扁桃斑鳩菊抗乳腺癌活性部位篩選研究

姚蘇芝，趙亮 ，鐘永紅，羅秋蓮，莫靜 ，王怡媛，林翠梧，王立升，羅軒*

(1.廣西大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.第二軍醫(yī)大學(xué) 東方肝膽外科醫(yī)院，上海 200438)

0 引言

扁桃斑鳩菊(Vernoniaamygdalina)，因其本身帶有苦味又被稱為“苦葉”[1-2]，是菊科(Compositae)植物中的一種，為多年生灌木，高度可達(dá)10 m以上，樹(shù)干直徑約40 cm[3]。扁桃斑鳩菊不僅廣泛分布在非洲地區(qū)，亞洲地區(qū)也有發(fā)現(xiàn)，在新加坡和馬來(lái)西亞尤其常見(jiàn)，在喀麥隆、加納和尼日利亞等許多西非國(guó)家，扁桃斑鳩菊的莖和根被當(dāng)作咀嚼棒，而葉子則成為當(dāng)?shù)匾环N可食用的葉類蔬菜，是一種藥食兩用植物[4-6]。因其具有重要的藥用價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)發(fā)展?jié)摿?，我?guó)南方部分地區(qū)有專業(yè)種植戶進(jìn)行種植[7]。至今，有多種活性物質(zhì)從扁桃斑鳩菊中分離得到，如具有抗氧化性的黃酮類[8],具有細(xì)胞毒性的倍半萜內(nèi)酯[9-10],具有抗炎作用的甾體皂苷等[11]。

研究表明，扁桃斑鳩菊葉子的提取物具有多種生物活性，其水提取物具有抗氧化活性[12]，丙酮提取物具有驅(qū)蟲(chóng)作用[13]，醇提取物具有抗菌活性[14]。另外，有文獻(xiàn)報(bào)道，扁桃斑鳩菊葉子乙醇提取物和氯仿提取物對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖具有一定的抑制效果[6,15]。在我國(guó)以及全世界范圍內(nèi)，乳腺癌仍然是導(dǎo)致死亡的主要原因之一，因此，對(duì)扁桃斑鳩菊提取物的抗乳腺癌有效成分進(jìn)行研究具有重要意義。到目前為止，對(duì)扁桃斑鳩菊中確切的抗乳腺癌活性成分的研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本文通過(guò)CCK-8法細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)扁桃斑鳩菊葉子不同極性部位提取物對(duì)人乳腺癌細(xì)胞MCF-7的抑制效果，并篩選出抗乳腺癌活性最佳的活性部位，為以后進(jìn)一步探討扁桃斑鳩菊抗乳腺癌活性成分提供方向。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

材料：扁桃斑鳩菊葉子采摘于廣東省廣州市；人乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)，生產(chǎn)廠家為南京科佰生物科技有限公司；硅膠板和硅膠，生產(chǎn)廠家為青島海洋化工股份有限公司。

試劑：石油醚(60～90 ℃)、無(wú)水乙醇、乙酸乙酯等，以上實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純，生產(chǎn)廠家為西隴化工股份有限公司；培養(yǎng)基和PBS，生產(chǎn)廠家為美國(guó)Gibco公司，CCK-8，生產(chǎn)廠家為日本同仁化學(xué)研究所。

1.2 儀器

RE-5299型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，生產(chǎn)廠家為鞏義市予華儀器有限公司；MK3型酶標(biāo)儀和3111型二氧化碳培養(yǎng)箱，生產(chǎn)廠家為美國(guó)Thermo公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 扁桃斑鳩菊不同提取方法

