HPLC-ELSD全成分指紋圖譜研究疏肝理脾方配伍前后化學(xué)成分的變化

黃 湘，陳豐連，曹 騁，王術(shù)玲

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

根據(jù)中醫(yī)五行理論，肝郁氣滯，疏泄失常，致令運(yùn)化失司，是為“木郁戕土”；脾虛失運(yùn)，化源不充，肝失所藏，血不養(yǎng)肝，亦每令疏泄失常，是為“土虛木郁”，皆肝脾不和之證[1]，遂有四逆散、柴胡疏肝散、逍遙散等調(diào)和肝脾之經(jīng)典方藥。其中柴胡疏肝散出自《景岳全書·古方八陣·散陣》，由柴胡、陳皮、枳殼、香附、芍藥、川芎、甘草七味藥組成。方中柴胡為君藥，配伍陳皮、枳殼，起到行氣解郁導(dǎo)滯、疏肝理脾的作用，臨床常用于肝氣郁結(jié)導(dǎo)致的脅肋疼痛等癥狀[2]，也用于抑郁癥[3]、功能性消化不良[4]、脂肪肝[5]等疾病。本研究團(tuán)隊(duì)根據(jù)柴胡疏肝散的配伍規(guī)律，自擬疏肝理脾方，由柴胡、陳皮、枳殼三味藥組成，研究其治療功能性消化不良，取得較好效果，并且發(fā)現(xiàn)單用疏肝藥柴胡或單用理氣藥陳皮、枳殼藥理效果均不如三者合用。因此，作者利用HPLC-ELSD全成分指紋圖譜研究三者配伍前后化學(xué)成分的變化，為后續(xù)藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 藥品、試劑與儀器

柴胡飲片(產(chǎn)地陜西)；麩炒枳殼飲片(產(chǎn)地江西，生產(chǎn)批號(hào)為HX18M01)，廣東和翔制藥有限公司；陳皮飲片(產(chǎn)地廣東，生產(chǎn)批號(hào)為170301)，佛山星聯(lián)中藥飲片有限公司。

柴胡皂苷a、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)分別為P03M9F50593、K21F3C1、M02J9S64781、Z31J6L2067，純度均≥98%)，上海源葉生物科技有限公司；柴胡皂苷b2(批號(hào)為MUST-15082505，純度≥98%)，成都曼思特生物科技有限公司；超純水，自制；乙腈，色譜純；其它化學(xué)試劑均為分析純。

Nexera X2型高效液相色譜儀，日本島津公司；ELSD 6000型蒸發(fā)光散射檢測器，美國奧泰科技有限公司；DE-200 g型萬能粉碎機(jī)，浙江紅景天工貿(mào)有限公司；實(shí)驗(yàn)室專用超純水機(jī)，沃特浦；BP211D型電子分析天平，德國賽多利斯公司；TC-15型套式恒溫器，海寧新華醫(yī)療器械廠。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照溶液的制備

取柚皮苷對(duì)照品、橙皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品適量，分別置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別得2.520 mg·mL-1柚皮苷對(duì)照溶液、1.700 mg·mL-1橙皮苷對(duì)照溶液、1.545 mg·mL-1新橙皮苷對(duì)照溶液。分別精密量取上述對(duì)照溶液各2 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照溶液1。

取柴胡皂苷a對(duì)照品、柴胡皂苷b2對(duì)照品適量，分別置于容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別得1.552 mg·mL-1柴胡皂苷a對(duì)照溶液、1.516 mg·mL-1柴胡皂苷b2對(duì)照溶液。分別精密量取上述對(duì)照溶液各1 mL，置于10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照溶液2。

1.2.2 醋陳皮飲片的制備[6]

取陳皮飲片適量，按0.15 kg·kg-1加入米醋，拌勻，置于有蓋容器中悶透，文火加熱，炒至陳皮飲片內(nèi)表面微黃色，取出晾涼，即得醋陳皮飲片。

1.2.3 疏肝理脾方水煎液的制備

取柴胡飲片、醋陳皮飲片、麩炒枳殼飲片，粉碎，過4號(hào)篩；稱取3.00 g柴胡飲片粉末、3.00 g醋陳皮飲片粉末、2.25 g麩炒枳殼飲片粉末，置于250 mL回流瓶中，加水100 mL，浸泡15 min，加熱回流30 min，過濾；濾液移至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得疏肝理脾方水煎液。

