測(cè)方法，為臨床監(jiān)控mcr-1基因攜帶細(xì)菌提供了技術(shù)支持;孫菲等（2018）建立了快速檢測(cè)耐藥結(jié)核分枝桿菌的多重TaqMan-MGB探針檢測(cè)體系，可同時(shí)檢測(cè)6個(gè)結(jié)核突變位點(diǎn)。在水生生物病毒檢測(cè)方面，馬冬梅等（2011）建立了檢測(cè)大口黑鱸潰瘍綜合征病毒（LBUSV）的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR;韋信賢等（2011a）建立了檢測(cè)對(duì)蝦桃拉綜合征病毒（TSV）的TaqMan-MGB探針熒光定量RT-PCR;童桂香等（2019）建立了檢測(cè)致對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（VpAHPND）的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】鑒于現(xiàn)有SIV檢測(cè)方法的不足及TaqMan-MGB探針應(yīng)用于熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)，將TaqMan-MGB探針應(yīng)用于SIV檢測(cè)有助于實(shí)現(xiàn)蝦虹彩病毒?。⊿IVD）的快速診斷及有效防控，但至今未見(jiàn)采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)SIV的相關(guān)報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】建立并優(yōu)化針對(duì)SIV的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)方法，提高SIV的檢測(cè)效率和敏感性，為實(shí)現(xiàn)SIVD快速診斷及疫情監(jiān)測(cè)提供一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

SIV、白斑綜合征病毒（WSSV）、傳染性皮下和造血器官壞死病毒（IHHNV）、蝦肝腸胞蟲(chóng)（EHP）及VpAHPND等陽(yáng)性材料均由廣西水產(chǎn)遺傳育種與健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定并保存（童桂香等，2013，2014，2019）;健康無(wú)SIV感染凡納濱對(duì)蝦采自國(guó)家級(jí)廣西SPF凡納濱對(duì)蝦良種場(chǎng);276份蝦樣品主要采自廣西欽州、北海、防城港、南寧和來(lái)賓等地的養(yǎng)殖場(chǎng)，品種有凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦、紅螯螯蝦和克氏原螯蝦，其中2018年收集142份樣品、2019年收集134份樣品。

動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒、2×F8 FastLong PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker、氨芐青霉素、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、瓊脂糖凝膠回收試劑盒及質(zhì)粒小量提取試劑盒購(gòu)自北京艾德萊生物技術(shù)有限公司;pMD18-T載體克隆試劑盒和Probe qPCR Mix購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司;瓊脂糖購(gòu)自英韋創(chuàng)津生物科技有限公司;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。熒光定量PCR儀（Mx3005P）購(gòu)自安捷倫科技有限公司。

1. 2 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立

1. 2. 1 引物與TaqMan-MGB探針設(shè)計(jì)及合成 SIV主衣殼蛋白（Major capsid protein，MCP）基因中含有許多高度保守的結(jié)構(gòu)域（Tidona et al.，1998），故本研究以SIV的MCP基因?yàn)闄z測(cè)靶基因。采用Primer Express v3.0按熒光定量PCR引物和TaqMan-MGB探針的設(shè)計(jì)原則，在MCP基因（KY681039）保守區(qū)域設(shè)計(jì)多組特異性的擴(kuò)增引物和TaqMan-MGB探針，其中，TaqMan-MGB探針5'端標(biāo)記熒光染料FAM、3'端標(biāo)記MGB基團(tuán)，并通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)分析后，委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。經(jīng)試驗(yàn)初篩，選擇一套效果較好的引物及TaqMan-MGB探針（表1）用于SIV熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立。

1. 2. 2 病原DNA提取及重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備 取50 mg陽(yáng)性病料組織，按照動(dòng)物組織基因組DNA快速提取試劑盒說(shuō)明提取蝦類(lèi)常見(jiàn)病原SIV、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的DNA，然后加入50 μL洗脫緩沖液（EB）溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆?。參照韋信賢等（2011b）的研究方法制備重組質(zhì)粒（pMD18-T-MCPSIV）標(biāo)準(zhǔn)品，提取重組質(zhì)粒DNA，采用核酸蛋白分析儀測(cè)定其濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù);將重組質(zhì)粒DNA以10倍梯度稀釋至1.0×100 ～1.0×109拷貝/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 2. 3 熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化 選用3個(gè)梯度（1.0×109、1.0×105、1.0×101拷貝/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，按試劑說(shuō)明在56～64 ℃范圍內(nèi)，采用1 ℃的溫度梯度進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以獲得較低閾值循環(huán)數(shù)（Ct）和較高相對(duì)熒光強(qiáng)度增加值（ΔRn）時(shí)的溫度為最佳退火溫度。同時(shí)，以3個(gè)梯度（1.0×109、1.0×105、1.0×101拷貝/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，采用不同的引物終濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7和0.8 μmol/L）與TaqMan-MGB探針終濃度（0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 μmol/L）組合進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，以獲得較低Ct和較高ΔRn時(shí)的濃度組合為最佳引物和探針濃度組合。

