牛蛙腐皮病病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)

戚建華 劉韻怡 童文濤 肖翎 趙禎 宋增福

摘要：【目的】明確浙江嘉善某養(yǎng)殖場引起牛蛙腐皮病的致病菌，并探究益生菌與牛蛙腐皮病病原菌間的相互作用，為今后利用益生菌防控牛蛙腐皮病的發(fā)生提供技術(shù)支持?！痉椒ā客ㄟ^常規(guī)的細(xì)菌分離純化、人工回歸感染試驗(yàn)、生理生化特性鑒定及16S rDNA序列擴(kuò)增，確定引起牛蛙腐皮病的致病菌;根據(jù)藥敏試驗(yàn)篩選抗菌藥物，并從生物防控的角度探究枯草芽孢桿菌等益生菌與致病菌間的相互作用?！窘Y(jié)果】從患病牛蛙的內(nèi)臟及體表潰爛處共分離獲得9株疑似致病菌株，經(jīng)人工回歸感染試驗(yàn)確定菌株NWt-2為引起牛蛙腐皮病的致病菌;綜合其形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性及分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，可確定菌株NWt-2為布韋不動桿菌（Acinetobacter bouvetii）。菌株NWt-2對丁胺卡那、慶大霉素、哌拉西林、頭孢氨芐和硫酸阿米卡星等5種抗菌藥物高度敏感，對青霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、氟苯尼考、復(fù)方磺胺嘧啶、鹽酸林可霉素和鹽酸大觀林可霉素等7種抗菌藥物不敏感（耐藥）。濃度為105 CFU/mL的枯草芽孢桿菌和紫色桿菌對菌株NWt-2有一定的抑制作用，抑菌圈直徑分別為1.45±0.46和0.97±0.38 mm?！窘Y(jié)論】布韋不動桿菌是引起浙江嘉善養(yǎng)殖牛蛙發(fā)生腐皮病的致病菌，可選用丁胺卡那、慶大霉素、哌拉西林、頭孢氨芐和硫酸阿米卡星等抗菌藥物進(jìn)行防治。鑒于枯草芽孢桿菌對布韋不動桿菌具有一定的抑制效果，在當(dāng)前病原菌對抗菌藥物普遍存在耐藥性的情況下，選擇枯草芽孢桿菌等益生菌進(jìn)行生物防控具有可行性。

關(guān)鍵詞： 牛蛙;腐皮病;布韋不動桿菌;枯草芽孢桿菌;藥敏試驗(yàn)

中圖分類號： S947.2? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）02-0461-09

Isolation and identification of the pathogen of rot skin disease in Rana catesbiana and its drug sensitive test

QI Jian-hua1，2， LIU Yun-yi1，2， TONG Wen-tao1，2， XIAO Ling1，2，

ZHAO Zhen1，2， SONG Zeng-fu1，2*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education （Shanghai Ocean University）， Shanghai 201306， China; 2National Pathogen Collection for Aquatic Animals（Shanghai Ocean University）， Shanghai? 201306， China; 3Key Laboratory of Exploration and Utilization of Aquatic Genetic Resources， Ministry of? Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai? 201306， China）