1.2.4 柴胡單煎液的制備

稱取柴胡飲片粉末(過4號(hào)篩)3.00 g，置于250 mL回流瓶中，加水 100 mL，浸泡15 min，加熱回流30 min，過濾；濾液移至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得柴胡單煎液。

1.2.5 陳皮枳殼合煎液的制備

分別稱取醋陳皮飲片粉末(過4號(hào)篩)3.00 g、麩炒枳殼飲片粉末(過4號(hào)篩)2.25 g，置于250 mL回流瓶中，加水 100 mL，浸泡15 min，加熱回流30 min，過濾；濾液移至100 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，即得陳皮枳殼合煎液。

1.2.6 供試溶液的制備

分別精密量取上述水煎液各25 mL，上樣至預(yù)處理好的D101大孔樹脂柱(濕法裝柱，高15 cm，內(nèi)徑1.5 cm)，先用200 mL 水沖洗，棄去水洗液；再用200 mL 55%乙醇洗脫，最后用200 mL 95%乙醇洗脫，分別收集，水浴蒸干，加甲醇使殘?jiān)芙?，分別轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶、1 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣前過0.22 μm微孔濾膜。

1.2.7 色譜條件

Phenomenex Kinetex C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以乙腈(B)-水(A)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)，氮?dú)饬魉?.0 mL·min-1。洗脫梯度1:0～15 min，10%～20%B；15～24 min，20%～24%B；24～25 min，24%～10%B；洗脫梯度2:0～20 min，38%～40%B；20～30 min，40%～50%B；30～31 min，50%～38%B。

2 結(jié)果與討論

2.1 指紋圖譜的建立和分析

2.1.1 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脫部位和95%乙醇洗脫部位，分別按洗脫梯度1、洗脫梯度2的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，采集色譜峰數(shù)據(jù)，計(jì)算相似度。結(jié)果表明，RSD均小于2%，表明儀器的精密度良好。

2.1.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取同一份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脫部位和95%乙醇洗脫部位，分別按洗脫梯度1、洗脫梯度2的色譜條件每隔2 h進(jìn)樣，采集色譜峰數(shù)據(jù)，計(jì)算相似度，考察12 h內(nèi)的穩(wěn)定性。結(jié)果表明，RSD均小于2%，表明供試溶液室溫放置12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

平行制備6份疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脫部位和95%乙醇洗脫部位，分別按洗脫梯度1、洗脫梯度2的色譜條件進(jìn)樣，采集色譜峰數(shù)據(jù)，計(jì)算相似度。結(jié)果表明，RSD均小于3%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.1.4 指紋圖譜的建立

分別制備疏肝理脾方水煎液、柴胡單煎液、陳皮枳殼合煎液各10份，并按1.2.6方法分別制得55%乙醇洗脫部位和95%乙醇洗脫部位的供試溶液，分別按洗脫梯度1、洗脫梯度2的色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖。將色譜圖導(dǎo)入“中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”(2012版)軟件，計(jì)算各批次間的相似度，均大于0.9，并得到共有模式圖，見圖1。

a陳皮枳殼合煎液55%乙醇洗脫部位 b.陳皮枳殼合煎液95%乙醇洗脫部位 c.柴胡單煎液95%乙醇洗脫部位

2.1.5 共有峰的確定與色譜峰歸屬分析

對(duì)指紋圖譜中峰面積占總峰面積比例>1%的色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，共指認(rèn)26個(gè)共有峰，柴胡單煎液的95%乙醇洗脫部位共有指紋峰10個(gè)，陳皮枳殼合煎液的55%乙醇洗脫部位共有指紋峰4個(gè)、95%乙醇洗脫部位共有指紋峰19個(gè)，疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脫部位共有指紋峰4個(gè)、95%乙醇洗脫部位共有指紋峰23個(gè)。通過與對(duì)照溶液比較，確認(rèn)2號(hào)峰為柚皮苷(tR=20.23 min)，3號(hào)峰為橙皮苷(tR=21.06 min)，4號(hào)峰為新橙皮苷(tR=22.45 min)，12號(hào)峰為柴胡皂苷a(tR=18.74 min)，14號(hào)峰為柴胡皂苷b2(tR=19.19 min)。