將曬干的扁桃斑鳩菊葉子處理為粉末狀，選擇極性不同的溶劑和不同提取溫度，設(shè)計(jì)了三種提取路線，最終得到各部位提取物。

路線一：200 g扁桃斑鳩菊粉末，先用600 mL石油醚在室溫下提取120 min，重復(fù)3次，提取后抽濾，濾渣放置于通風(fēng)櫥中揮去溶劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得石油醚提取物(VA1)；濾渣用600 mL乙酸乙酯在室溫下提取120 min，重復(fù)3次，提取后抽濾，濾渣放置于通風(fēng)櫥中揮去溶劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得乙酸乙酯提取物(VA2)；最后用85 %乙醇在室溫下提取濾渣120 min，重復(fù)3次，提取后抽濾，棄去濾渣，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得乙醇提取物(VA3)。

路線二：200 g扁桃斑鳩菊粉末，先用600 mL石油醚在50 ℃下提取120 min，重復(fù)3次，提取后抽濾，濾渣放置于通風(fēng)櫥中揮去溶劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得石油醚提取物(VA4)；濾渣用600 mL乙酸乙酯在50 ℃下提取120 min，重復(fù)3次，提取后抽濾，濾渣放置于通風(fēng)櫥中揮去溶劑，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得乙酸乙酯提取物(VA5)；最后用85 %乙醇在65 ℃下提取濾渣120 min，重復(fù)3次，提取后抽濾，棄去濾渣，濾液經(jīng)減壓蒸餾獲得乙醇提取物(VA6)。

路線三：200 g扁桃斑鳩菊粉末，用600 mL的85 %乙醇提取，提取120 min，重復(fù)3次，提取后抽濾，棄去濾渣，合并濾液，濾液經(jīng)減壓蒸餾至提取物無(wú)醇味，得到乙醇部位提取物(VA7)。VA7用水分散為懸濁液，加入石油醚進(jìn)行萃取，萃取至萃取液減壓濃縮后基本無(wú)固狀物；懸濁液再加入乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取，減壓蒸餾萃取液獲得醇提乙酸乙酯提取物(VA8)。

三種提取路線得到的各個(gè)部位的提取物，各取適量用于MCF-7乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 乙酸乙酯部位提取物粗分

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，50 ℃下提取的乙酸乙酯部位提取物具有最好的抗乳腺癌活性，確立了路線二為最佳提取方法，將20 Kg曬干的扁桃斑鳩菊葉子粉碎，按照路線二進(jìn)行提取，得到約450 g乙酸乙酯提取物(A1)。分別用不同的溶劑體積對(duì)A1進(jìn)行薄層層析分析，結(jié)果顯示乙酸乙酯-石油醚溶劑體系具有較好的分離效果，使用該體系對(duì)A1洗脫分離。A1溶解后，加入600 g柱層析硅膠攪拌均勻，吸附完全后減壓蒸餾除去溶劑得到拌樣硅膠，拌樣硅膠依次用石油醚、10 %乙酸乙酯-石油醚、20 %乙酸乙酯-石油醚、50 %乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯和30 %甲醇-乙酸乙酯洗脫，洗脫液減壓濃縮后對(duì)應(yīng)獲得6個(gè)洗脫產(chǎn)物A2、A3、A4、A5、A6和A7。對(duì)此6個(gè)洗脫產(chǎn)物以及A1進(jìn)行體外抗乳腺癌活性實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

對(duì)MCF-7細(xì)胞進(jìn)行傳代培育，培育2～3代后，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞調(diào)制為懸液(5 ×104個(gè)·mL-1)，在96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液(5 000個(gè)細(xì)胞·孔)，邊緣孔用PBS 100 μL填充，同時(shí)設(shè)置不加待測(cè)試液的陰性對(duì)照孔(吸光值記為OD1)以及不加細(xì)胞的空白對(duì)照孔(吸光值記為OD0)，將培養(yǎng)板放在5 % CO2、37 ℃恒溫箱中孵育24 h，取出加入試液，每孔加入100 μL不同濃度(10、20、50和100 μg/mL)的試液(吸光值記為OD)，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，將培養(yǎng)板放在5 % CO2，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)48 h。取出培養(yǎng)板，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入PBS100 μL清洗后棄去，然后每孔加入100 μL培養(yǎng)基，再加入10 μL CCK-8溶液，放在5 % CO2，37 ℃培養(yǎng)箱中2 h后取出，培養(yǎng)板微微震蕩后置于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上，測(cè)量其在450 nm處的吸光值。試液的抑制率公式為