Abstract：【Objective】The bacterial pathogen of bullfrog（Rana catesbiana） rot skin disease in a farm of Jiashan， Zhejiang was determined， and the interaction between probiotics and bullfrog rot skin pathogens was explored to provide technical support for the use of probiotics to prevent and control bullfrog rot skin disease in the future. 【Method】Using conventional bacterial isolation and purification， artificial regression infection test， physiological and biochemical characteristics identification and 16S rDNA sequence amplification to determine the pathogenic bacteria that caused bullfrog rot skin disease. According to drug sensitivity tests， the antibacterial drugs were screened， and explored the interaction between probiotics such as Bacillus subtilis and pathogenic bacteria from the perspective of biological control. 【Result】Nine suspected strains were isolated from the viscera and body ulcers of the diseased bullfrog， and the artificial regression infection test determined that the strain NWt-2 was the pathogenic bacteria causing bullfrog rot skin disease. The strain NWt-2 was identified as Acinetobacter buvestris based on the morphological characteristics， physiological and biochemical characteristics and molecular biological identification results. The results of drug sensitivity test showed that the strain NWt-2 was highly sensitive to five antibacterial drugs such as amikana， gentamicin， piperacillin， cefalexin and amikacin sulfate; it was insensitive or resistant to seven antibacterial drugs such as penicillin， compound neonomine， norfloxacin， flufenicol， compound sulfadiazine， lincomycin hydrochloride and spectomycin hydrochloride. B. subtilis and Chromobacterium violaceum at a concentration of 105 CFU/mL had certain inhibitory effect on the strain NWt-2， and the diameter of the inhibition zones respectively were 1.45±0.46 and 0.97±0.38 mm. 【Conclusion】A. buvestris is a pathogenic bacteria that causes rot skin disease in Jiashan， Zhejiang. Antibacterial drugs such as amikacin， gentamicin， piperacillin， cephalexin and amikacin can be selected for prevention and treatment. In view of the certain inhibitory effect of B. subtilis on A. buvestris， under the condition that the pathogens are generally resistant to antibacterial drugs， it is feasible to select probio-tics such as B. subtilis for biological control.

Key words： Rana catesbiana; rot skin disease; Acinetobacter buvestris; Bacillus subtilis; drug sensitivity test

Foundation item：Shanghai Collaborative Innovation Center Fund Project（ZF1206）; Nanjing Entrepreneurship Ta-lent 321 Project （D-8005-14-0005）