將疏肝理脾方水煎液的指紋圖譜分別與陳皮枳殼合煎液、柴胡單煎液的指紋圖譜進(jìn)行對(duì)比，可以看出：疏肝理脾方水煎液的55%乙醇洗脫部位4個(gè)色譜峰均來自陳皮、枳殼，依次為蕓香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷，柴胡單煎液在此部位沒有檢出成分。疏肝理脾方水煎液的95%乙醇洗脫部位有5個(gè)色譜峰來自于柴胡，分別為8號(hào)峰、12號(hào)峰、14號(hào)峰、17號(hào)峰和18號(hào)峰；有15個(gè)色譜峰來自于陳皮、枳殼；另外，還有3個(gè)色譜峰為3種水煎液共有，說明三藥配伍后沒有生成新的化學(xué)物質(zhì)。相反，有3個(gè)化學(xué)成分在配伍后檢測不到，分別是柴胡單煎液中23號(hào)峰、24號(hào)峰，陳皮枳殼合煎液中的15號(hào)峰。疏肝理脾方化學(xué)成分的歸屬見表1。

2.2 樣品中化學(xué)成分的含量測定

2.2.1 線性關(guān)系考察

精密吸取1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL混合對(duì)照溶液1，按洗脫梯度1的色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果見圖2a。精密吸取1 μL、2 μL、5 μL、8 μL、10 μL、12 μL混合對(duì)照溶液2，按洗脫梯度2的色譜條件分別進(jìn)樣，結(jié)果見圖2b。以峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣質(zhì)量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的回歸方程，分別為y=1.3384x+5.27887(R2=0.9973)、y=1.4778x+5.127(R2=0.9968)、y=1.4438x+5.2354(R2=0.9960)，線性范圍依次為0.504～10.08 μg、0.34～6.8 μg、0.309～6.18 μg。得到柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的回歸方程，分別為y=1.4207x+4.6519(R2=0.9975)、y=1.5649x+4.8164(R2=0.9978)，線性范圍依次為0.1552～1.8624 μg、0.1516～1.8192 μg。

表1疏肝理析

Tab.1 Comparative analysis of fingerprints before and after compatibility of Shugan Lipi formula

圖2 混合對(duì)照溶液1(a)和混合對(duì)照溶液2(b)的HPLC圖譜Fig.2 HPLC spectra of mixed control solution 1(a) and mixed control solution 2(b)

2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取混合對(duì)照溶液，按1.2.7項(xiàng)下色譜條件梯度洗脫，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的峰面積的RSD分別為2%、1%、1%、2%、2%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

按1.2.6方法制備供試溶液，每隔2 h進(jìn)樣，記錄峰面積，考察12 h內(nèi)的穩(wěn)定性。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的峰面積的RSD分別為2%、2%、1%、2%、2%，表明供試溶液中待測成分常溫下放置12 h穩(wěn)定。

2.2.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按1.2.6方法平行制備6批供試溶液，按1.2.7項(xiàng)下色譜條件梯度洗脫，進(jìn)樣，記錄峰面積。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的平均含量分別為 888.5 μg·mL-1、504.0 μg·mL-1、562.0 μg·mL-1、7.3 μg·mL-1、4.5 μg·mL-1，RSD分別為3%、3%、2%、4%、5%，表示該方法重復(fù)性良好。

2.2.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)

精密量取水煎液10 mL，按100%比例加入對(duì)照品，按1.2.6方法平行制備6批供試溶液，按1.2.7項(xiàng)下色譜條件梯度洗脫，進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，回收率分別為：柚皮苷95.6%(RSD=1%)，橙皮苷99.1%(RSD=3%)，新橙皮苷96.6%(RSD=1%)，柴胡皂苷a 97.8%(RSD=3%)，柴胡皂苷b298.6%(RSD=3%)。

