廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析

黃小芳 唐章生 劉俊丹 張宏燕 鐘一治 盧智發(fā) 侯樹(shù)鑒 王大鵬 陸專(zhuān)靈

摘要：【目的】了解當(dāng)前廣西克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）群體的遺傳背景，為其人工養(yǎng)殖及種質(zhì)資源保護(hù)提供參考依據(jù)?！痉椒ā窟x取廣西5個(gè)地區(qū)（南寧、大塘、融水、柳州和來(lái)賓）的克氏原螯蝦群體作為研究對(duì)象，利用8對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)各克氏原螯蝦群體基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)，然后通過(guò)PopGene32和NTSYSpc 2.1等在線(xiàn)軟件分析廣西克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性。【結(jié)果】南寧（NN）、大塘（DT）、融水（RS）、柳州（LZ）和來(lái)賓（LB）5個(gè)克氏原螯蝦群體的平均有效等位基因數(shù)（Ne）為2.5142～3.0574，平均期望雜合度（He）為0.5708～0.6489，平均多態(tài)信息含量（PIC）為0.4899～0.5843，存在中度至高度的遺傳多樣性，其中南寧群體和大塘群體的遺傳多樣性略低于融水群體、柳州群體和來(lái)賓群體。5個(gè)克氏原螯蝦群體的平衡偏離指數(shù)（D）均為負(fù)值，且發(fā)生一定程度的Hardy-Weinberg平衡偏離，雜合子缺失現(xiàn)象普遍存在。5個(gè)克氏原螯蝦群體間的基因流（Nm）為2.3898～6.0284，遺傳分化指數(shù)（Fst）為0.0398～0.0947，表明各群體間存在廣泛的基因交流，僅存在低度至中度的遺傳分化;各克氏原螯蝦群體間的遺傳相似系數(shù)和遺傳距離分別為0.6861～0.8583和0.1528～0.3768，其中，遺傳距離趨勢(shì)與Fst趨勢(shì)一致，而遺傳相似系數(shù)與Nm趨勢(shì)一致，均表明柳州群體與來(lái)賓群體具有高度的相似性，遺傳距離較近。UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果也顯示，南寧群體和大塘群體聚類(lèi)為一支，而柳州群體先與來(lái)賓群體聚類(lèi)再與融水群體聚類(lèi)成另一支?！窘Y(jié)論】廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體具有一定的遺傳多樣性，但其雜合子缺失現(xiàn)象普遍存在，應(yīng)通過(guò)適當(dāng)引種及加強(qiáng)不同地區(qū)群體間的遺傳交流，保護(hù)好克氏原螯蝦的優(yōu)良種質(zhì)資源。

關(guān)鍵詞： 克氏原螯蝦;遺傳多樣性;微衛(wèi)星位點(diǎn);雜合子缺失;廣西

中圖分類(lèi)號(hào)： S917.4? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）02-0437-08

Genetic diversity microsatellite analysis of Procambarus clarkii populations in different regions of Guangxi

HUANG Xiao-fang1，2， TANG Zhang-sheng1， LIU Jun-dan2， ZHANG Hong-yan2，

ZHONG Yi-zhi1，3， LU Zhi-fa1， HOU Shu-jian1， WANG Da-peng1*， LU Zhuan-ling1*

（1Guangxi Academy of Fishery Sciences/Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetic Breeding and Healthy Aquaculture， Nanning? 530021， China; 2College of Animal Science and Technology/State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Guangxi University， Nanning? 530004， China; 3Guangxi Nanning Yanleshang Biotechnology Co.， Ltd.， Nanning? 530004， China）