1. 2. 4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立及敏感性試驗(yàn) 以10個(gè)梯度（1.0×109 ～1.0×100拷貝/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，采用優(yōu)化后的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增;利用儀器自帶的數(shù)據(jù)分析軟件進(jìn)行分析，建立起始模板拷貝數(shù)（x）對(duì)數(shù)與Ct（y）間的標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性回歸方程，并根據(jù)各標(biāo)準(zhǔn)品DNA擴(kuò)增結(jié)果判斷該方法的定量范圍和敏感性。

1. 2. 5 特異性試驗(yàn) 分別以SIV、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND的DNA為模板，采用優(yōu)化后的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)，評(píng)價(jià)其特異性。

1. 2. 6 重復(fù)性試驗(yàn) 選取3個(gè)梯度（1.0×107、1.0×106、1.0×105拷貝/μL）的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板，在間隔第7和第14 d分別進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)，每個(gè)梯度設(shè)3個(gè)平行，記錄各次試驗(yàn)的Ct，并統(tǒng)計(jì)分析組內(nèi)和組間的變異系數(shù)，以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的穩(wěn)定性及該方法的重復(fù)性。變異系數(shù)（CV）=標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD）/平均數(shù)（MN）。

1. 3 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與套式PCR的敏感性比較

按1.2.2提取SIV陽(yáng)性病料組織的DNA，以10倍梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)?00～10-5），取2 μL各梯度DNA為模板，進(jìn)行TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR擴(kuò)增（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部SIV監(jiān)測(cè)計(jì)劃推薦方法），比較二者的敏感性。

1. 4 臨床樣品檢測(cè)試驗(yàn)

按1.2.2提取臨床樣品總DNA，分別采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR對(duì)276份臨床樣品（凡納濱對(duì)蝦、紅螯螯蝦、羅氏沼蝦和克氏原螯蝦）進(jìn)行SIV檢測(cè)，比較檢測(cè)結(jié)果以檢驗(yàn)TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的臨床實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

采用PCR擴(kuò)增SIV的MCP基因，獲得的目的條帶大小與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。回收純化目的片段后克隆至pMD18-T載體，即獲得重組質(zhì)粒pMD18-T-MCPSIV。以重組質(zhì)粒pMD18-T-MCPSIV轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后進(jìn)行PCR鑒定及測(cè)序分析，確定所得的目的基因序列與GenBank已公布MCP基因部分序列的同源性達(dá)100%，說(shuō)明MCP基因片段已正確連接至pMD18-T載體上。取陽(yáng)性克隆菌液提取質(zhì)粒，測(cè)定其濃度并轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，重組質(zhì)粒pMD18-T-MCPSIV濃度為4.62×109拷貝/μL，滿(mǎn)足標(biāo)準(zhǔn)品的要求。

2. 2 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化結(jié)果

經(jīng)比較不同退火溫度及不同引物和TaqMan-MGB探針濃度組合的擴(kuò)增效果，最終確定TaqMan-MGB探針熒光定量PCR反應(yīng)體系20.0 μL：Probe qPCR Mix（2×）10.0 μL，ROX Reference DyeⅡ0.2 μL，上、下游引物SIV-qF1/SIV-qR1（10 μmol/L）各0.8 μL，TaqMan-MGB探針（5 μmol/L）1.6 μL，DNA模板2.0 μL，以滅菌ddH2O補(bǔ)足至20.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性30 s;95℃ 5 s，58 ℃ 45 s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán);在58 ℃結(jié)束時(shí)收集熒光信號(hào)。

2. 3 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線及其敏感性

以10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品DNA為模板進(jìn)行TaqMan-MGB探針熒光定量PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖2）顯示，高濃度標(biāo)準(zhǔn)品（1.0×109～1.0×104拷貝/μL）的擴(kuò)增曲線呈明顯S形，低濃度標(biāo)準(zhǔn)品（1.0×103～1.0×100拷貝/μL）的擴(kuò)增曲線因未達(dá)擴(kuò)增平臺(tái)期呈半S形，各梯度標(biāo)準(zhǔn)品DNA的擴(kuò)增曲線重復(fù)性好、熒光強(qiáng)度增量明顯、間距均勻;標(biāo)準(zhǔn)品DNA濃度為1.0×109～1.0×101拷貝/μL時(shí)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好（圖3），對(duì)應(yīng)的線性回歸方程為y=-3.249*log（x）+38.98，Eff.（擴(kuò)增效率）和RSq（相關(guān)系數(shù)方值）分別為103.1%和1.000?？梢?jiàn)，建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品的擴(kuò)增效率高，起始模板范圍為2.0×101～2.0×109拷貝/反應(yīng)時(shí)，其標(biāo)準(zhǔn)曲線能準(zhǔn)確反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果，可用于定量分析。