0 引言

【研究意義】牛蛙（Rana catesbiana）屬于大型可食用蛙類，其肉質(zhì)潔白細(xì)嫩、味道鮮美、營養(yǎng)豐富，是一種高蛋白、低脂肪、低熱量、低膽固醇的營養(yǎng)保健食品，且牛蛙的皮、油、激素、腺體和膽汁等可作為工業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)及醫(yī)藥業(yè)等行業(yè)的原材料，而具有極高的應(yīng)用價值（高博，2017）。牛蛙是我國特種水產(chǎn)養(yǎng)殖的主要經(jīng)濟(jì)動物之一，其年銷售量已超過15萬t（Zhang et al.，2015）。與其他水產(chǎn)養(yǎng)殖動物一樣，高密度養(yǎng)殖模式是多種疾病發(fā)生的誘因，嚴(yán)重阻礙了牛蛙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展（楊春浩，2010;高博，2017）。飼養(yǎng)過程中應(yīng)盡量降低養(yǎng)殖密度，避免因擁擠摩擦而造成體表破損，且要定期對養(yǎng)殖水質(zhì)和環(huán)境進(jìn)行消毒，減少疾病發(fā)生。但隨著牛蛙放養(yǎng)密度不斷增加和水體養(yǎng)殖環(huán)境的污染，蛙類腐皮病的發(fā)生越來越頻繁，危害越來越嚴(yán)重，加之養(yǎng)殖戶對抗生素的不合理使用，增強(qiáng)了病原菌的耐藥性，且多重耐藥菌株逐漸增多，致使細(xì)菌性病害防控難度增加。因此，尋找抗生素替代物是發(fā)展牛蛙綠色生態(tài)養(yǎng)殖的必然趨勢?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前已報(bào)道的牛蛙疾病主要有由虹彩病毒等引起的病毒?。▌詵|等，2012），由車輪蟲（Trichodina）、舌杯蟲（Apiosoma）、斜管蟲（Chilodonella）和錨頭蚤（Lernaea）等引起的寄生蟲?。ɡ钋闪岬?，2018），以及由假單胞菌（Pseudomonadaceae）、氣單胞菌（Aeromomas）、愛德華氏菌（Edwardsiella）、鏈球菌（Streptococcus）、葡萄球菌（Staphylococcus）、變形菌（Proteus）、不動桿菌（Acinetobacter）、伊麗莎白菌（Elizabethkingia）和耶爾森氏菌（Yersinia）等引起的細(xì)菌性疾?。ㄒ鼈惛完惞?，2010;杭小英等，2012;于喆等，2013;韓艷楠等，2016）。由于病原菌種類繁多，病因復(fù)雜且傳播速度快、死亡率高等特點(diǎn)，在牛蛙疾病中以細(xì)菌性病害的危害最嚴(yán)重，是牛蛙養(yǎng)殖疾病防控的主要對象（卜令飛等，2019）。其中，腐皮病是牛蛙養(yǎng)殖過程中最常見的疾病，發(fā)病初期牛蛙頭部和背面皮膚失去光澤，體色發(fā)黑，接著皮膚開始脫落腐爛，露出肌肉，隨后腐爛區(qū)域逐漸擴(kuò)散至整個背部;嚴(yán)重時指骨和頜骨外露，死亡率極高（盧仲春，1997）。牛蛙腐皮病可分為營養(yǎng)性腐皮病和創(chuàng)傷性腐皮病，其中，營養(yǎng)性腐皮病是由于長期攝食缺乏維生素飼料所導(dǎo)致，而創(chuàng)傷性腐皮病是因牛蛙相互撕咬、碰傷導(dǎo)致體表皮膚破損致使病原菌侵入引起發(fā)?。ūR仲春，1997）。創(chuàng)傷性腐皮病因病原菌復(fù)雜多樣，是牛蛙腐皮病防治的主要對象，且此病常與由嗜水氣單胞菌（A. hydrophila）引起的紅腿病并發(fā)，給牛蛙養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失（舒新華，1997a）。益生菌（Probiotics）作為一種具有多種生物功能的活菌制劑，不僅可避免使用抗生素產(chǎn)生的耐藥性等副作用，達(dá)到防病治病的效果，還能促進(jìn)養(yǎng)殖品種生長，已廣泛應(yīng)用于動物養(yǎng)殖生產(chǎn)（王源等，2018）。在目前研究較廣泛的益生菌中，戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）和短乳桿菌（Lactobacillus brevis）對唾液鏈球菌（S. salivarius）具有很好的抑制作用（Taheur et al.，2016），而雙歧桿菌（Bifidobacterium）和乳酸菌（Lactobacillus）對大腸桿菌（Escherichia coli）具有較強(qiáng)的抑菌活性（Abdelhamid et al.，2018）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】近年來，浙江嘉善牛蛙養(yǎng)殖場的牛蛙因皮膚腐爛而造成大批死亡，經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重，因此急需明確其病因并采取有效的防治措施，以確保牛蛙養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。【擬解決的關(guān)鍵問題】對浙江嘉善某牛蛙養(yǎng)殖場患腐皮病的牛蛙進(jìn)行病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，并從生物防控的角度探究枯草芽孢桿菌（Bacillus subti-lis）等益生菌與牛蛙腐皮病病原菌間的相互作用，為今后利用益生菌防控牛蛙腐皮病的發(fā)生提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

患腐皮病牛蛙由浙江嘉善某牛蛙養(yǎng)殖場送檢，體重200～300 g/只;健康牛蛙購自浙江嘉善，體重150～250 g/只，共100只，活力良好，體表無損傷，置于水溫為26 ℃的水族箱中暫養(yǎng)2周，觀察確認(rèn)無發(fā)病、死亡現(xiàn)象后用于后續(xù)試驗(yàn)。LB培養(yǎng)基購自生工生物工程（上海）股份有限公司;丁胺卡那、慶大霉素、四環(huán)素、哌拉西林、羧芐西林、頭孢氨芐、青霉素、復(fù)方新諾明和諾氟沙星9種藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司，鹽酸大觀林可霉素、恩諾沙星溶液、氟苯尼考粉、復(fù)方磺胺嘧啶粉、鹽酸林可霉素和硫酸阿米卡星6種藥物購自廣州白云山寶神動物保健品有限公司;麥?zhǔn)蠞岫裙苜徸陨钲诳堤┥镏破饭煞萦邢薰?枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）、蠟狀芽孢桿菌（B.cereus）和紫色桿菌（Chromobacterium violaceum）益生菌由上海海洋大學(xué)微生物教研室提供。主要儀器設(shè)備：恒溫培養(yǎng)振蕩器（ZWY-240，上海智城分析儀器制造有限公司），生化培養(yǎng)箱（SPX-150B-Z，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A，上海一恒科技有限公司），Hirayama高壓滅菌鍋（HVE-50，廣州華粵行儀器有限公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus BX53F，上海啟步生物科技有限公司）。