Abstract：【Objective】To understand the genetic background of Procambarus clarkii populations in Guangxi， and provide reference for its artificial culture and germplasm conservation. 【Method】The P. clarkii populations in five regions （Nanning， Datang， Rongshui， Liuzhou and Laibin） of Guangxi were selected as research objects， and the genomic DNA of five populations was detected by PCR using eight pairs of microsatellite primers， then the genetic diversity of P. clarkii populations in Guangxi was analyzed using PopGene32 and NTSYSpc 2.1. 【Result】The results showed that the average effective number of alleles （Ne） in Nanning （NN）， Datang （DT）， Rongshui （RS）， Liuzhou （LZ） and Laibin （LB） was 2.5142-3.0574， and the average expected heterozygosity （He） was 0.5708-0.6489， the average polymorphic information content （PIC） was 0.4899-0.5843， representing a moderate to high genetic diversity. Among them， the genetic diversity of NN and DT populations were slightly lower than those of RS， LZ and LB populations. The equilibrium indexes （D） of five populations were negative， indicating a certain degree of Hardy-Weinberg equilibrium deviation occurred， and he-terozygous deletion was ubiquitous. The gene flow（Nm） among different P. clarkii populations was 2.3898-6.0284， and the genetic differentiation index（Fst） was 0.0398-0.0947， demonstrating that there were extensive gene exchanges and only low or moderate differentiation between different populations. The genetic similarity coefficient and genetic distance between different populations were 0.6861-0.8583 and 0.1528-0.3768， respectively， among them， the trend of genetic distance was consistent with Fst， and the trend of genetic similarity coefficient was consistent with Nm， demonstrating that LZ and LB populations had high similarity and short genetic distance. UPGMA cluster analysis displayed that NN and DT populations belonged to the same branch; LZ and LB populations were grouped into one category and then merged with RS population into the other branch. 【Conclusion】The P. clarkii populations in different regions of Guangxi have a certain high genetic diversity， however， the heterozygous deletion is very common. Therefore， it is necessary to protect the good germplasm resources of P. clarkii by suitable introduction and strengthening the genetic communication between different populations.

Key words： Procambarus clarkia; genetic diversity; microsatellite loci; heterozygote deletion; Guangxi

Foundation item： Guangxi Innovation Driven Development Project（Guike AA17204094-6，Guike AA17204095-4）; Independent Project of Guangxi Key Laboratory of Aquatic Genetics Breeding and Healthy Aquaculture （18-A-04-07）