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品DNA為20拷貝/反應(yīng)時(shí)，3個(gè)重復(fù)的Ct分別為34.91、35.04和35.04，仍有明顯的擴(kuò)增曲線（圖2），且重復(fù)性好;標(biāo)準(zhǔn)品DNA為2拷貝/反應(yīng)時(shí)，3個(gè)重復(fù)的Ct分別為37.47、38.85和38.98，重復(fù)性較差。因此，確定TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的靈敏度約20拷貝/反應(yīng)。為確保檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，使用該方法檢測(cè)SIV時(shí)建議以35.00為Ct的臨界值，若檢測(cè)樣品的Ct小于或等于35.00，且有擴(kuò)增曲線，則判為SIV陽(yáng)性;Ct大于35.00，且有擴(kuò)增曲線，需重復(fù)1次，如結(jié)果一致則判為SIV陽(yáng)性;Ct大于35.00，重復(fù)結(jié)果未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，則判為SIV陰性。

2. 4 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的特異性

采用建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR對(duì)蝦類(lèi)常見(jiàn)病原（SIV、WSSV、IHHNV、EHP和VpAHPND）的DNA進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示只有SIV出現(xiàn)擴(kuò)增曲線（圖4），Ct分別為15.78、15.82和15.84，判為陽(yáng)性;而其他病原均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，判為陰性。說(shuō)明建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR對(duì)SIV檢測(cè)具有很強(qiáng)的特異性。

2. 5 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的重復(fù)性

1.0×107、1.0×106、1.0×105拷貝/μL 3組標(biāo)準(zhǔn)品的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，其組內(nèi)變異系數(shù)為0.27%～0.54%，組間變異系數(shù)為0.61%～0.95%，表明建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR重復(fù)性和重現(xiàn)性均很好，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠;同時(shí)說(shuō)明本研究制備的重組質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，可作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照使用。

2. 6 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與套式PCR的敏感性比較

采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR分別對(duì)10倍梯度稀釋的SIV陽(yáng)性DNA（100～10-5）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果（圖5和圖6）顯示，兩種方法均可檢測(cè)到10-4稀釋度的陽(yáng)性DNA，即TaqMan-MGB探針熒光定量PCR可達(dá)到套式PCR的敏感度。

2. 7 TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR檢測(cè)臨床樣品的結(jié)果比較

分別采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR和套式PCR對(duì)276份臨床蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3。其中，有34份蝦樣品的兩種檢測(cè)結(jié)果均呈陽(yáng)性，Ct為18.95～34.29，根據(jù)線性回歸方程y=-3.249*log（x）+38.98計(jì)算可知，其SIV拷貝數(shù)在2.76×101～1.46×106 拷貝/反應(yīng)，蝦樣品組織中的SIV含量為1.38×101～7.30×105 拷貝/mg;有3份蝦樣品的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)呈陽(yáng)性而套式PCR檢測(cè)呈陰性，Ct為35.87～36.42，其SIV拷貝數(shù)在9.06×100～6.14×100拷貝/反應(yīng)，蝦樣品組織中的SIV含量為4.53×100～3.10×100 拷貝/mg;有238份蝦樣品的兩種檢測(cè)結(jié)果均為陰性。說(shuō)明在實(shí)際檢測(cè)工作中進(jìn)行40個(gè)循環(huán)時(shí)，采用TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)蝦組織SIV的靈敏度約10拷貝/mg。2018和2019年廣西蝦樣品的SIV陽(yáng)性檢出率分別為19.7%（28/142）和7.5%（10/134），且養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦和紅螯螯蝦均檢測(cè)到SIV陽(yáng)性。