1. 2 試驗(yàn)方法

1. 2. 1 病原菌分離與純化 選取患病牛蛙，用無菌水清洗其體表，再以75%酒精棉球反復(fù)擦拭，無菌操作下打開腹腔并采集肝臟、腸道、眼及體表潰爛組織，劃線接種于LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h。挑取LB培養(yǎng)基上形態(tài)特征一致的優(yōu)勢單菌落劃線分離，28 ℃培養(yǎng)24 h。

1. 2. 2 人工回歸感染試驗(yàn) 將分離純化的菌株分別轉(zhuǎn)接至LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h。菌液在4 ℃下5500 r/min離心10 min，棄上清液，菌體沉淀加9 mL生理鹽水振蕩重懸后再次離心，重復(fù)3次。與麥?zhǔn)蠞岫裙鼙葘Γ尤肷睇}水制成濃度為6×108 CFU/mL的菌懸液。人工回歸感染試驗(yàn)在52 cm×34 cm×44 cm的水族箱中進(jìn)行，每組10只健康牛蛙，感染組用無菌注射器在牛蛙右側(cè)腿部肌肉注射0.2 mL菌懸液，對照組注射等量生理鹽水。試驗(yàn)過程中觀察記錄牛蛙發(fā)病癥狀，發(fā)現(xiàn)瀕死牛蛙及時取出解剖，并對病灶區(qū)進(jìn)行細(xì)菌分離。

1. 2. 3 生理生化特性鑒定 按細(xì)菌生化微量鑒定管說明對分離菌株進(jìn)行生理生化特性鑒定。

1. 2. 4 病原菌鑒定 將人工感染試驗(yàn)中牛蛙死亡數(shù)最多的感染組病原菌從保存斜面培養(yǎng)基轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)特征并進(jìn)行革蘭氏染色。同時將初步分離獲得的疑似致病菌及人工感染試驗(yàn)分離得到的菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)16～20 h，取1.5 mL菌液置于2.0 mL離心管中，4 ℃下12000 r/min離心2 min，棄上清液，菌體沉淀送至上海邁浦生物科技有限公司提取DNA，采用通用引物27F（5'-AGAGTTTGATC CTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTA CGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測擴(kuò)增得到的16S rDNA序列。

1. 2. 5 藥敏試驗(yàn) 從保存斜面培養(yǎng)基上挑取病原菌菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中增菌培養(yǎng)24 h，然后將菌液稀釋至107 CFU/mL，取100 μL菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，室溫下干燥3～5 min，用無菌鑷子將11種抗菌藥物紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，每種藥物設(shè)3組重復(fù)，28 ℃培養(yǎng)24 h后以游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑，并記錄數(shù)據(jù)。同時，參照張浩等（2018）的研究方法將鹽酸林可霉素、恩諾沙星溶液、氟苯尼考粉等常用的蛙類疾病防治藥物制成簡易藥敏紙片，觀察記錄其對病原菌的抑菌效果。

1. 2. 6 與益生菌間相互作用 將培養(yǎng)24 h的病原菌和枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌及紫色桿菌均稀釋至105 CFU/mL，在枯草芽孢桿菌菌液、地衣芽孢桿菌菌液、蠟狀芽孢桿菌菌液和紫色桿菌菌液中分別加入滅菌藥敏紙片，取出備用。無菌操作下，吸取100 μL病原菌菌液均勻涂布于LB培養(yǎng)基上，室溫下干燥3～5 min，用無菌鑷子將益生菌紙片均勻貼于培養(yǎng)基表面，各紙片距離不小于24 mm，每個培養(yǎng)基貼4片，設(shè)3組重復(fù)。將培養(yǎng)皿置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察抑菌效果，并用游標(biāo)卡尺測量記錄抑菌圈直徑。