0 引言

【研究意義】克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱(chēng)淡水小龍蝦，原產(chǎn)于北美洲，因其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、價(jià)格相對(duì)低廉，深受消費(fèi)者喜愛(ài)，并迅速擴(kuò)散至夏威夷、日本、歐洲和尼羅河流域（Yi et al.，2018;徐濱等，2019）?？耸显r于20世紀(jì)30年代末由日本引入我國(guó)南京（張愛(ài)軍和沈繼紅，2005），因其適應(yīng)能力強(qiáng)，在長(zhǎng)江流域一帶大量繁殖，現(xiàn)已廣泛分布于我國(guó)南方地區(qū)的湖泊和溝渠，是一種重要的水產(chǎn)資源（宋光同等，2018）。尤其是戴愛(ài)云（1983）首次提倡利用鰲蝦作為水產(chǎn)資源加以開(kāi)發(fā)以來(lái)，克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)得到快速發(fā)展，目前全國(guó)養(yǎng)殖面積已超過(guò)100萬(wàn)ha，且有進(jìn)一步擴(kuò)大的趨勢(shì)（嚴(yán)維輝等，2019）。隨著克氏原螯蝦養(yǎng)殖地域和規(guī)模的不斷擴(kuò)大，其逆向選擇及種苗自繁自育的養(yǎng)殖模式導(dǎo)致克氏原螯蝦個(gè)頭逐年變小、病害頻發(fā)、種質(zhì)退化嚴(yán)重，因此，迫切需要從基因水平上開(kāi)展不同群體遺傳變異及遺傳關(guān)系研究，為其良品繁育提供種質(zhì)資源，以促進(jìn)克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】微衛(wèi)星（Microsatellite）又稱(chēng)簡(jiǎn)單序列重復(fù)（Simple sequence repeats，SSR），是一類(lèi)在真核生物基因組中高度變異的簡(jiǎn)單重復(fù)DNA序列（Schl?tterer and Tautz，1992），符合孟德?tīng)栠z傳規(guī)律，具有共顯性和多態(tài)性，且穩(wěn)定性較好，是簡(jiǎn)單快速的基因型檢測(cè)對(duì)象（秦海峰等，2014），已廣泛應(yīng)用于生物群體間的遺傳關(guān)系研究（Cruz et al.，2002;孫效文等，2008;熊良偉等，2018）。Belfiore和May（2000）、Zhu和Yue（2008）先后對(duì)克氏原螯蝦基因組文庫(kù)進(jìn)行篩選，分別獲得23和11對(duì)可良好擴(kuò)增微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，均可用于研究克氏原螯蝦的物種入侵路線(xiàn)、遺傳多樣性和種群結(jié)構(gòu)。王長(zhǎng)忠等（2009）利用17對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)長(zhǎng)江下游地區(qū)4個(gè)克氏原螯蝦群體遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明其遺傳多樣性處于中等水平，群體間基因流水平較高、遺傳分化程度較小。曹玲亮等（2010）選用9對(duì)微衛(wèi)星引物構(gòu)建安徽三大水系的克氏原螯蝦種群遺傳格局，發(fā)現(xiàn)安徽地區(qū)的克氏原螯蝦遺傳多樣性水平較高，尤其是雜合度較高，認(rèn)為水系間的交流是種群擴(kuò)散的主要途徑。費(fèi)騰等（2010）通過(guò)5個(gè)高多態(tài)性的微衛(wèi)星分子標(biāo)記研究封閉式小水體養(yǎng)殖對(duì)克氏原螯蝦的影響，證實(shí)3～5年的封閉性養(yǎng)殖還不足以顯著改變其遺傳多樣性。彭剛等（2010）基于7對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)比分析3個(gè)克氏原螯蝦野生群體和養(yǎng)殖群體間的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)野生群體相對(duì)于養(yǎng)殖群體具有較高的遺傳多樣性。Li等（2012）通過(guò)線(xiàn)粒體基因序列和12對(duì)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)克氏原螯蝦進(jìn)入我國(guó)的起始地點(diǎn)、傳播方式、遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果證實(shí)南京是克氏原螯蝦最初在我國(guó)傳播的起始地點(diǎn)，且與日本來(lái)源的克氏原螯蝦含有相似遺傳成分，但至今并未經(jīng)歷明顯的種群擴(kuò)張。邢智珺等（2014）使用8個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記分析江蘇省8個(gè)主要產(chǎn)區(qū)克氏原螯蝦野生群體的遺傳多樣性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)江蘇主要產(chǎn)區(qū)克氏原螯蝦野生群體的遺傳多樣性較高，且存在群體間中度分化現(xiàn)象。李喜蓮等（2016）基于微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)桐廬、太湖、湖北、江西、洪澤湖、崇明、廣西和海鹽等8個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，結(jié)果表明8個(gè)群體的平均觀測(cè)雜合度（Ho）為0.5257～0.7400，平均期望雜合度（He）為0.6238～0.7434，其中以廣西群體的遺傳多樣性最高?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，國(guó)內(nèi)已有較多關(guān)于克氏原螯蝦遺傳多樣性分析的報(bào)道，但只有李喜蓮等（2016）的研究涉及到廣西群體，即廣西地區(qū)的克氏原螯蝦遺傳多樣性尚未得到系統(tǒng)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】選取8個(gè)微衛(wèi)星分子標(biāo)記對(duì)廣西不同地區(qū)的克氏原螯蝦群體進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在了解當(dāng)前廣西克氏原螯蝦群體的遺傳背景，為其人工養(yǎng)殖及種質(zhì)資源保護(hù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

收集廣西5個(gè)地區(qū)的克氏原螯蝦群體樣本，每個(gè)地區(qū)20～30尾，分別取自南寧（NN）、大塘（DT）、融水（RS）、柳州（LZ）和來(lái)賓（LB）的小龍蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，其蝦苗均未經(jīng)過(guò)人工選育。不同地區(qū)的克氏原螯蝦蝦苗來(lái)源、采集時(shí)間和數(shù)量信息詳見(jiàn)表1。

1. 2 微衛(wèi)星引物篩選與合成

從Belfiore和May（2000）已發(fā)表的克氏原螯蝦微衛(wèi)星位點(diǎn)中挑選出8對(duì)微衛(wèi)星引物用于克氏原螯蝦群體遺傳多樣性分析，并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。微衛(wèi)星引物信息見(jiàn)表2。