抑制率( %) = 1-(OD-OD0)/( OD1-OD0) ×100 %。

(1)

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與討論

2.1 扁桃斑鳩菊各個(gè)部位提取物體外抗乳腺癌活性

扁桃斑鳩菊各提取物加入CCK-8試劑后培養(yǎng)2 h測(cè)定其體外抗乳腺癌活性，活性結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，各部位提取物對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制效果基本隨著濃度升高而加強(qiáng)，呈劑量依賴性。VA2、VA5、VA7和VA8在濃度為50 μg/mL時(shí)，對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率均達(dá)到了80 %以上，體外抗乳腺活性較好。VA3、VA5和VA7在濃度為50 μg/mL時(shí)，體外抗乳腺癌活性差異較為明顯。其中VA7對(duì)乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖表現(xiàn)出良好的抑制效果，其抑制率為82.68 %，VA3和VA6對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制率則均低于25 %，基本不具有抗乳腺癌活性，以上表明了扁桃斑鳩菊中的抗乳腺癌活性部位為乙酸乙酯部位。

表1 扁桃斑鳩菊各個(gè)部位提取物體外抗乳腺癌活性Tab.1 In vitro anti-breast cancer activity of extracts from Vernonia amygdalina

2.2 乙酸乙酯提取物及其粗分各段提取物體外抗乳腺癌活性

乙酸乙酯提取物A1及其洗脫產(chǎn)物A2-A7加入CCK-8試劑后培養(yǎng)2 h測(cè)定其體外抗乳腺癌活性，活性結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，A1-A7對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用基本隨著濃度升高而加強(qiáng)，呈劑量依賴性。使用石油醚、10 %乙酸乙酯-石油醚和20 %乙酸乙酯-石油醚3種低極性洗脫劑得到的組分A2、A3和A4對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞增殖的抑制效果一般；濃度為100 μg/mL時(shí)，使用50 %乙酸乙酯-石油醚、乙酸乙酯和30 %甲醇-乙酸乙酯3種中強(qiáng)極性溶劑得到的洗脫產(chǎn)物A5、A6和A7，對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖均具有較好抑制作用，且抑制效果均優(yōu)于A1，特別是A5在濃度為100 μg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到了80 %以上，由此可知，A5、A6和A7三個(gè)洗脫產(chǎn)物為乙酸乙酯提取物中的抗乳腺癌活性段，可做進(jìn)一步分離純化。

表2 乙酸乙酯提取物及其粗分各段提取物體外抗乳腺癌活性Tab.2 In vitro anti-breast cancer activity of ethyl acetate extracts and its subfractions

3 結(jié)語(yǔ)

本研究結(jié)果顯示扁桃斑鳩菊的中等極性部位，即乙酸乙酯部位，對(duì) MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖具有較為明顯的抑制作用。而對(duì)該部位進(jìn)行粗分后的活性追蹤表明A5、A6和A7這三個(gè)洗脫產(chǎn)物具有較好的抗乳腺癌活性，其中活性最強(qiáng)的組分為A5。對(duì)此三個(gè)活性段，特別是A5，可做進(jìn)一步的分離純化，明確扁桃斑鳩菊中抗乳腺癌的有效成分。扁桃斑鳩菊中等極性溶劑的提取物主要含有倍半萜內(nèi)酯等物質(zhì)，且倍半萜內(nèi)酯具有一定的細(xì)胞毒活性。本文推測(cè)，扁桃斑鳩菊提取物中抗乳腺癌活性成分可能是倍半萜內(nèi)酯類成分。本研究為后期研究扁桃斑鳩菊中單個(gè)或者一系列具有抗乳腺癌活性的單體化合物奠定了基礎(chǔ)。