1. 3 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2013進(jìn)行整理統(tǒng)計(jì)，并以SPSS 17.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2. 1 病原菌分離培養(yǎng)結(jié)果

自然發(fā)病牛蛙體色發(fā)黑，頭部及腿部關(guān)節(jié)處皮膚腐爛可見肌肉，剖解發(fā)現(xiàn)其肝臟呈紅棕色（圖1）。從患病牛蛙的內(nèi)臟及體表潰爛處共分離獲得9株疑似致病菌株，依次編號為NWT-1、NWT-2、NWT-3、NWT-4、NWT-5、NWt-1、NWt-2、NWt-3和NWt-4，各分離菌株的生物學(xué)特征詳見表1。

2. 2 人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

人工回歸感染試驗(yàn)結(jié)果（表2）顯示，注射菌株NWt-2的牛蛙在第2 d開始出現(xiàn)死亡，至第7 d該處理組牛蛙全部死亡，且在其注射部位出現(xiàn)皮膚充血、發(fā)炎等癥狀，剖解發(fā)現(xiàn)牛蛙的肝臟腫大且呈紅棕色，胃部脹氣，部分牛蛙還出現(xiàn)關(guān)節(jié)腫大、腹腔積水腫脹等癥狀，與自然發(fā)病牛蛙的病癥相似。對照組及注射其他分離菌株的牛蛙均未表現(xiàn)出明顯病癥，且死亡牛蛙數(shù)較少或未發(fā)生死亡現(xiàn)象。

2. 3 病原菌鑒定結(jié)果

2. 3. 1 病原菌的菌落形態(tài)觀察及鏡檢結(jié)果 從注射菌株NWt-2死亡牛蛙個體的病灶區(qū)及內(nèi)臟組織中分離純化獲得1株菌株，編號為7t1。將菌株NWt-2和菌株7t1分別接種在LB培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h后觀察菌落形態(tài)并進(jìn)行革蘭氏染色，結(jié)果顯示，菌株NWt-2的菌落形態(tài)為圓形，直徑2～3 mm，呈乳白色、半透明，表面光滑、邊緣整齊;革蘭氏染色呈陰性，10×100倍油鏡下觀察其菌體呈短桿狀，兩端鈍圓，大小為1～2 μm，單獨(dú)或成雙排列（圖2-A）。菌株7t1的菌落形態(tài)及革蘭氏染色結(jié)果（圖2-B）與菌株NWt-2一致。

2. 3. 2 生理生化特性鑒定結(jié)果 菌株NWt-2和菌株7t1的生理生化特性鑒定結(jié)果詳見表3。其中，葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、賴氨酸、硝酸鹽、戊二酸和尿素等反應(yīng)結(jié)果均呈陽性，而明膠、鳥氨酸和淀粉等10項(xiàng)反應(yīng)結(jié)果呈陰性。參照鐘世勛等（2014）、王孝武等（2015）、李娟等（2018）、胡秀彩等（2019）的研究結(jié)果，初步判定菌株NWt-2為不動桿菌屬（Acinetobacter）。

2. 3. 3 分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 測序結(jié)果顯示，菌株NWt-2的16S rRNA序列長1448 bp。應(yīng)用BLAST （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）對菌株NWt-2的16S rRNA序列進(jìn)行對比分析，結(jié)果顯示，菌株NWt-2與A. bouvetii DSM（KB849725.1）的相似性最高，為99.44%，與其他不動桿菌屬參考菌株的相似性也均在97.00%以上（表4）。基于16S rRNA序列相似性，通過MEGA 6.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖3）也發(fā)現(xiàn)，菌株NWt-2屬于不動桿菌家族，與其親緣關(guān)系最近的菌株為布韋不動桿菌（A. Bouvetii）（KB849725.1）。菌株7t1的16S rRNA序列相似性對比分析及其系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析結(jié)果與菌株NWt-2一致，可確定菌株NWt-2是引起牛蛙腐皮病的致病菌，為布韋不動桿菌。