1. 3 基因組DNA抽提

根據(jù)天根生化科技（北京）有限公司的DNA抽提試劑盒（#DP304）說(shuō)明抽提克氏原螯蝦基因組DNA，具體步驟：取20 mg背部肌肉剪碎，加入200 μL緩沖液GA和20 μL Proteinase K溶液，混勻，56 ℃水浴鍋消化3 h;加入200 μL緩沖液GB，充分混勻，70 ℃作用10 min后加入200 μL無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15 s;將所得溶液加入吸附柱CB3中，12000 r/min離心1 min，棄廢液;將吸附柱CB3放回收集管中，加入500 μL緩沖液GD，12000 r/min離心1 min，棄廢液;將吸附柱CB3放回收集管中，再加入600 μL漂洗液PW，12000 r/min離心1 min，棄廢液;將吸附柱CB3放回收集管中，12000 r/min空離2 min，室溫靜置5 min，向吸附柱CB3中央滴加80 μL滅菌ddH2O，12000 r/min離心2 min洗脫DNA;最后在NanoDrop 1000分光光度計(jì)（Thermo）上測(cè)定DNA濃度，選擇OD260/280在1.8～2.2的樣品，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 4 PCR擴(kuò)增

采用8對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)待檢測(cè)的克氏原螯蝦樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0 μL：10×Taq PCR MasterMix聚合酶[天根生化科技（北京）有限公司]10.0 μL，正、反向引物（10 μmol/L）各0.5 μL，DNA模板3.0 μL（400 ng），ddH2O 6.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。取出PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，制備2.0%瓊脂糖凝膠，并按樣品編號(hào)順序，以20和50 bp DNA Ladder（TaKaRa）為參考，每孔加樣8.0 μL，90 V下電泳3～5 h（不同微衛(wèi)星座位的電泳時(shí)間有所不同），待條帶分離開(kāi)后用GE Healthcare ImageQuant LAS500（Uppsala）成像儀進(jìn)行成像，并采用ImageQuant TL進(jìn)行條帶分析。

1. 5 統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)電泳獲得各樣品微衛(wèi)星位點(diǎn)信息后，采用PopGene32和NTSYSpc 2.1等在線(xiàn)軟件分析不同地區(qū)克氏原螯蝦群體微衛(wèi)星位點(diǎn)的等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon?s信息指數(shù)（I）、Ho、He、基因流（Nm）、遺傳分化指數(shù)（Fst）、遺傳相似性系數(shù)及遺傳距離等參數(shù)，使用PHYLIP v3.5進(jìn)行聚類(lèi)分析。Hardy-Weinberg平衡偏離指數(shù)（D）是反映群體在某個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)偏離Hardy-Weinberg平衡程度的參數(shù)，計(jì)算公式為D=（Ho-He）/He;多態(tài)信息含量（PIC）反映微衛(wèi)星DNA的變異程度，是衡量微衛(wèi)星位點(diǎn)多樣性的重要指標(biāo)（Botstein et al.，1980）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果

采用8對(duì)微衛(wèi)星引物對(duì)廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體共140份樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳凝膠成像均獲得清晰的電泳條帶，部分微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖1所示。

2. 2 不同地區(qū)克氏原螯蝦群體的等位基因分析結(jié)果

選取8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)對(duì)廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體的等位基因及有效等位基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)克氏原螯蝦群體的8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)共檢測(cè)到37個(gè)等位基因，平均Na為3.925個(gè)，每個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的Na在3～6個(gè)，其中，PclG02的Na最少（3個(gè)），PclG07的Na最多（6個(gè)），各地區(qū)克氏原螯蝦群體的平均Na為3.750～4.250（表3），不存在明顯差異。8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均Ne為1.5267～4.6997;各地區(qū)克氏原螯蝦群體的平均Ne為2.5142～3.0574，其中柳州群體和融水群體的Ne較高（2.9328和3.0574），而南寧群體的Ne較低（2.5142）。

2. 3 不同地區(qū)克氏原螯蝦群體內(nèi)的遺傳多樣性分析結(jié)果

通過(guò)PopGene32對(duì)廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行群體內(nèi)遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示，南寧克氏原螯蝦群體的平均 I 為0.9843，大塘、融水、柳州和來(lái)賓4個(gè)克氏原螯蝦群體的平均 I 則在1.1000以上（表3）。從表4可看出，5個(gè)克氏原螯蝦群體在8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中均存在不同程度的多態(tài)性。其中，5個(gè)群體的平均Ho在0.3563～0.5208，以南寧群體和柳州群體最高、來(lái)賓群體最低;但南寧群體的平均He最低（0.5708），而其他4個(gè)群體均在0.6200以上。南寧克氏原螯蝦群體的平均PIC為0.4899，呈中度多態(tài)性（0.250.50）。

