HPLC法同時(shí)測(cè)定新疆唇香草總黃酮提取物中3種黃酮類(lèi)成分的含量

馬 昕，燕雪花，張建新，劉宏炳

(新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830011)

唇香草(ZiziphoraclinopodioidesLam.)為唇形科新塔花屬多年生半灌木草本植物，別名芳香新塔花、小葉薄荷、山薄荷等，全株有強(qiáng)烈的薄荷香氣，喜生于低山坡、草地及干旱坡地上，是新疆的特有藥材，主要分布于我國(guó)新疆的阿勒泰山、天山、準(zhǔn)噶爾西部山地、帕米爾高原的山地草原及礫石質(zhì)坡地，中亞的哈薩克斯坦、吉爾吉斯坦、蒙古亦有分布[1]。唇香草全株地上部分均可入藥，其味辛性寒，具有強(qiáng)心利濕、理氣化痰、消炎散結(jié)的功效，用于治療心臟病、氣短多汗、水腫、咳嗽、氣管炎、肺膿腫等疾病，尤其在治療心臟病和高血壓疾病方面有很好的療效[2]?，F(xiàn)代藥理研究表明，唇香草具有良好的抗心肌缺血缺氧作用[3-5]、舒張血管[6-8]、抗氧化[9-12]、抗炎、止咳、祛痰和鎮(zhèn)痛作用[13]。唇香草含有揮發(fā)油、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、維生素、苷類(lèi)、有機(jī)酸、微量元素等成分[14-15]。唇香草在新疆民間被廣泛用于治療高血壓、冠心病和調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)功能，在中醫(yī)臨床上用于治療高血壓以及心肌缺血等疾病。本課題組前期研究表明，唇香草具有明顯的抗動(dòng)脈粥樣活性，而總黃酮是其主要的有效成分。為了對(duì)唇香草及其總黃酮提取物進(jìn)行質(zhì)量控制，作者以木犀草苷、蘆丁、芹菜苷等3個(gè)黃酮類(lèi)成分為指標(biāo)，建立同時(shí)測(cè)定其含量的HPLC法，擬用于唇香草總黃酮提取物有效成分的質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制，為其更深入的研究和資源的合理利用提供可靠的依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

唇香草總黃酮提取物，由新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

木犀草苷對(duì)照品(批號(hào)：5373-11-5，含量>98%)、芹菜苷對(duì)照品(批號(hào)：Q-077-150720，含量>98%)，成都瑞芬思生物科技有限公司；蘆丁對(duì)照品(批號(hào)：MUST-15091104，含量>98%)，中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所；甲醇(色譜純)；磷酸(分析純)；其它試劑均為分析純。

Agilent 1220 LC型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent 公司；ME204E型分析天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；DHG-9145A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司；KQ-5200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件

色譜柱為依利特Hypersil ODS-2(C18)(4.6 mm ×150 mm，5 μm) ；流動(dòng)相為甲醇(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫：0～30 min，25%A；30～55 min，25%～28%A；55～75 min，28%～35%A；75～100 min，35%～38%A；檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm；柱溫為35 ℃；流速為1 mL·min-1；進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.2 對(duì)照溶液的配制

精密稱(chēng)取木犀草苷、蘆丁、芹菜苷對(duì)照品適量，加甲醇分別配制成1.1 mg· mL-1木犀草苷對(duì)照溶液、1.1 mg·mL-1蘆丁對(duì)照溶液、1.0 mg·mL-1芹菜苷對(duì)照溶液作為儲(chǔ)備液，備用。