2. 4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

菌株NWt-2的藥敏試驗(yàn)結(jié)果見表5。根據(jù)藥敏試驗(yàn)判斷標(biāo)準(zhǔn)可知，菌株NWt-2對丁胺卡那、慶大霉素、哌拉西林、頭孢氨芐、硫酸阿米卡星等5種抗菌藥物高度敏感，對四環(huán)素和羧芐西林中度敏感，對恩諾沙星溶液低度敏感，對青霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、氟苯尼考、復(fù)方磺胺嘧啶、鹽酸林可霉素、鹽酸大觀林可霉素等7種藥物不敏感（耐藥）。

2. 5 菌株NWt-2與益生菌間的相互作用

菌株NWt-2與益生菌間的相互作用結(jié)果（圖4）顯示，濃度為105 CFU/mL的枯草芽孢桿菌和紫色桿菌對菌株NWt-2有一定的抑制作用，抑菌圈直徑分別為1.45±0.46和0.97±0.38 mm。其中，以枯草芽孢桿菌對菌株NWt-2的抑制效果較好。

3 討論

腐皮病是蛙類養(yǎng)殖中的一種常見細(xì)菌性疾病，但目前對于引起蛙類腐皮病致病菌的研究結(jié)論并不一致。舒新華等（1997b）對牛蛙腐皮病致病菌的研究表明，奇異變形桿菌（P. mirabilis）和克氏耶爾森氏菌（Y. kristensenii）均能獨(dú)立引起牛蛙腐皮病;同時發(fā)現(xiàn)克氏耶爾森氏菌能與嗜水氣單胞菌聯(lián)合感染引起牛蛙腐皮—紅腿并發(fā)癥（舒新華等，1997a）。葉雪平（1999）研究認(rèn)為，蛙類的爛皮病是由醋酸鈣不動桿菌（A. calcoaceticus）所引起。喬志剛等（2000）對美國青蛙腐皮病病原菌的分離鑒定結(jié)果顯示，嗜水氣單胞菌是主要的致病菌，其次為布蘭漢氏菌（Branhamella sp.）。謝鳳等（2002）研究證實(shí)引起美國青蛙腐皮病的致病菌為魯氏不動桿菌（A. lwoffii）。本研究從患腐皮病牛蛙的體表潰爛處和內(nèi)臟分離獲得9株疑似致病菌株，經(jīng)人工回歸感染試驗(yàn)證實(shí)菌株NWt-2可引起牛蛙出現(xiàn)腐皮病病癥，且從人工感染試驗(yàn)死亡牛蛙體表病灶區(qū)及內(nèi)臟組織中分離到1株與菌株NWt-2形態(tài)特征、生理生化特征及分子生物學(xué)特征一致的菌株，因此確定菌株NWt-2是引起牛蛙腐皮病的致病菌。通過對菌株NWt-2的16S rRNA序列進(jìn)行BLAST對比分析及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹分析，結(jié)果顯示其與布韋不動桿菌的親緣關(guān)系最近，相似性為99.44%。因此，確定引起浙江嘉善牛蛙養(yǎng)殖場牛蛙腐皮病的致病菌為布韋不動桿菌。

不動桿菌隸屬于變形菌綱（Alphaproteobacteria）假單胞目（Pseudomonadales）莫拉菌科（Moraxellaceae），目前已有研究的不動桿菌主要有醋酸鈣不動桿菌、魯氏不動桿菌、鮑曼不動桿菌（A. baumanii）、溶血不動桿菌（A. haemolytius）、瓊氏不動桿菌（A. junii）和約翰遜不動桿菌（A. johnsonii）6種（葉雪平，1999;謝鳳等，2002;顧澤茂等，2010;胡秀彩等，2019）。在蛙類疾病研究中，魯氏不動桿菌和醋酸鈣不動桿菌均能引起牛蛙腐皮病。本研究發(fā)現(xiàn)不動桿菌屬中的布韋不動桿菌對牛蛙也存在致病性，是一種新發(fā)現(xiàn)的牛蛙腐皮病病原菌，但具體致病機(jī)理有待進(jìn)一步探究。