5個(gè)克氏原螯蝦群體的平均D均為負(fù)值，表明廣西克氏原螯蝦群體總體上處于雜合子缺失狀態(tài)。南寧群體中有4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的雜合子缺失，平均D最接近于0，相對(duì)于其他群體而言較平衡;其他4個(gè)群體的8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)中有6～7個(gè)處于雜合子缺失狀態(tài)，以來(lái)賓群體最明顯，D為-0.4418，雜合子缺失及偏離Hardy-Weinberg平衡最嚴(yán)重（表4）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)南寧群體有4個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)處于極顯著水平（P<0.01，下同）及1個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)處于顯著水平（P<0.05，下同），其他4個(gè)群體則存在6～8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)處于顯著或極顯著水平（表5），表明廣西不同地區(qū)克氏原鰲蝦已發(fā)生不同程度的Hardy-Weinberg平衡偏離。

2. 4 不同地區(qū)克氏原螯蝦群體間的遺傳分化分析結(jié)果

采用PopGene32對(duì)廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體進(jìn)行種群間的遺傳分化分析，結(jié)果顯示，5個(gè)群體間的Nm在2.3898～6.0284（表6），說(shuō)明不同群體間存在一定程度的交流;其中，柳州群體與來(lái)賓群體的Nm最高（6.0284），其次是融水群體與柳州群體的Nm（5.2530）及南寧群體與柳州群體的Nm（4.2289），說(shuō)明這些地區(qū)屬于隨機(jī)交配的群體;而其他群體間的Nm在2.0000～4.0000，屬于高度交流的群體。群體間的Nm越大，則Fst越小。5個(gè)克氏原螯蝦群體間的Fst在0.0398～0.0947，其中，柳州群體與來(lái)賓群體的Fst最小，其次是柳州群體與融水群體（0.0454），而其他群體間處于中度分化水平，其所有群體間尚未出現(xiàn)高度分化現(xiàn)象。

由表7可知，廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體間的遺傳相似系數(shù)在0.6861～0.8583，均具有較高的親緣關(guān)系，對(duì)應(yīng)的遺傳距離為0.1528～0.3768。其中，柳州群體與來(lái)賓群體的遺傳相似系數(shù)最高，遺傳距離最近，表明這兩個(gè)群體間的親緣關(guān)系最近，遺傳變異程度較小;大塘群體與來(lái)賓群體的遺傳相似系數(shù)最低，遺傳距離最遠(yuǎn)，表明這兩個(gè)群體間在5個(gè)群體中的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，變異程度相對(duì)較大。

2. 5 不同地區(qū)克氏原螯蝦群體的遺傳聚類(lèi)分析結(jié)果

基于遺傳距離通過(guò)PHYLIP v3.5對(duì)廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體進(jìn)行UPGMA聚類(lèi)分析，結(jié)果顯示5個(gè)克氏原螯蝦群體可分為兩大分支（圖2），其中，南寧群體和大塘群體聚類(lèi)為一支，而柳州群體先與來(lái)賓群體聚類(lèi)再與融水群體聚類(lèi)成另一支。由各克氏原螯蝦群體間的遺傳距離長(zhǎng)度（在各自線(xiàn)條上方）也可知，柳州群體與來(lái)賓群體的遺傳距離最近。