2.2.6 樣品測定

分別制備疏肝理脾方水煎液、柴胡單煎液、陳皮枳殼合煎液各10份，經(jīng)大孔樹脂凈化得55%乙醇洗脫部位和95%乙醇洗脫部位，按1.2.7項(xiàng)下色譜條件梯度洗脫，分別進(jìn)樣10 μL、20 μL，記錄峰面積，運(yùn)用外標(biāo)兩點(diǎn)法計(jì)算化學(xué)成分含量，見表2。

表2 樣品中5個(gè)化學(xué)成分的含量測定/(μg·mL-1，n=10)

Tab.2 Content determination of five chemical components in samples/(μg·mL-1，n=10)

2.3 討論

本科研團(tuán)隊(duì)前期采用HPLC-UVD法建立了柴胡疏肝散的指紋圖譜[7]，但因紫外檢測器只識(shí)別有特征紫外吸收的化學(xué)成分，具有局限性，因此，本研究采用蒸發(fā)光散射檢測器建立疏肝理脾方的全成分化學(xué)指紋圖譜。另外，因?yàn)殛惼?、枳殼均主要含黃酮類成分，并且含量遠(yuǎn)高于柴胡中的柴胡皂苷類，受檢測器滿量程的限制，只能把疏肝理脾方中成分分成兩個(gè)洗脫部位分別檢測，55%乙醇洗脫部位主要為含量較高的黃酮類，95%乙醇洗脫部位主要為柴胡皂苷類及黃酮苷元，均是含量較低的組分。

原方中陳皮為醋制，陳皮本身化痰止咳，醋炒后疏肝行氣。枳殼為麩炒，后者的炮制方法在《中國藥典》有詳細(xì)的記載，但是陳皮的醋制只在《博濟(jì)》中曾有過記載，推測因其藥性與青皮對(duì)比較為緩和，在現(xiàn)代的炮制方法中只對(duì)青皮醋制做了記載，所以陳皮的炮制方法并無確定的方案，經(jīng)咨詢廣州中醫(yī)藥大學(xué)炮制教研室的陳康教授后，決定采用2015年版《中國藥典》中的醋炙方法制備醋陳皮飲片。

三藥配伍后的HPLC圖譜共有23個(gè)峰，其中5個(gè)峰來自于柴胡，15個(gè)峰來自于陳皮、枳殼合煎，3個(gè)峰為三者所共有，在三藥配伍后并沒有出現(xiàn)新的色譜峰，說明在三藥配伍后并沒有產(chǎn)生新的化學(xué)成分。柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷三者含量均在三藥配伍后減少，而柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的含量均在配伍后增加，說明柴胡配伍陳皮、枳殼后會(huì)使柴胡皂苷a和b2溶出率增加。那么疏肝理脾方的整體藥效要比單煎液要好是否與柴胡皂苷的溶出率升高有關(guān)還有待更深入的研究。

3 結(jié)論

采用HPLC-ELSD研究疏肝藥柴胡與理脾藥陳皮、枳殼配伍前后主要化學(xué)成分的變化。色譜條件為：Phenomenex KinetexC18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm) ，柱溫30 ℃；以乙腈(B)-水(A)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0 mL·min-1；蒸發(fā)光散射檢測器，氮?dú)饬魉?.0 mL·min-1。所有樣品溶液經(jīng)大孔樹脂凈化處理，得55%乙醇洗脫部位和95%乙醇洗脫部位。對(duì)供試溶液分別建立指紋圖譜，并測定其中柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2的含量。結(jié)果表明，指紋圖譜中共指認(rèn)26個(gè)色譜峰，三藥配伍后沒有新的化學(xué)成分生成，但柚皮苷、新橙皮苷、橙皮苷的含量減少，柴胡皂苷a、柴胡皂苷b2含量顯著升高。本研究建立了疏肝理脾方的HPLC-ELSD全成分指紋圖譜，可以用于方中多個(gè)指標(biāo)成分的同時(shí)測定。