目前，針對牛蛙腐皮病的防治手段仍然是藥物治療。陳超然等（2002）采用內(nèi)服鹽酸土霉素與外用穩(wěn)定性淀粉二氧化氯（ClO2）相結(jié)合的方法對患腐皮病牛蛙進(jìn)行治療，孟思妤等（2012）采用內(nèi)服鹽酸土霉素與外用菌毒消（主要成分為醋酸、十二烷基苯磺酸和酚）對患腐皮病牛蛙進(jìn)行治療，兩種方法雖然有一定的治療效果，但難以根治。本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，丁胺卡那、慶大霉素、哌拉西林、頭孢氨芐和硫酸阿米卡星等5種抗菌藥物對菌株NWt-2具有明顯的抑制作用，因此可考慮選用這5種抗菌藥物進(jìn)行防治;但恩諾沙星溶液、鹽酸林可霉素及氟苯尼考粉等常用水產(chǎn)抗菌處方藥物對牛蛙腐皮病沒有防治效果，可能是由于近年來牛蛙養(yǎng)殖戶過量亂用濫用抗菌藥物，致使病原菌耐藥性不斷增強(qiáng)（吳興鎮(zhèn)，2016），養(yǎng)殖戶為了控制病害發(fā)生而不斷增加抗菌藥物濃度，最終給食品安全帶來巨大隱患。

隨著國家對抗生素類藥物的使用限制，益生菌在綠色生態(tài)養(yǎng)殖中得到快速推廣與普及。益生菌不僅能提高水產(chǎn)養(yǎng)殖品種的生長性能，還有助于提高機(jī)體免疫力，抑制腸道致病菌，同時在水體物質(zhì)循環(huán)中發(fā)揮重要作用（謝宜濤和候曉敏，2018）。Taheur等（2016）從大麥、傳統(tǒng)肉制品及發(fā)酵橄欖中分離出3株乳酸菌，均滿足作為益生菌的標(biāo)準(zhǔn)，并證實(shí)其中的戊糖片球菌和短乳桿菌對唾液鏈球菌具有很好的抑制作用。Abdelhamid等（2018）研究表明，以MRS肉湯培養(yǎng)的雙歧桿菌和乳酸菌的無細(xì)胞提取物（CFSM）對所有大腸桿菌均具有較強(qiáng)的抑菌活性，抑菌圈直徑為11.77～23.10 mm。Singh等（2018）研究表明，山羊乳源乳酸菌對銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黃色葡萄球菌（S. aureus）具有顯著的抗菌作用，測試菌株的CFSM能降低病原體生物膜的形成活性。本研究從微生物防控病害的角度探討菌株NWt-2與益生菌間的相互作用，結(jié)果表明，濃度為105 CFU/mL的枯草芽孢桿菌對菌株NWt-2具有一定抑制作用，但抑制效果不及抗菌藥物明顯，其原因可能是選擇的益生菌種類、作用劑量等因素尚未優(yōu)化，但可預(yù)見篩選高效益生菌預(yù)防牛蛙腐皮病將是特種水產(chǎn)動物生態(tài)養(yǎng)殖和疾病防治的新思路。

4 結(jié)論

布韋不動桿菌是引起浙江嘉善養(yǎng)殖牛蛙發(fā)生腐皮病的致病菌，可選用丁胺卡那、慶大霉素、哌拉西林、頭孢氨芐和硫酸阿米卡星等抗菌藥物進(jìn)行防治。鑒于枯草芽孢桿菌對布韋不動桿菌具有一定的抑制效果，在當(dāng)前病原菌對抗菌藥物普遍存在耐藥性的情況下，選擇枯草芽孢桿菌等益生菌進(jìn)行生物防控具有可行性。

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