3 討論

明確克氏原螯蝦的生物多樣性，可提高其育種篩選效率，進(jìn)而增強(qiáng)克氏原螯蝦的適應(yīng)能力。廣西克氏原螯蝦的生物多樣性至今尚未得到系統(tǒng)研究，僅有李喜蓮等（2016）曾報(bào)道廣西克氏原螯蝦群體相對(duì)于其他省份的克氏原螯蝦群體具有較高遺傳多樣性，但廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體間并未進(jìn)行系統(tǒng)比較。開(kāi)展廣西不同克氏原螯蝦群體生物多樣性分析除了有利于促進(jìn)優(yōu)勢(shì)物種繁育外，對(duì)了解克氏原螯蝦在華南地區(qū)的遺傳多樣性也具有重要意義。王長(zhǎng)忠等（2009）研究表明，長(zhǎng)江中下游地區(qū)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性均處于中等水平，而南京地區(qū)是我國(guó)最早引進(jìn)克氏原螯蝦的地方，故其群體具有較高遺傳多樣性。彭剛等（2010）研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)江流域4個(gè)克氏原螯蝦群體均已發(fā)生一定程度的Hardy-Weinberg平衡偏離，群體內(nèi)的基因型頻繁發(fā)生變動(dòng)，且野生群體的遺傳多樣性高于養(yǎng)殖群體。本研究選取廣西5個(gè)地區(qū)（南寧、大塘、融水、柳州和來(lái)賓）的克氏原螯蝦群體作為研究對(duì)象，利用8個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行生物多樣性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5個(gè)克氏原螯蝦群體的Na在30～34個(gè)，平均Ne在2.5142～3.0574，與王長(zhǎng)忠等（2009）、費(fèi)騰等（2010）、彭剛等（2010）的研究結(jié)果相似。廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體的平均He均較高，即存在一定程度的遺傳多樣性;PIC在0.4899～0.5843，高于王長(zhǎng)忠等（2009）、費(fèi)騰等（2010）的研究結(jié)果，而與彭剛等（2010）的研究結(jié)果相似，說(shuō)明廣西克氏原螯蝦群體的多態(tài)性高于封閉式養(yǎng)殖群體;5個(gè)克氏原螯蝦群體的 I 在0.9843～1.1856，也說(shuō)明廣西克氏原螯蝦群體具有較高的遺傳多樣性。此外，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體的平均D均為負(fù)值，總體上處于雜合子缺失狀態(tài)，與王長(zhǎng)忠等（2009）的研究結(jié)果相似，究其原因可能是群體數(shù)量較少且瓶頸效應(yīng)的出現(xiàn)導(dǎo)致稀有基因缺失。

Fst是衡量群體間遺傳分化的重要參數(shù)，F(xiàn)st在0.05～0.15屬于中等分化水平，其與Nm呈負(fù)相關(guān);Nm則反映群體間基因交流的程度，Nm越大基因交流越頻繁（劉倩倩等，2018）。本研究結(jié)果顯示，柳州群體與來(lái)賓群體的Nm最大、Fst最小，說(shuō)明兩個(gè)群體間進(jìn)行交流的程度最高，其次是柳州群體與融水群體，可能是由于地理距離較近及頻繁人為引種所致;而來(lái)賓群體與南寧群體及大塘群體的基因交流相對(duì)較少，可能是這些群體是不同的種群，且具有各自獨(dú)特的遺傳多樣性。遺傳距離可反映群體間的變異情況和分化程度（Crawford and Littlejohn，1998），與其遺傳相似系數(shù)呈對(duì)立關(guān)系，而遺傳相似系數(shù)代表著群體間的親緣關(guān)系。廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體的遺傳距離趨勢(shì)與Fst趨勢(shì)一致，而遺傳相似系數(shù)與Nm趨勢(shì)一致，均表明柳州群體與來(lái)賓群體具有高度的相似性，遺傳距離較小，與這兩個(gè)地區(qū)的地理距離最近相符。UPGMA聚類(lèi)分析結(jié)果也顯示，南寧群體和大塘群體聚類(lèi)為另一支，而柳州群體先與來(lái)賓群體聚類(lèi)再與融水群體聚類(lèi)成一支，其聚類(lèi)分析結(jié)果符合地理區(qū)域分布。廣西5個(gè)地區(qū)的克氏原螯蝦群體雖然聚類(lèi)分成兩支，但各群體間均有不同程度的基因交流，保持著中度至高度的遺傳多態(tài)性。其中，南寧群體和大塘群體的遺傳多樣性略低于融水群體、柳州群體和來(lái)賓群體，可能與其引種有關(guān)，為提高克氏原螯蝦遺傳多樣性，可適當(dāng)從遺傳多樣性較高的融水、柳州或來(lái)賓等地引種進(jìn)行雜交，選育出多樣性豐富的群體進(jìn)行繁殖，保證各地區(qū)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性。廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體均處于雜合子缺失狀態(tài)，與南京克氏原螯蝦群體雜合子缺失的結(jié)論（王長(zhǎng)忠等，2009）相似，可能與養(yǎng)殖環(huán)境和養(yǎng)殖時(shí)間有關(guān)，為避免雜合子缺失，還建議適當(dāng)從國(guó)外引進(jìn)優(yōu)良品種，并加強(qiáng)不同地區(qū)間克氏原螯蝦群體的遺傳交流。