1.2.3 供試溶液的配制

精密稱(chēng)取唇香草總黃酮提取物約 0.017 5 g，置于 10 mL 容量瓶中，加甲醇約 9 mL 超聲(功率 200 W，頻率 40 kHz) 溶解唇香草總黃酮提取物，冷卻后用甲醇定容至刻度，搖勻，過(guò)濾，濾液作為供試溶液，備用。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照儲(chǔ)備液適量，加甲醇分別制成4.4 μg·mL-1、8.8 μg·mL-1、17.6 μg·mL-1、26.4 μg·mL-1、35.2 μg·mL-1、44.0 μg·mL-1木犀草苷對(duì)照溶液，4.4 μg·mL-1、8.8 μg·mL-1、17.6 μg·mL-1、26.4 μg·mL-1、35.2 μg·mL-1、44.0 μg·mL-1蘆丁對(duì)照溶液，4.0 μg·mL-1、8.0 μg·mL-1、16.0 μg·mL-1、24.0 μg·mL-1、32.0 μg·mL-1、40.0 μg·mL-1、60.0 μg·mL-1、80.0 μg·mL-1芹菜苷對(duì)照溶液。進(jìn)樣測(cè)定峰面積，以進(jìn)樣量(x)為橫坐標(biāo)、峰面積(y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得線性回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 唇香草總黃酮提取物中3種黃酮類(lèi)成分的線性回歸方程

Tab.1 Linear regression equation of three flavonoids in totalflavonoid extracts ofZiziphoraclinopodioidesLam.

對(duì)照品回歸方程R線性范圍/μg木犀草苷y=364680.07x-153286.970.99984.4～44.0蘆丁y=217812.29x+9326.031.00004.4～44.0芹菜苷y=203866.01x+173487.810.99984.0～80.0

2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一混合對(duì)照溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，計(jì)算得到木犀草苷、蘆丁、芹菜苷峰面積的RSD 分別為1.68%、1.24%、 1.16%，表明儀器精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取同一供試溶液10 μL，分別在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算得到木犀草苷、蘆丁、芹菜苷峰面積的RSD分別為1.08%、1.27%、1.66%，表明供試溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取6份同一批次唇香草總黃酮提取物約0.017 5 g，按1.2.3制備供試溶液 6 份，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定各組分峰面積，計(jì)算得到供試品中木犀草苷、蘆丁、芹菜苷峰面積的RSD 分別為1.72%、1.55%、1.38%，表明該方法的重復(fù)性良好。

2.5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知含量的唇香草總黃酮提取物0.017 5 g，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按1.2.3平行制備9份供試溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

Tab.2 Result of adding standard recovery(n=9)

由表2可知，木犀草苷的平均加標(biāo)回收率為99.99，RSD 為1.72%(n=9)；蘆丁的平均加標(biāo)回收率為99.12%，RSD為2.07%(n=9)；芹菜苷的平均加標(biāo)回收率為99.74%，RSD為2.41%(n=9)。表明方法的準(zhǔn)確度良好，回收率實(shí)驗(yàn)符合要求。

2.6 樣品含量測(cè)定

精密稱(chēng)取不同批次唇香草總黃酮提取物0.017 5 g，按1.2.3制備供試溶液。分別精密吸取混合對(duì)照溶液及供試溶液10 μL，進(jìn)樣測(cè)定木犀草苷、蘆丁、芹菜苷含量，結(jié)果見(jiàn)表3、圖1。

表3 唇香草總黃酮提取物中3種黃酮類(lèi)成分的含量測(cè)定

Tab.3 Determination of contents of three flavonoids in totalflavonoid extracts ofZiziphoraclinopodioidesLam.

樣品批號(hào)木犀草苷mg·g-1蘆丁mg·g-1芹菜苷mg·g-1201901052.674.598.02201903112.694.497.99201905062.684.548.06

1.木犀草苷 2.蘆丁 3.芹菜苷

3 結(jié)論

結(jié)合唇香草總黃酮中的化學(xué)組成，建立了同時(shí)檢測(cè)總黃酮提取物中指標(biāo)性成分木犀草苷、蘆丁、芹菜苷的HPLC法。結(jié)果表明，木犀草苷、蘆丁、芹菜苷質(zhì)量分別在4.4～44.0 μg(R=0.9998) 、4.4～44.0 μg(R=1.0000)、4.0～80.0 μg(R=0．9998)內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加標(biāo)回收率分別為99.99%、99.12%、99.74%，RSD分別 為1.72%、2.07%、2.41%。該方法專(zhuān)屬性好、快速、準(zhǔn)確，穩(wěn)定、重復(fù)性好，可作為唇香草總黃酮中黃酮類(lèi)成分的含量檢測(cè)方法，為其質(zhì)量評(píng)價(jià)與控制標(biāo)準(zhǔn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。