3 討論

SIV感染養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦、紅螯螯蝦等蝦類(lèi)可造成較高的死亡率，給蝦類(lèi)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。SIV具有多種易感宿主，且存在明顯的跨物種傳播趨勢(shì)，給其防控帶來(lái)極大挑戰(zhàn)（陳形，2019）。雖然SIVD至今尚未被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）收錄，但我國(guó)從2017年起已將其納入《國(guó)家水生動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)計(jì)劃》。因此，快速、準(zhǔn)確檢測(cè)SIV感染對(duì)有效防控SIVD流行具有重要意義。目前，OIE和國(guó)內(nèi)均未發(fā)布SIV檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，僅農(nóng)業(yè)農(nóng)村部在SIVD監(jiān)測(cè)計(jì)劃中推薦采用套式PCR進(jìn)行檢測(cè)。在實(shí)際檢測(cè)工作中，套式PCR存在操作繁瑣、檢測(cè)耗時(shí)長(zhǎng)、不可定量等缺點(diǎn)，尤其在PCR分區(qū)條件有限的實(shí)驗(yàn)室極易形成氣溶膠污染環(huán)境而出現(xiàn)假陽(yáng)性。TaqMan-MGB探針熒光定量PCR不僅能發(fā)揮熒光定量PCR的優(yōu)勢(shì)而克服套式PCR的缺點(diǎn)，其探針的MGB基團(tuán)相對(duì)于TaqMan探針還有利于提高方法的靈敏度，非常適用于對(duì)靈敏度要求高的病原體定量檢測(cè)（Afonina et al.，1997）。

本研究根據(jù)SIV MCP基因的保守性及TaqMan-MGB探針的優(yōu)勢(shì)，在MCP基因保守序列設(shè)計(jì)特異性引物及TaqMan-MGB探針，制備重組質(zhì)粒pMD18-T-MCPSIV標(biāo)準(zhǔn)品，并對(duì)引物和探針使用濃度及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，建立了檢測(cè)SIV的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR。結(jié)果表明，制備的重組質(zhì)粒DNA穩(wěn)定性好，滿(mǎn)足作為標(biāo)準(zhǔn)品和陽(yáng)性對(duì)照的要求;起始模板范圍為2.0×101～2.0×109拷貝/反應(yīng)時(shí)，建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有良好的線性關(guān)系，能準(zhǔn)確反映目的產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果;優(yōu)化后的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR靈敏度高，對(duì)重組質(zhì)粒的檢測(cè)靈敏度可達(dá)20拷貝/反應(yīng)，對(duì)蝦組織SIV的檢測(cè)靈敏度約10個(gè)拷貝/mg，其臨床檢測(cè)的敏感性與套式PCR相當(dāng);特異性強(qiáng)，與蝦類(lèi)其他常見(jiàn)病原無(wú)交叉反應(yīng);重復(fù)性好，組內(nèi)和組間變異系數(shù)均小于1.00%;且擴(kuò)增與產(chǎn)物分析同步完成，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程僅需1 h左右?？梢?jiàn)，本研究建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR不僅能滿(mǎn)足臨床上對(duì)SIV檢測(cè)技術(shù)高靈敏度的需求，還具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速及可定量分析等優(yōu)點(diǎn)。

采用建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR與目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的套式PCR同時(shí)對(duì)276份臨床蝦樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，兩種方法的大部分檢測(cè)結(jié)果一致，符合率為98.6%，同為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果的蝦樣品含SIV拷貝數(shù)較高，而檢測(cè)結(jié)果不一致的蝦樣品含SIV拷貝數(shù)均較低（低于10拷貝/mg）;TaqMan-MGB探針熒光定量PCR的陽(yáng)性檢出率較套式PCR稍高，即發(fā)揮出TaqMan-MGB探針提高擴(kuò)增效率及靈敏度的優(yōu)勢(shì)。說(shuō)明采用建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)SIV高拷貝數(shù)樣品時(shí)準(zhǔn)確性高，而檢測(cè)低拷貝數(shù)樣品時(shí)較套式PCR具有更高的靈敏度，可為SIVD臨床診斷及疫情監(jiān)測(cè)提供一種新的技術(shù)手段。此外，從養(yǎng)殖蝦樣品的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，2018和2019年廣西蝦樣品的SIV陽(yáng)性檢出率分別為19.7%和7.5%，且養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦、羅氏沼蝦和紅螯螯蝦均檢測(cè)到SIV陽(yáng)性，與實(shí)際調(diào)研發(fā)現(xiàn)2018—2019年廣西出現(xiàn)多例養(yǎng)殖凡納濱對(duì)蝦和紅螯螯蝦因暴發(fā)SIVD引起大量死亡的情況相符，說(shuō)明SIV已成為危害廣西養(yǎng)殖蝦類(lèi)的主要病原之一，尤其是SIV在蝦體中攜帶和潛伏感染情況應(yīng)引起有關(guān)部門(mén)及相關(guān)從業(yè)者的高度重視。

4 結(jié)論

基于SIV MCP基因保守序列建立的TaqMan-MGB探針熒光定量PCR檢測(cè)方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、定量范圍寬及簡(jiǎn)單快速等優(yōu)點(diǎn)，適用于蝦類(lèi)樣品SIV檢測(cè)，可為SIVD快速診斷及疫情監(jiān)測(cè)提供一種新的技術(shù)手段。

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