4 結(jié)論

廣西不同地區(qū)克氏原螯蝦群體具有一定的遺傳多樣性，但其雜合子缺失現(xiàn)象普遍存在，應(yīng)通過(guò)適當(dāng)引種及加強(qiáng)不同地區(qū)群體間的遺傳交流，保護(hù)好克氏原螯蝦的優(yōu)良種質(zhì)資源。

參考文獻(xiàn)：

曹玲亮，周立志，張保衛(wèi). 2010. 安徽三大水系入侵物種克氏原螯蝦的種群遺傳格局[J]. 生物多樣性，18（4）：398-407. [Cao L L，Zhou L Z，Zhang B W. 2010. Genetic patterns of an invasive Procambarus clarkii population in the three river basins of Anhui Province[J]. Biodiversity Science，18（4）：398-407.]

戴愛(ài)云. 1983. 介紹一種水產(chǎn)資源——蝲蛄[J]. 動(dòng)物學(xué)雜志，（3）：48-50. [Dai A Y. 1983. Introducing an aquatic resource— Crayfish[J]. Chinese Journal of Zoology，（3）：48-50.]

費(fèi)騰，李佳佳，黃越峰，黃成，唐建清. 2010. 封閉小水體養(yǎng)殖對(duì)克氏原螯蝦基因多樣性的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，（5）：67-69. [Fei T，Li J J，Huang Y F，Huang C，Tang J Q. 2010. Effects of enclosed water body on genetic polymorphisms of Procambarus clarkii[J]. Jiangsu Agricultural Sciences，（5）：67-69.]

李喜蓮，李飛，朱俊杰，顧志敏. 2016. 基于SSR標(biāo)記的克氏原螯蝦種質(zhì)資源遺傳多樣性研究[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，35（2）：63-68. [Li X L，Li F，Zhu J J，Gu Z M. 2016. Genetic diversity of the red swamp crayfish（Procambarus clarkii） resources based on SSR markers[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，35（2）：63-68.]

劉倩倩，葉浩婷，李放，王榮婷，田恩偉. 2018. 杭白芷種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（3）：418-423. [Liu Q Q，Ye H T，Li F，Wang R T，Tian E W. 2018. SSR analysis for genetic diversity of Angelica dahu-rica var. formosana[J]. Journal of Southern Agriculture，49（3）：418-423.]

彭剛，劉偉杰，李佳佳，嚴(yán)維輝，唐建清. 2010. 長(zhǎng)江流域3個(gè)克氏原螯蝦野生群體遺傳結(jié)構(gòu)的微衛(wèi)星分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，26（5）：1115-1117. [Peng G，Liu W J，Li J J，Yan W H，Tang J Q. 2010. Microsatellite DNA analysis of genetic structure of three wild populations of Procambarus clarkii in the Yangtze River basin[J]. Jiangsu Journal of Agricultural Sciences，26（5）：1115-1117.]

秦海峰，龍寧，吳建國(guó)，石春海. 2014. 甜葉菊微衛(wèi)星富集文庫(kù)的構(gòu)建與多態(tài)性標(biāo)記的篩選[J]. 作物學(xué)報(bào)，40（3）：447-456. [Qin H F，Long N，Wu J G，Shi C H. 2014. Construction of microsatellite-enriched library and isolation of icrosatellite markers in Stevia rebaudiana[J]. Acta Agro-nomica Sinica，40（3）：447-456.]

宋光同，何吉祥，吳本麗，陳靜，黃龍，汪翔，武松. 2018. 克氏原螯蝦雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育及組織結(jié)構(gòu)觀察[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，30（2）：68-75. [Song G T，He J X，Wu B L，Chen J，Huang L，Wang X，Wu S. 2018. Study on development of female reproductive system and histological structure of Procambarus clarkii[J]. Acta Agriculturae Jiangxi，30（2）：68-75.]

孫效文，張曉鋒，趙瑩瑩，張研，賈智英，常玉梅，魯翠云，梁利群. 2008. 水產(chǎn)生物微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，15（4）：689-703. [Sun X W，Zhang X F，Zhao Y Y，Zhang Y，Jia Z Y，Chang Y M，Lu C Y，Liang L Q. 2008. Development and application of microsa-tellite markers in aquatic species[J]. Journal of Fishery Sciences of China，15（4）：689-703.]

王長(zhǎng)忠，李忠，梁宏偉，呼光富，吳勤超，鄒桂偉，羅相忠. 2009. 長(zhǎng)江下游地區(qū)4個(gè)克氏原螯蝦群體的遺傳多樣性分析[J]. 生物多樣性，17（5）：518-523. [Wang C Z，Li Z，Liang H W，Hu G F，Wu Q C，Zou G W，Luo X Z. 2009. Genetic diversity in four Procambarus clarkii populations in the lower reaches of the Yangtze River[J]. Biodiversity Science，17（5）：518-523.]

邢智珺，姜虎成，陸偉，錢(qián)照君，于宏偉，李家樂(lè). 2014. 江蘇8個(gè)克氏原螯蝦群體遺傳多樣性微衛(wèi)星分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，23（5）：656-662. [Xing Z J，Jiang H C，Lu W，Qian Z J，Yu H W，Li J L. 2014. Genetic diversity analysis of eight Procambarus clarkii stocks in Jiangsu Province based on microsatellites[J]. Journal of Shanghai Ocean University，23（5）：656-662.]

熊良偉，王帥兵，岳麗佳，王建國(guó)，陶桂慶，徐亮，王權(quán). 2018. 寬體金線(xiàn)蛭基因組SSR序列特征分析及其分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（11）：2298-2303. [Xiong L W，Wang S B，Yue L J，Wang J G，Tao G Q，Xu L，Wang Q. 2018. SSR sequence characters for genome of Whitmania pigra Whitman and development of molecular markers[J]. Journal of Southern Agriculture，49（11）：2298-2303.]

徐濱，李忠，魏開(kāi)金，馬寶珊，朱祥云，徐進(jìn). 2019. 6個(gè)克氏原螯蝦群體形態(tài)學(xué)分析[J]. 淡水漁業(yè)，49（6）：27-32. [Xu B，Li Z，Wei K J，Ma B S，Zhu X Y，Xu J. 2019. Morphological variations among six populations of Procambarus clarkia[J]. Freshwater Fisheries，49（6）：27-32.]

嚴(yán)維輝，唐建清，許志強(qiáng)，李佳佳. 2019. 克氏原螯蝦大棚育苗試驗(yàn)總結(jié)[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖，（12）：8-9. [Yan W H，Tang J Q，Xu Z Q，Li J J. 2019. Summary of greenhouse seedling experiment of Procambarus clarkii[J]. Journal of Aquaculture，（12）：8-9.]

張愛(ài)軍，沈繼紅. 2005. 龍蝦的綜合加工利用[J]. 中國(guó)資源綜合利用，（9）：35-36. [Zhang A J，Shen J H. 2005. The comprehensive machining utilization of Chinese lobster[J]. China Resources Comprehensive Utilization，（9）：35-36.]

Belfiore N，May B. 2000. Variable microsatellite loci in red swamp crayfish，Procambarus clarkii，and their characte-rization in other crayfish taxa[J]. Molecular Ecology，9（12）：2231-2234.

Botstein D，White R L，Skolnick M H，Davis R W. 1980. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. The American Journal of Human Genetics，32（3）：314-331.

Crawford A M，Littlejohn R P. 1998. The use of DNA mar-kers in deciding conservation priorities in sheep and other livestock[J]. Animal Genetic Resources Information，23：21-26.

Cruz P，Mejia-Ruiz C H，Perez-Enriquez R，Ibarra A M. 2002. Isolation and characterization of microsatellites in Pacific white shrimp Penaeus（Litopenaeus） vannamei[J]. Mole-cular Ecology Notes，2（3）：239-241.

Li Y H，Guo X W，Cao X J，Deng W，Luo W，Wang W M. 2012. Population genetic structure and post-establishment dispersal patterns of the red swamp crayfish Procambarus clarkii in China[J]. PLoS One，7（7）：e40652.

Schl?tterer C，Tautz D. 1992. Slippage synthesis of simple sequence DNA[J]. Nucleic Acids Research，20（2）：211-215.

Yi S K，Li Y H，Shi L L，Zhang L，Li Q B，Chen J. 2018. Characterization of population genetic structure of red swamp crayfish，Procambarus clarkii，in China[J]. Scientific Reports，8（1）：5586.

Zhu Z Y，Yue G H. 2008. Eleven polymorphic microsatellites isolated from red swamp crayfish，Procambarus clarkii[J]. Molecular Ecology Resources，8（4）：796-798.